Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نعرض إجراءات ضربة قاضية FAM83A ؛ المقايسات للكشف عن آثاره على انتشار خلايا سرطان عنق الرحم وهجرتها وغزوها ؛ وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. توفر هذه الدراسة جينا مستهدفا واعدا لسرطان عنق الرحم ومرجعا لمزيد من أبحاث الأدوية.

Abstract

يحمل استكشاف الجينات المستهدفة للورم أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. في هذه الدراسة ، نوضح الخطوات المتضمنة في تحديد الجين المستهدف للورم FAM83A في سرطان عنق الرحم. أولا ، تم استخدام مجموعة بيانات أطلس جينوم السرطان للتحقق من صحة التعبير والأهمية النذير ل FAM83A لدى النساء. تم استخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لضربة قاضية لجين FAM83A في خلايا HeLa و C33a . بعد ذلك ، تم إجراء تلطيخ 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) لتحديد التأثيرات على قدرات تكاثر الخلايا السرطانية. تم إجراء التئام الجروح وفحوصات إدخال الغشاء المسامي لتقييم هجرة الخلايا السرطانية وقدرات الغزو.

تم استخدام النشاف الغربي لتحديد مستويات البروتين المرتبطة بموت الخلايا المبرمج. تم استخدام تلطيخ JC-1 لتقييم تغيرات وظيفة الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، تم استخدام تدخل سيسبلاتين (ديامينيدي كلوروبلاتين ، DDP) لتقييم الإمكانات العلاجية للجين المستهدف. تم إجراء قياس التدفق الخلوي وفحوصات تكوين المستعمرات لمزيد من التحقق من صحة الخصائص المضادة للسرطان للجين. نتيجة لذلك ، تبين أن ضربة قاضية FAM83A تمنع انتشار وهجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. تتحقق هذه المنهجيات الشاملة بشكل جماعي من صحة FAM83A كجين مستهدف مرتبط بالورم ، مما يبشر بالخير كهدف علاجي محتمل في الوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه.

Introduction

يعد سرطان عنق الرحم مصدر قلق عالمي لأنه أحد الأنواع الرائدة في الأورام الخبيثة النسائية في جميع أنحاء العالم وهو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لدى النساء1. ترتبط الجراحة الجذرية والعلاج الكيميائي الإشعاعي بمعدلات شفاء عالية في المرحلة الأولية. ومع ذلك ، فإن نتائج العلاج للمرضى في المرحلة المتقدمة من سرطان عنق الرحم الذين يصابون بمرض نقيلي غير مواتية للغاية2. لذلك ، من الأهمية بمكان زيادة فهم الآليات البيولوجية الكامنة وراء هجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة للوقاية من هذا المرض وعلاجه.

إن تحديد الجينات المستهدفة المشاركة في تطور السرطان وإيجاد طرق لتثبيط تعبيرها أو عملها يمثل خيارات علاجية واعدة. في هذه الدراسة ، حددنا FAM83 كجين مسبب للسرطان وحققنا في آثاره المثبطة على خلايا C33a و HeLa. تم الإبلاغ عن الجينات المسرطنة لعائلة FAM83 (FAM83A-H) على نطاق واسع في السرطانات البشرية 3,4. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن أن FAM83A يتم تنظيمه في سرطان الرئة5 والثدي6 والمبيض7 والبنكرياس8 ، مما يشير إلى أن FAM83A يلعب دورا مهما في تطور السرطان من خلال تعزيز الانتشار والغزو والسمات الشبيهة بالخلايا الجذعية ومقاومة الأدوية في الخلايا السرطانية. الأهم من ذلك ، تم تحديد FAM83A كواحد من الجينات المرشحة الجديدة المرتبطة بتطور آفة عنق الرحم والتسرطن9. على الرغم من تأكيد ارتفاع تعبير FAM83A في خلايا سرطان عنق الرحم البشرية ، إلا أن التأثير المحدد والآليات الأساسية ل FAM83A في سرطان عنق الرحم لا تزال غير واضحة.

