Knockdown de FAM83A pour vérifier son rôle dans la croissance des cellules cancéreuses du col de l’utérus et la sensibilité au cisplatine

Résumé

Ici, nous montrons les procédures pour le knockdown FAM83A ; les tests permettant de détecter ses effets sur la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus ; et la sensibilisation de ces cellules au cisplatine. Cette étude fournit un gène cible prometteur pour le cancer du col de l’utérus et une référence pour la recherche de médicaments ultérieurs.

Résumé

L’exploration des gènes cibles tumoraux revêt une importance capitale pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. Dans cette étude, nous décrivons les étapes impliquées dans l’identification d’un gène cible tumoral FAM83A dans le cancer du col de l’utérus. Tout d’abord, l’ensemble de données de l’Atlas du génome du cancer a été utilisé pour valider l’expression et la signification pronostique de FAM83A chez les femmes. Un petit ARN interférent (siRNA) a été utilisé pour inhiber le gène FAM83A dans les cellules HeLa et C33a . Ensuite, une coloration à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été effectuée pour déterminer les effets sur les capacités de prolifération des cellules tumorales. Des tests de cicatrisation des plaies et d’insertion de membranes poreuses ont été effectués pour évaluer les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales.

Le Western blot a été utilisé pour quantifier les niveaux de protéines liées à l’apoptose. La coloration JC-1 a été utilisée pour évaluer les altérations de la fonction mitochondriale. De plus, l’intervention du cisplatine (diaminedichloroplatine, DDP) a été utilisée pour évaluer le potentiel thérapeutique du gène cible. Des tests de cytométrie en flux et de formation de colonies ont été effectués pour valider davantage les caractéristiques anticancéreuses du gène. En conséquence, il a été démontré que le knockdown de FAM83A inhibe la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus et sensibilise ces cellules au cisplatine. Ces méthodologies complètes valident collectivement FAM83A en tant que gène cible associé à la tumeur, prometteur en tant que cible thérapeutique potentielle dans la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus.

Introduction

Le cancer du col de l’utérus est une préoccupation mondiale car il s’agit de l’un des principaux types de tumeurs malignes gynécologiques dans le monde et de la principale cause de mortalité liée au cancer chez les femmes¹. La chirurgie radicale et la chimioradiothérapie sont associées à des taux de guérison élevés au stade primaire. Cependant, les résultats du traitement pour les patientes à un stade avancé du cancer du col de l’utérus qui développent une maladie métastatique sont très défavorables². Par conséquent, il est crucial de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à la migration et à l’invasion....

Protocole

L’étude était tout à fait conforme aux lignes directrices de publication fournies par TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Source de données et analyse bioinformatique

1. Obtenez des données de séquençage de l’ARN à partir de la base de données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) pour l’analyse en grappes. Utilisez le GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), un outil en ligne pour recalculer les données brutes de séqu....

Discussion

L’étude des gènes cibles de la tumeur est de la plus haute importance pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. La compréhension des gènes spécifiques qui jouent un rôle important dans le développement et la progression du cancer du col de l’utérus fournit des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires sous-jacents de la maladie. De plus, l’identification de ces gènes cibles peut conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et de thérapies.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0