子宮頸がん細胞の増殖とシスプラチン感受性における FAM83Aの役割を検証するためのFAM83A のノックダウン

要約

ここでは、 FAM83A ノックダウンの手順を示します。子宮頸がん細胞の増殖、遊走、および浸潤に対するその影響を検出するためのアッセイ。そして、これらの細胞のシスプラチンに対する感作。この研究は、子宮頸がんの有望な標的遺伝子であり、さらなる薬物研究の参考となります。

要約

腫瘍標的遺伝子の探索は、子宮頸がんの予防と治療にとって最も重要です。この研究では、子宮頸がんにおける腫瘍標的遺伝子FAM83Aの同定に関与する手順を概説します。まず、Cancer Genome Atlasデータセットを使用して、女性におけるFAM83Aの発現と予後の重要性を検証しました。低分子干渉RNA(siRNA)は、HeLaおよびC33a細胞におけるFAM83A遺伝子のノックダウンに使用されました。次に、5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)染色を行い、腫瘍細胞の増殖能への影響を調べました。創傷治癒および多孔質メンブレンインサートアッセイを実施して、腫瘍細胞の遊走および浸潤能力を評価しました。

ウェスタンブロッティングを使用して、アポトーシス関連タンパク質レベルを定量しました。JC-1染色は、ミトコンドリア機能の変化を評価するために採用されました。さらに、シスプラチン(ジアミンジクロロプラチナ、DDP)介入を使用して、標的遺伝子の治療可能性を評価しました。フローサイトメトリーおよびコロニー形成アッセイを実施して、遺伝子の抗がん特性をさらに検証しました。その結果、 FAM83A ノックダウンは、子宮頸がん細胞の増殖、遊走、浸潤を阻害し、これらの細胞をシスプラチンに感作することが示されました。これらの包括的な方法論は、 FAM83A が腫瘍関連標的遺伝子であることを総合的に検証し、子宮頸がんの予防および治療における潜在的な治療標的として有望視されています。

概要

子宮頸がんは、婦人科悪性腫瘍の世界的な主要なタイプの1つであり、女性のがん関連死亡率の主な原因であるため、世界的な懸念事項です¹。根治的手術と化学放射線療法は、一次段階での高い治癒率と関連しています。しかし、子宮頸がんの進行期に転移性疾患を発症した患者の治療成績は非常に好ましくない²。したがって、子宮頸がん細胞の遊走と浸潤の根底にある生物学的メカニズムをさらに理解し、この疾患の予防と治療のための潜在的な治療標的を特定することが重要です。

がんの進行に関与する標的遺伝子を同定し、その発現や作用を阻害する方法を見つけることは、有望な治療法の選択肢となります。本研究では、FAM83を発がん遺伝子として同定し、C33a細胞とHeLa細胞に対する阻害作用をさらに調べました。FAM83ファミリーがん遺伝子(FAM83A-H)は、ヒトのがんにおいて広く報告されている^3,4。最近、FAM83Aは、肺⁵、^乳がん6、卵巣⁷、および膵臓8

プロトコル

この研究は、TCGA(https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines)が提供する出版ガイドラインに完全に準拠していました。このプロトコルで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、材料表 を参照してください。

1. データソースとバイオインフォマティクス分析

1. Cancer Genome Atlas(TCGA)データベース(https://cancergenome.nih.gov)からRNAシーケンシングデータを取得し、クラスター解析を行います。TGAプロジェクトから採取したサンプルの生RNA-Seqデータを再計算するウェブベースのツールであるGEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)を使用して、標準的な処理パイプラインでがん治療薬候補の標的をスクリーニングします。
   注:GEPIAのWebサイトは、すべてのユーザーが無料で利用できます。
2. GEPIAのホームページにアクセスし、 がんの種類の解析をクリックし、鑑 別遺伝子解析 オプションを選択して、 がん名= CESE (このウェブページでは 子宮頸部扁平上皮癌および子宮頸部腺癌 と定義)、....

ディスカッション

子宮頸がんの予防と治療の両面において、腫瘍標的遺伝子の解明は極めて重要です。子宮頸がんの発生と進行に重要な役割を果たす特定の遺伝子を理解することは、子宮頸がんの根底にある分子メカニズムに関する貴重な洞察を提供します。さらに、これらの標的遺伝子を同定することで、新たな治療戦略や標的療法の開発につながる可能性があります。本研究では、TCGAデータセット解析を.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0