في هذه الدراسة ، نحدد البروتوكولات المشاركة في تحديد FAM83A كجين مستهدف للورم في سرطان عنق الرحم واستخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لضربة قاضية لجين FAM83A في خلايا HeLa و C33a . تم إجراء تلطيخ 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) لتحديد التأثيرات على تكاثر الخلايا السرطانية ، بينما ساعد التئام الجروح وفحوصات إدخال الغشاء المسامي في تقييم هجرة الخلايا السرطانية وقدرات الغزو.

تم إجراء النشاف الغربي لتحديد مستويات البروتينات المرتبطة بموت الخلايا المبرمج ، وتم استخدام تلطيخ JC-1 لتقييم تغيرات وظيفة الميتوكوندريا. وهكذا ، أبلغنا أن FAM83A يلعب دورا مهما في تكاثر الخلايا ، ورم خبيث ، وغزو في سرطان عنق الرحم. من خلال خلل الميتوكوندريا المرتبط بمسار PI3K / AKT وموت الخلايا المبرمج ، قامت FAM83A بالضربة القاضية بتوعية خلايا سرطان عنق الرحم بالسيسبلاتين (ديامينيدي كلوروبلاتين ، DDP). توفر هذه الدراسة هدفا جديدا لسرطان عنق الرحم وربما سرطانات أخرى ومرجعا لتطوير استراتيجيات للتغلب على مقاومة الخلايا السرطانية لبعض أدوية العلاج الكيميائي.

Protocol

وكانت الدراسة متوافقة تماما مع المبادئ التوجيهية للنشر التي قدمتها اللجنة (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحليل مصدر البيانات والمعلوماتية الحيوية

  1. احصل على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) للتحليل العنقودي. استخدم GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) ، وهي أداة قائمة على الويب لإعادة حساب بيانات RNA-Seq الخام للعينات من مشاريع TCGA ، لفحص أهداف أدوية السرطان المرشحة باستخدام خط أنابيب معالجة قياسي.
    ملاحظة: موقع GEPIA متاح مجانا لجميع المستخدمين.
  2. قم بالوصول إلى الصفحة الرئيسية لموقع GEPIA وانقر فوق تحليل نوع السرطان ، وحدد خيار تحليل الجينات التفاضلية ، وقم بتعيين المعلمات التالية: اسم السرطان = CESE (يعرف بأنه سرطان الخلايا الحرشفية العنقية وسرطان غدي باطن عنق الرحم على صفحة الويب هذه) ، |لوج 2 إف سي | القطع = 1 ، قطع قيمة q = 0.01 ، الطرق التفاضلية = ANOVA ، وتوزيع الكروموسومات = كلاهما. ثم ، انقر فوق قائمة للحصول على قائمة الجينات التي تظهر التعبير التفاضلي بين الورم والمجموعات الطبيعية.
    ملاحظة: يتطلب مراجعة شاملة للأدبيات لتحديد الجينات المرشحة المعبر عنها بشكل تفاضلي. في هذه الدراسة ، بالنظر إلى الخلفية من الأدبيات المتاحة ، نركز على جين الورم محل الاهتمام ، FAM83A.
  3. بعد ذلك ، افحص تعبير FAM83A في سرطان عنق الرحم والأنسجة الطبيعية باستخدام GEPIA من خلال المتابعة إلى خيار التعبير DIY على موقع الويب وحدد Boxplot كنوع المخطط. أدخل FAM83A في حقل معلمة الجينات وقم بتعيين المعلمات التالية: |لوج 2 إف سي | قيمة القطع = 1 ؛ قطع قيمة q = 0.01. حدد CESE كاسم السرطان ومطابقة بيانات TCGA العادية لحقل البيانات العادية المتطابقة ، مع ترك جميع الإعدادات الأخرى في وضعها الافتراضي. انقر فوق Plot واسمح لموقع الويب بإنشاء boxplot يمثل التعبير التفاضلي للجين FAM83A ؛ احفظ مخطط الصندوق للرجوع إليه وتحليله في المستقبل.
  4. أخيرا ، قم بتحليل البقاء على قيد الحياة بشكل عام للمرضى الذين يحملون أوراما بمستويات مختلفة من تعبير FAM83A في سرطان عنق الرحم. انتقل إلى خيار مؤامرات البقاء على قيد الحياة على موقع الويب ، واضبط الجين على FAM83A ، وحدد البقاء على قيد الحياة بشكل عام كنوع التحليل. أضف اسم الورم CESE ، واختر الأشهر لوحدات المحور ، واترك جميع المعلمات الأخرى في إعداداتها الافتراضية. انقر فوق رسم ودع موقع الويب ينشئ مخطط منحنى البقاء على قيد الحياة ؛ احفظ هذا المخطط للرجوع إليه وتحليله في المستقبل.
  5. ضع في اعتبارك كلا من التعبير التفاضلي ل FAM83A في الأورام وارتباطه بتحليل بقاء المريض لتحديد FAM83A كجين مستهدف علاجي محتمل في سرطان عنق الرحم.

