ضربة قاضية من FAM83A للتحقق من دورها في نمو خلايا سرطان عنق الرحم وحساسية سيسبلاتين

Summary

هنا ، نعرض إجراءات ضربة قاضية FAM83A ؛ المقايسات للكشف عن آثاره على انتشار خلايا سرطان عنق الرحم وهجرتها وغزوها ؛ وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. توفر هذه الدراسة جينا مستهدفا واعدا لسرطان عنق الرحم ومرجعا لمزيد من أبحاث الأدوية.

Abstract

يحمل استكشاف الجينات المستهدفة للورم أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. في هذه الدراسة ، نوضح الخطوات المتضمنة في تحديد الجين المستهدف للورم FAM83A في سرطان عنق الرحم. أولا ، تم استخدام مجموعة بيانات أطلس جينوم السرطان للتحقق من صحة التعبير والأهمية النذير ل FAM83A لدى النساء. تم استخدام الحمض النووي الريبي الصغير المتداخل (siRNA) لضربة قاضية لجين FAM83A في خلايا HeLa و C33a . بعد ذلك ، تم إجراء تلطيخ 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) لتحديد التأثيرات على قدرات تكاثر الخلايا السرطانية. تم إجراء التئام الجروح وفحوصات إدخال الغشاء المسامي لتقييم هجرة الخلايا السرطانية وقدرات الغزو.

تم استخدام النشاف الغربي لتحديد مستويات البروتين المرتبطة بموت الخلايا المبرمج. تم استخدام تلطيخ JC-1 لتقييم تغيرات وظيفة الميتوكوندريا. علاوة على ذلك ، تم استخدام تدخل سيسبلاتين (ديامينيدي كلوروبلاتين ، DDP) لتقييم الإمكانات العلاجية للجين المستهدف. تم إجراء قياس التدفق الخلوي وفحوصات تكوين المستعمرات لمزيد من التحقق من صحة الخصائص المضادة للسرطان للجين. نتيجة لذلك ، تبين أن ضربة قاضية FAM83A تمنع انتشار وهجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتوعية هذه الخلايا بالسيسبلاتين. تتحقق هذه المنهجيات الشاملة بشكل جماعي من صحة FAM83A كجين مستهدف مرتبط بالورم ، مما يبشر بالخير كهدف علاجي محتمل في الوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه.

Introduction

يعد سرطان عنق الرحم مصدر قلق عالمي لأنه أحد الأنواع الرائدة في الأورام الخبيثة النسائية في جميع أنحاء العالم وهو السبب الرئيسي للوفيات المرتبطة بالسرطان لدى النساء¹. ترتبط الجراحة الجذرية والعلاج الكيميائي الإشعاعي بمعدلات شفاء عالية في المرحلة الأولية. ومع ذلك ، فإن نتائج العلاج للمرضى في المرحلة المتقدمة من سرطان عنق الرحم الذين يصابون بمرض نقيلي غير مواتية للغاية². لذلك ، من الأهمية بمكان زيادة فهم الآليات البيولوجية الكامنة وراء هجرة وغزو خلايا سرطان عنق الرحم وتحديد الأهداف العلاجية المحتملة للوقاية من هذا المرض وعلاجه.

إن تحديد الجينات المستهدفة المشاركة في تطور السرطان وإيجاد طرق لتثبيط....

Protocol

وكانت الدراسة متوافقة تماما مع المبادئ التوجيهية للنشر التي قدمتها اللجنة (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). راجع جدول المواد للحصول على التفاصيل المتعلقة بجميع المواد والكواشف والأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول.

1. تحليل مصدر البيانات والمعلوماتية الحيوية

1. احصل على بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي من قاعدة بيانات أطلس جينوم السرطان (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) للتحليل العنقودي. استخدم GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) ، وهي أداة قائمة على الويب لإعادة حساب بيانات RNA-Seq الخام للعينات من مشاريع TCGA ، لفحص أهداف أدوية السرطان المرشحة باستخدام خط أنابيب معالجة قياسي.
   ....

النتائج

تحليل قاعدة بيانات TCGA والتحقق من صحة PCR

من تحليل قاعدة بيانات TCGA ، أجرينا تحليلا مقارنا لمستويات تعبير mRNA في 306 عينة من خلايا سرطان عنق الرحم و 13 عينة من الخلايا الطبيعية للتحقيق في التعبير التفاضلي ل FAM83A. تم تنظيم FAM83A في .......

Discussion

يعد التحقيق في الجينات المستهدفة للورم ذا أهمية قصوى للوقاية من سرطان عنق الرحم وعلاجه. إن فهم الجينات المحددة التي تلعب دورا مهما في تطور سرطان عنق الرحم وتطوره يوفر نظرة ثاقبة قيمة للآليات الجزيئية الأساسية للمرض. علاوة على ذلك ، يمكن أن يؤدي تحديد هذه الجينات المستهدفة إلى تطوير استرات.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0