2. التجارب القائمة على الخلايا

  1. زراعة الخلايا
    1. زراعة خطوط الخلايا السرطانية البشرية في الوسط المعدل عند 37 درجة مئوية في جو CO2 مرطب بنسبة 5٪.
      ملاحظة: ارجع إلى جدول المواد للحصول على معلومات خط الخلية ومكونات وسيط الثقافة.
  2. نقل الخلايا
    1. استخدم siRNA لهدم تعبير FAM83A في الخلايا.
      ملاحظة: انظر الجدول 1 للاطلاع على تسلسل siRNA المحدد.
    2. خلايا البذور في ألواح 6 آبار وتحتضن بمزيج من 50 نانومتر si-FAM83A أو siRNA-NC و 8 ميكرولتر من عامل النقل أو 8 ميكرولتر فقط من عامل النقل لمدة 4-6 ساعات بعد تحقيق التقاء 50٪ -70٪. أضف فقط DMEM الخالي من المصل إلى عنصر التحكم السلبي.
    3. بعد الحضانة ، استبدل الوسط الذي يحتوي على عامل النقل ب DMEM + 10٪ مصل عجل الجنين. علاوة على ذلك ، بعد 48 ساعة من النقل ، تعامل مع 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP) لمدة 24 ساعة على النحو المنشود واحصد جميع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي الكلي وتحليل qRT-PCR.

3. كشف EdU لمقايسة تكاثر الخلايا

ملاحظة: استخدم مجموعة تكاثر خلايا EdU لتقييم تكاثر الخلايا في المختبر وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

  1. بذر الخلايا في ألواح 6 آبار واحتضانها بمحلول 10 ميكرومتر EdU لمدة 2 ساعة. قم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهايد لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) وتخلل مع 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 10 دقائق في RT.
  2. قم بإزالة المخزن المؤقت للنفاذية وأضف 500 ميكرولتر من محلول تفاعل 1x. ثم احتضان لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام للتلطيخ النووي.
  3. قم بتلطيخ الخلايا باستخدام 4 '، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) وتصورها تحت مجهر مضان بتكبير 200x. قم بتلطيخ نوى الخلايا المتكاثرة باستخدام EdU وافحصها بحثا عن مضان أحمر.
  4. أخيرا ، استخدم برنامجا لتحديد النتائج عن طريق حساب 10 حقول عشوائية على الأقل وحساب معدلات الانتشار باستخدام نسبة الخلايا الإيجابية الفلورية إلى إجمالي الخلايا.

4. فحص التئام الجروح

  1. خلايا البذور في 6 لوحات الآبار بكثافة 2 × 105 خلايا لكل بئر.
  2. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 90٪ ، استخدم طرف ماصة معقم سعة 10 ميكرولتر لإنشاء خدش خطي برفق في الطبقة الأحادية للخلية. اشطف الآبار برفق باستخدام برنامج تلفزيوني معقم لإزالة أي خلايا منفصلة وحطام ناتج عن الخدش.
  3. علاوة على ذلك ، احتضان الخلايا في وسط يحتوي على 1 ٪ FBS. بعد ذلك ، راقب والتقط صورا باستخدام المجهر المقلوب لشفاء المنطقة المصابة في 12 و 24 و 48 ساعة.

5. فحص إدراج الغشاء المسامي

  1. تحضير معلق الخلية في وسط زراعة الخلايا عند تركيز الخلية المطلوب (يحتوي على 4 × 104 خلايا) ، بما في ذلك خلايا C33a المنقولة أو الضابطة و HeLa. أضف تعليق الخلية إلى الغرفة العلوية لإدراج الغشاء ، مما يضمن التوزيع المتساوي. أضف وسيطا كاملا إلى الغرفة السفلية.
  2. بعد الحضانة لمدة 24 ساعة ، استخدم كحول الميثيل و 0.1٪ من البنفسج البلوري لتثبيت وتلطيخ الخلايا المهاجرة إلى الغرف السفلية ، على التوالي.
  3. استخدم مجهرا مقلوبا لالتقاط الصور ثم تحليل عدد الخلايا المهاجرة عن طريق حساب 10 حقول عشوائية على الأقل باستخدام ImageJ.
    1. لتحليل الأرقام باستخدام ImageJ ، افتح الصورة في برنامج ImageJ ، وانتقل إلى علامة التبويب Image في قائمة الأدوات ، وحدد ضبط ، ثم انقر فوق العتبة. اضبط إعدادات العتبة، إذا لزم الأمر، حتى تصبح الخلايا فقط مرئية على خلفية بيضاء.
    2. انقر فوق تطبيق في نافذة العتبة لتطبيق هذه الإعدادات على الصورة. الآن ، حدد أداة العصا (التتبع) من شريط الأدوات (الموجود أعلى النافذة).
    3. انقر فوق منطقة الصورة حيث توجد الخلايا لتحديد جميع الخلايا في الصورة ذات العتبة. بعد تمييز الخلايا ، انتقل إلى تحليل في قائمة الأدوات ، ثم انقر فوق تحليل الجسيمات. في نافذة تحليل الجسيمات ، أدخل الحجم المطلوب (على سبيل المثال ، 0 - ما لا نهاية) والقيم الدائرية (على سبيل المثال ، 0.00 - 1.00) وفقا للمتطلبات التجريبية لتضمين جميع الخلايا في العد.
    4. انقر فوق "موافق " وانتظر حتى يقوم البرنامج بحساب الخلايا وظهور نافذة جديدة مع نتائج التحليل.

6. مقايسة تشكيل مستعمرة

  1. البذور 2 × 105 خلايا لكل بئر من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة 6 آبار مع أو بدون معالجة 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP) لمدة 24 ساعة.
  2. بعد فترة 24 ساعة من العلاج الدوائي ، افصل الخلايا باستخدام 0.25٪ من التربسين وأعد تعليقها في وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ FBS. قم بزرع الخلايا المعاد تعليقها في صفيحة من 6 آبار بكثافة 1 × 103 خلايا لكل بئر ، ثم احتضانها في حاضنة CO2 بنسبة 5٪ عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.
  3. بعد الحضانة لمدة ~ 7-10 أيام عندما تكون المستعمرات مرئية ، ثبت الخلايا ب 4٪ Polyoxymethylene وقم بتلطيخها بمحلول تلطيخ Giemsa لمدة 20 دقيقة.
  4. اغسل الخلايا قليلا واترك الألواح تجف في الهواء. التقط صورا لمجموعات المستعمرات بالمجهر واحسب عدد المستعمرات التي تحتوي على أكثر من 50 خلية.

7. تحليل إزالة استقطاب غشاء الميتوكوندريا (MMP) باستخدام صبغة JC-1

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. احتضان مع 1x JC-1 محلول تلطيخ لمدة 15-20 دقيقة تحت 5٪ CO2 عند 37 درجة مئوية باستخدام مجموعة مقايسة غشاء الميتوكوندريا المحتملة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
  3. اغسل الخلايا وافحصها تحت مجهر الفلورسنت عند تكبير 200x باستخدام الأطوال الموجية للإثارة والانبعاث ل JC-1 عند ~ 490 نانومتر و 590 نانومتر ، على التوالي. لتصور مضان JC-1 ، استخدم المرشحات المناسبة ، مثل مرشح الإثارة الأزرق (450-490 نانومتر) ومرشح الانبعاث الأحمر (التمرير الطويل > 590 نانومتر) لالتقاط إشارة التألق المنبعثة بشكل انتقائي.

8. تحليل التدفق الخلوي ل mPTP

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. قم بإزالة وسط الاستزراع من الخلايا ، وأعد تعليق الخلايا في برنامج تلفزيوني ، وأضف 300 ميكرولتر لكل (حجم 1x) من محلول تلطيخ Calcein AM ومحلول عمل التبريد الفلوري لتغطية الخلايا بالتساوي. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة محمية من الضوء لمدة 30-45 دقيقة ، واستبدل الوسط بوسط استزراع مسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في بيئة محمية من الضوء لمدة 30 دقيقة إضافية لضمان التحلل المائي الكامل للكالسيين AM بواسطة استرات داخل الخلايا ، مما يؤدي إلى توليد كالسيين الفلورسنت الأخضر داخل الخلايا.
  3. قم بإزالة وسط الثقافة ، واغسل الخلايا 2-3x باستخدام PBS ، وأضف المخزن المؤقت للكشف. كشف mPTP الخلية باستخدام قياس التدفق الخلوي وطول موجة الإثارة 488 نانومتر.

9. قياس التدفق الخلوي

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. بعد 24 ساعة من العلاج الدوائي ، أعد تعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من محلول عازلة ملزم واخلط بلطف 10 ميكرولتر من Annexin V-FITC و 5 ميكرولتر من يوديد البروبيديوم (PI) في تعليق الخلية. احتضن الخليط لمدة 15 دقيقة مع تجنب الضوء وأضف 300 ميكرولتر من محلول عازلة ملزمة إلى الخلايا. كشف موت الخلايا المبرمج باستخدام قياس التدفق الخلوي بطول موجة إثارة يبلغ 488 نانومتر.

10. تحليل RT-PCR

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا السرطانية باستخدام كاشف استخراج الحمض النووي الريبي وتحويل الحمض النووي الريبي المستخرج إلى الحمض النووي التكميلي (cDNA) مع مزيج تخليق الحمض النووي المكمل عن طريق الحضانة عند 42 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة ثم عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  3. تحضير خليط تفاعل تفاعل PCR الذي يحتوي على بوليميراز الحمض النووي والنيوكليوتيدات والمخزن المؤقت والبادئات المصممة الخاصة بالجينات. أضف قالب cDNA إلى خليط التفاعل لتفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي وقم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل على أداة تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي مع ظروف الدورة الحرارية التالية: تمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، تليها 40 دورة من 95 درجة مئوية لمدة 5 ثوان و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية ، ومرحلة منحنى الانصهار عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية. تحديد مستويات mRNA باستخدام طريقة 2−ΔΔCq باستخدام GAPDH كعنصر تحكم داخلي.
    ملاحظة: يظهر نظام تفاعل RT-PCR في الجدول 1 ، ويظهر تسلسل التمهيدي في الجدول 1.
    1. لحساب قيمة 2−ΔΔCq ، قم بقياس قيم Cq للجين المستهدف والجين المرجعي (GAPDH) في العينات. احسب ΔCq عن طريق طرح قيمة Cq للجين المرجعي من قيمة Cq للجين المستهدف لكل عينة. احسب ΔΔCq بطرح ΔCq لعينة تحكم من ΔCq لكل عينة تجريبية. أخيرا ، احسب قيمة 2−ΔΔCq عن طريق رفع 2 إلى قوة قيمة ΔΔCq.
      ملاحظة: تمثل قيمة Cq رقم الدورة الذي تصل عنده إشارة التألق إلى الحد المحدد.

11. تحليل اللطخة الغربية

  1. البذور 1.2 × 106 خلايا سرطانية من مجموعات Si-NC و Si-FAM83A في صفيحة ومزرعة من ستة آبار لمدة 24 ساعة مع أو بدون علاج 5 ميكرومتر سيسبلاتين (DDP).
  2. اجمع الخلايا المستزرعة واغسلها بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) لإزالة أي وسائط نمو متبقية أو مصل. تحلل الخلايا باستخدام RIPA Lysis Buffer الذي يحتوي على فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل (PMSF) لإطلاق البروتينات الخلوية. احتضان الخلايا على الجليد لبضع دقائق لضمان التحلل الكامل والطرد المركزي عند 4 درجات مئوية ، 12000 × جم لمدة 15 دقيقة. جمع طاف لتحديد تركيز البروتين.
  3. حدد تركيز البروتين في الخلية المحللة باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. امزج الخلية المحللة مع مخزن مؤقت للتحميل وقم بتسخين الخليط على حرارة 95-100 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق لتشويه البروتينات وضمان فصل موحد على الجل.
  4. من كل عينة ، قم بتحميل 30 ميكروغرام من البروتين الكلي على هلام SDS-PAGE وقم بتشغيل SDS-PAGE تحت جهد ثابت يبلغ 80 فولت. أوقف الرحلان الكهربائي عندما يصل بروموفينول الأزرق إلى قاع هلام الفصل.
  5. انقل البروتينات المنفصلة من الجل إلى غشاء بولي فينيل ثنائي فلوريد باستخدام نظام نقل رطب في حمام جليدي بتيار 200 مللي أمبير لمدة 1.5 ساعة.
  6. سد الغشاء مع 5٪ حليب منزوع الدسم في محلول ملحي مخزن تريس مع 0.05٪ Tween-20 buffer (TBST) لمدة 1 ساعة في RT واحتضان بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة ذات الصلة الواردة في جدول المواد.
  7. اغسل الغشاء عدة مرات باستخدام TBST واحتضانه بالأجسام المضادة الثانوية (جدول المواد) لمدة 1 ساعة في RT ، متبوعا بالغسيل باستخدام TBST. تصور نطاقات البروتين باستخدام مجموعة اكتشاف التلألؤ الكيميائي المحسنة ونظام التصوير.

12. التحليل الإحصائي

  1. نظرا لأن جميع نقاط البيانات التجريبية ستكون مستقلة ، قدم البيانات كمتوسط ± SD. إجراء التحليل الإحصائي.
  2. استخدم تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) لإجراء مقارنات متعددة واختبار Dunnett لمقارنة كل مجموعة بالمجموعة الضابطة. استخدم اختبار t للطالب (ثنائي الذيل غير المزدوج) لمقارنة مجموعتين ؛ اعتبر P < 0.05 مهما.

النتائج

تحليل قاعدة بيانات TCGA والتحقق من صحة PCR

من تحليل قاعدة بيانات TCGA ، أجرينا تحليلا مقارنا لمستويات تعبير mRNA في 306 عينة من خلايا سرطان عنق الرحم و 13 عينة من الخلايا الطبيعية للتحقيق في التعبير التفاضلي ل FAM83A. تم تنظيم FAM83A في ...

Discussion

يعد التحقيق في الجينات المستهدفة للورم ذا أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. إن فهم الجينات المحددة التي تلعب دورا مهما في تطور سرطان عنق الرحم وتطوره يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الجزيئية الأساسية للمرض. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تحديد هذه الجينات المستهدفة إلى تطوير استرات...

Disclosures

لم يبلغ المؤلفون عن أي تضارب في المصالح في هذا العمل.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل مؤسسة مكتب Jingzhou للعلوم والتكنولوجيا (رقم 2020HC06).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cells and Medium Formulation
C33aAmerican Type Culture Collection
HelaAmerican Type Culture Collection
Modified medium10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT4691, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
Bcl2 26593-1-AP, Proteintech Group, Inc‘1:1,000
Caspase 319677-1-AP, Proteintech Group, Inc‘1:2,000
cleaved-caspase3abs132005; Absin Bioscience Inc.‘1:1,000
Cytc10993-1-AP; Proteintech Group‘1:1,000
GAPDH 10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.‘1:8,000
mTOR2983, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
PI3K4292, Cell Signaling Technology Inc‘1:1,000
p-AKT 4060, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)#5536, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit17366, Cell Signaling Technology Inc.‘1:1,000
Secondary antibodiesGB23303, Servicebio‘1:2,000
Materials
6-well plateCorning, NPY
Alexa Fluor 555Beyotime
BCA Protein assay kit Beyotime, China P0011
ChemiDoc XRS Imager System BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit Servicebio, Inc.,Chinacat. no. G2014
Fluorescence microscope Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix 11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit Beyotime, China
PMSF ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China#ST506
Real-time quantitative PCR instrument Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagentInvitrogen15596026
TRIzol reagent Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro plus 6.0  

References

  1. Arbyn, M., et al. Estimates of incidence and mortality of cervical cancer in 2018: a worldwide analysis. Lancet Global Health. 8 (2), e191-e203 (2020).
  2. Cohen, P. A., Jhingran, A., Oaknin, A., Denny, L. Cervical cancer. Lancet. 393 (10167), 169-182 (2019).
  3. Cipriano, R., et al. Conserved oncogenic behavior of the fam83 family regulates mapk signaling in human cancer. Molecular Cancer Research. 12 (8), 1156-1165 (2014).
  4. Snijders, A. M., et al. FAM83 family oncogenes are broadly involved in human cancers: an integrative multi-omics approach. Molecular Oncology. 11 (2), 167-179 (2017).
  5. Gan, J., Meng, Q., Li, Y. Corrigendum: systematic analysis of expression profiles and prognostic significance for fam83 family in non-small-cell lung cancer. Frontiers In Molecular Biosciences. 8, 653454 (2021).
  6. Jin, Y., et al. Comprehensive analysis of the expression, prognostic significance, and function of fam83 family members in breast cancer. World Journal of Surgical Oncology. 20 (1), 172 (2022).
  7. Lin, S., et al. Identification of prognostic biomarkers among fam83 family genes in human ovarian cancer through bioinformatic analysis and experimental verification. Cancer Management and Research. 13, 8611-8627 (2021).
  8. Ma, Z., et al. Identification of prognostic and therapeutic biomarkers among fam83 family members for pancreatic ductal adenocarcinoma. Disease Markers. 2021, 6682697 (2021).
  9. Xu, J., et al. Genome-wide profiling of cervical RNA-binding proteins identifies human papillomavirus regulation of rnaseh2a expression by viral e7 and e2f1. mBio. 10 (1), e02687-e02618 (2019).
  10. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal Of Experimental & Clinical Cancer Research. 30 (1), 87 (2011).
  11. Bonora, M., Pinton, P. The mitochondrial permeability transition pore and cancer: molecular mechanisms involved in cell death. Frontiers In Oncology. 4, 302 (2014).
  12. Wang, N., Hou, M. S., Zhan, Y., Shen, X. B., Xue, H. Y. MALAT1 promotes cisplatin resistance in cervical cancer by activating the pi3k/akt pathway. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 22 (22), 7653-7659 (2018).
  13. Tsuruta, F., Masuyama, N., Gotoh, Y. The phosphatidylinositol 3-kinase (pi3k)-akt pathway suppresses bax translocation to mitochondria. Journal Of Biological Chemistry. 277 (16), 14040-14047 (2002).
  14. Guerra, F., Arbini, A. A., Moro, L. Mitochondria and cancer chemoresistance. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (8), 686-699 (2017).
  15. Pustylnikov, S., Costabile, F., Beghi, S., Facciabene, A. Targeting mitochondria in cancer: current concepts and immunotherapy approaches. Translational Research. 202, 35-51 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 204 FAM83A DDP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved