Knockdown de FAM83A pour vérifier son rôle dans la croissance des cellules cancéreuses du col de l’utérus et la sensibilité au cisplatine

Résumé

Ici, nous montrons les procédures pour le knockdown FAM83A ; les tests permettant de détecter ses effets sur la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus ; et la sensibilisation de ces cellules au cisplatine. Cette étude fournit un gène cible prometteur pour le cancer du col de l’utérus et une référence pour la recherche de médicaments ultérieurs.

Résumé

L’exploration des gènes cibles tumoraux revêt une importance capitale pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. Dans cette étude, nous décrivons les étapes impliquées dans l’identification d’un gène cible tumoral FAM83A dans le cancer du col de l’utérus. Tout d’abord, l’ensemble de données de l’Atlas du génome du cancer a été utilisé pour valider l’expression et la signification pronostique de FAM83A chez les femmes. Un petit ARN interférent (siRNA) a été utilisé pour inhiber le gène FAM83A dans les cellules HeLa et C33a . Ensuite, une coloration à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été effectuée pour déterminer les effets sur les capacités de prolifération des cellules tumorales. Des tests de cicatrisation des plaies et d’insertion de membranes poreuses ont été effectués pour évaluer les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales.

Le Western blot a été utilisé pour quantifier les niveaux de protéines liées à l’apoptose. La coloration JC-1 a été utilisée pour évaluer les altérations de la fonction mitochondriale. De plus, l’intervention du cisplatine (diaminedichloroplatine, DDP) a été utilisée pour évaluer le potentiel thérapeutique du gène cible. Des tests de cytométrie en flux et de formation de colonies ont été effectués pour valider davantage les caractéristiques anticancéreuses du gène. En conséquence, il a été démontré que le knockdown de FAM83A inhibe la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus et sensibilise ces cellules au cisplatine. Ces méthodologies complètes valident collectivement FAM83A en tant que gène cible associé à la tumeur, prometteur en tant que cible thérapeutique potentielle dans la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus.

Introduction

Le cancer du col de l’utérus est une préoccupation mondiale car il s’agit de l’un des principaux types de tumeurs malignes gynécologiques dans le monde et de la principale cause de mortalité liée au cancer chez les femmes¹. La chirurgie radicale et la chimioradiothérapie sont associées à des taux de guérison élevés au stade primaire. Cependant, les résultats du traitement pour les patientes à un stade avancé du cancer du col de l’utérus qui développent une maladie métastatique sont très défavorables². Par conséquent, il est crucial de mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à la migration et à l’invasion des cellules cancéreuses du col de l’utérus et d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles pour la prévention et le traitement de cette maladie.

L’identification des gènes cibles impliqués dans la progression du cancer et la recherche de moyens d’inhiber leur expression ou leur action présentent des options thérapeutiques prometteuses. Dans cette étude, nous avons identifié FAM83 comme un gène cancérigène et étudié plus en détail ses effets inhibiteurs sur les cellules C33a et HeLa. Les oncogènes de la famille FAM83 (FAM83A-H) sont largement rapportés dans les cancers humains ^3,4. Récemment, il a été rapporté que FAM83A était régulé à la hausse dans les cancers du poumon⁵, du sein⁶, de l’ovaire⁷ et du pancréas⁸, ce qui indique que FAM83A joue un rôle important dans la progression du cancer en favorisant la prolifération, l’invasion, les traits de type cellule souche et la résistance aux médicaments dans les cellules tumorales. Il est important de noter que FAM83A a été identifié comme l’un des nouveaux gènes candidats associés à la progression des lésions cervicales et à la cancérogenèse⁹. Malgré la confirmation de l’expression élevée de FAM83A dans les cellules cancéreuses du col de l’utérus humain, l’impact spécifique et les mécanismes sous-jacents de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus restent incertains.

Dans cette étude, nous décrivons les protocoles impliqués dans l’identification de FAM83A en tant que gène cible de la tumeur dans le cancer du col de l’utérus et utilisons un petit ARN interférent (siRNA) pour l’inactivation du gène FAM83A dans les cellules HeLa et C33a . La coloration à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) a été réalisée pour déterminer les effets sur la prolifération des cellules tumorales, tandis que les tests de cicatrisation des plaies et d’insertion de membranes poreuses ont permis d’évaluer les capacités de migration et d’invasion des cellules tumorales.

Un transfert Western a été effectué pour déterminer les niveaux de protéines liées à l’apoptose, et la coloration JC-1 a été utilisée pour évaluer les altérations de la fonction mitochondriale. Ainsi, nous avons rapporté que FAM83A joue un rôle essentiel dans la prolifération cellulaire, les métastases et l’invasion dans le cancer du col de l’utérus. Grâce à un dysfonctionnement mitochondrial et à l’apoptose associés à la voie PI3K/AKT, FAM83A a sensibilisé les cellules cancéreuses du col de l’utérus au cisplatine (diaminedichloroplatine, DDP). Cette étude fournit une nouvelle cible pour le cancer du col de l’utérus et possiblement d’autres cancers et une référence pour le développement de stratégies visant à surmonter la résistance des cellules cancéreuses à certains médicaments chimiothérapeutiques.

Protocole

L’étude était tout à fait conforme aux lignes directrices de publication fournies par TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Reportez-vous au tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Source de données et analyse bioinformatique

1. Obtenez des données de séquençage de l’ARN à partir de la base de données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) pour l’analyse en grappes. Utilisez le GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), un outil en ligne pour recalculer les données brutes de séquençage de l’ARN d’échantillons provenant de projets TCGA, afin de dépister des cibles thérapeutiques candidates contre le cancer à l’aide d’un pipeline de traitement standard.
   NOTE : Le site web du GEPIA est accessible gratuitement à tous les utilisateurs.
2. Accédez à la page d’accueil du site Web du GEPIA et cliquez sur Analyse du type de cancer, sélectionnez l’option Analyse différentielle des gènes et définissez les paramètres suivants : Nom du cancer = CESE (défini comme carcinome épidermoïde du col de l’utérus et adénocarcinome endocervical sur cette page Web), |Log2FC| Seuil = 1, seuil de la valeur q = 0,01, méthodes différentielles = ANOVA et distribution chromosomique = les deux. Ensuite, cliquez sur Liste pour obtenir une liste de gènes qui montre l’expression différentielle entre les groupes tumoraux et normaux.
   REMARQUE : Il faut une revue approfondie de la littérature pour identifier les gènes candidats exprimés de manière différentielle. Dans cette étude, en tenant compte du contexte de la littérature disponible, nous nous concentrons sur le gène tumoral d’intérêt, FAM83A.
3. Ensuite, examinez l’expression de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus et les tissus normaux à l’aide de GEPIA en passant à l’option Expression DIY sur le site Web et sélectionnez Boîte à moustaches comme type de graphique. Saisissez FAM83A dans le champ des paramètres du gène et définissez les paramètres suivants : |Log2FC| Valeur limite = 1 ; valeur q Cutoff = 0,01. Sélectionnez CESE comme nom du cancer et Correspondre aux données normales TCGA pour le champ Données normales appariées , en laissant tous les autres paramètres à leur valeur par défaut. Cliquez sur Tracer et autorisez le site Web à générer une boîte à moustaches représentant l’expression différentielle du gène FAM83A ; Enregistrez la boîte à moustaches pour référence et analyse ultérieures.
4. Enfin, analyser la survie globale des patientes porteuses de tumeurs présentant différents niveaux d’expression de FAM83A dans le cancer du col de l’utérus. Accédez à l’option Tracés de survie sur le site Web, définissez le gène sur FAM83A et sélectionnez Survie globale comme type d’analyse. Ajoutez le nom de la tumeur CESE, choisissez Mois pour les unités de l’axe et laissez tous les autres paramètres à leurs paramètres par défaut. Cliquez sur Tracer et laissez le site Web générer un graphique de courbe de survie ; Conservez ce tableau pour référence et analyse futures.
5. Prendre en compte à la fois l’expression différentielle de FAM83A dans les tumeurs et sa corrélation avec l’analyse de survie des patientes pour identifier FAM83A comme un gène cible thérapeutique potentiel dans le cancer du col de l’utérus.

2. Expériences cellulaires

1. Culture cellulaire
   1. Cultiver des lignées cellulaires tumorales humaines dans le milieu modifié à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO₂ .
      REMARQUE : Se reporter au tableau des matériaux pour obtenir des renseignements sur les lignées cellulaires et les composants du milieu de culture.
2. Transfection cellulaire
   1. Utilisez l’ARNi pour inhiber l’expression de FAM83A dans les cellules.
      REMARQUE : Voir le tableau 1 pour la séquence spécifique de siRNA.
   2. Semer les cellules dans des plaques à 6 puits et incuber avec le mélange de 50 nM si-FAM83A ou siRNA-NC et de 8 μL d’agent de transfection ou seulement 8 μL d’agent de transfection pendant 4 à 6 h après avoir atteint une confluence de 50 % à 70 %. N’ajoutez que du DMEM sans sérum au contrôle négatif.
   3. Après l’incubation, remplacer le milieu contenant l’agent de transfection par du DMEM + 10 % de sérum de veau fœtal. De plus, 48 h après la transfection, traiter avec 5 μM de cisplatine (DDP) pendant 24 h comme prévu et prélever toutes les cellules pour l’extraction totale de l’ARN et l’analyse qRT-PCR.

3. Détection de l’EdU pour le test de prolifération cellulaire

REMARQUE : Utilisez le kit de prolifération cellulaire EdU pour évaluer la prolifération cellulaire in vitro conformément aux instructions du fabricant.

1. Ensemencer les cellules dans des plaques à 6 puits et les incuber avec une solution EdU à 10 μM pendant 2 h. Fixez les cellules avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min à température ambiante (RT) et perméabilisez-les avec du Triton X-100 à 0,3 % dans du PBS pendant 10 min à RT.
2. Retirez le tampon de perméabilisation et ajoutez 500 μL de solution réactionnelle 1x. Ensuite, incubez pendant 30 minutes à RT dans l’obscurité pour la coloration nucléaire.
3. Colorez les cellules avec le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et visualisez-les au microscope à fluorescence à un grossissement de 200x. Colorez les noyaux des cellules proliférantes avec de l’EdU et examinez-les pour la fluorescence rouge.
4. Enfin, utilisez un logiciel pour quantifier les résultats en comptant au moins 10 champs aléatoires et calculez les taux de prolifération en utilisant le rapport entre les cellules fluorescentes positives et le nombre total de cellules.

4. Test de cicatrisation des plaies

1. Cellules de semence en plaques à 6 puits à une densité de 2 × 10⁵ cellules par puits.
2. Lorsque les cellules atteignent 90 % de confluence, utilisez un embout de micropipette stérile de 10 μL pour créer délicatement une rayure linéaire dans la monocouche cellulaire. Rincez doucement les puits avec du PBS stérile pour éliminer les cellules détachées et les débris causés par le grattage.
3. De plus, incubez les cellules dans un milieu contenant 1 % de FBS. Ensuite, observez et prenez des images avec le microscope inversé pour la cicatrisation de la région blessée à 12, 24 et 48 h.

5. Essai d’insertion de membrane poreuse

1. Préparer une suspension cellulaire dans un milieu de culture cellulaire à la concentration cellulaire souhaitée (contenant 4 × 10^{cellules 4} ), y compris les cellules C33a transfectées ou témoins et HeLa. Ajoutez la suspension cellulaire dans la chambre supérieure des inserts membranaires, en assurant une distribution uniforme. Ajouter le milieu complet dans la chambre inférieure.
2. Après incubation pendant 24 h, utiliser de l’alcool méthylique et du violet cristallin à 0,1 % pour la fixation et la coloration des cellules migrant vers les chambres inférieures, respectivement.
3. Utilisez un microscope inversé pour prendre des images, puis analysez le nombre de cellules en migration en comptant au moins 10 champs aléatoires avec ImageJ.
   1. Pour l’analyse des nombres avec ImageJ, ouvrez l’image dans le logiciel ImageJ, allez dans l’onglet Image dans le menu de l’outil, sélectionnez Ajuster, puis cliquez sur Seuil. Ajustez les paramètres de seuil, si nécessaire, jusqu’à ce que seules les cellules soient visibles sur un fond blanc.
   2. Cliquez sur Appliquer dans la fenêtre Seuil pour appliquer ces paramètres à l’image. Maintenant, sélectionnez l’outil Baguette (traçage) dans la barre d’outils (située en haut de la fenêtre).
   3. Cliquez sur la zone de l’image où se trouvent les cellules pour sélectionner toutes les cellules de l’image seuillée. Une fois les cellules mises en surbrillance, accédez à Analyser dans le menu Outil, puis cliquez sur Analyser les particules. Dans la fenêtre Analyser les particules, entrez la taille (par exemple, 0 - infini) et les valeurs de circularité (par exemple, 0,00 - 1,00) souhaitées en fonction des exigences expérimentales pour inclure toutes les cellules dans le nombre.
   4. Cliquez sur OK et attendez que le logiciel compte les cellules et qu’une nouvelle fenêtre apparaisse avec les résultats de l’analyse.

6. Essai de formation de colonies

1. Ensemencer 2 × 10^{5 cellules} par puits de groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à 6 puits avec ou sans traitement au cisplatine 5 μM (DDP) pendant 24 h.
2. Après une période de traitement médicamenteux de 24 heures, détacher les cellules à l’aide de 0,25 % de trypsine et les remettre en suspension dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de FBS. Ensemencer les cellules remises en suspension dans une plaque à 6 puits à une densité de 1 × 10³ cellules par puits, puis incuber dans un incubateur à 5 % de CO₂ à une température de 37 °C.
3. Après l’incubation pendant ~7 à 10 jours lorsque les colonies sont visibles, fixez les cellules avec du polyoxyméthylène à 4 % et colorez-les avec la solution colorante Giemsa pendant 20 min.
4. Lavez légèrement les cellules et laissez les plaques sécher à l’air libre. Prenez des images des grappes de colonies au microscope et comptez le nombre de colonies qui contiennent plus de 50 cellules.

7. Analyse de la dépolarisation de la membrane mitochondriale (MMP) à l’aide du colorant JC-1

1. Semez 1,2 × 10⁶ cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
2. Incuber avec 1x solution de coloration JC-1 pendant 15 à 20 min sous 5 % de CO₂ à 37 °C à l’aide d’un kit de dosage du potentiel de la membrane mitochondriale selon les instructions du fabricant.
3. Lavez les cellules et examinez-les au microscope fluorescent à un grossissement de 200x en utilisant les longueurs d’onde d’excitation et d’émission pour JC-1 à ~490 nm et 590 nm, respectivement. Pour visualiser la fluorescence JC-1, utilisez des filtres appropriés, tels qu’un filtre d’excitation bleu (450-490 nm) et un filtre d’émission rouge (passe-long > 590 nm) pour capturer sélectivement le signal de fluorescence émis.

8. Analyse par cytométrie en flux du mPTP

1. Semez 1,2 × 10⁶ cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
2. Retirez le milieu de culture des cellules, remettez les cellules en suspension dans du PBS et ajoutez 300 μL chacune (1x volume) de solution de coloration Calcein AM et de solution de travail de trempe par fluorescence pour couvrir uniformément les cellules. Incuber les cellules à 37 °C dans un environnement à l’abri de la lumière pendant 30 à 45 min et remplacer le milieu par un milieu de culture frais préchauffé à 37 °C. Incuber les cellules à 37 °C dans un environnement protégé de la lumière pendant 30 minutes supplémentaires pour assurer l’hydrolyse complète de la calcéine AM par les estérases intracellulaires, ce qui entraîne la génération de calcéine fluorescente verte intracellulaire.
3. Retirez le milieu de culture, lavez les cellules 2 à 3 fois avec du PBS et ajoutez un tampon de détection. Détectez le mPTP cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux et d’une longueur d’onde d’excitation de 488 nm.

9. Cytométrie en flux

1. Semez 1,2 × 10⁶ cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
2. Après 24 h de traitement médicamenteux, remettre les cellules en suspension dans 200 μL de solution tampon de liaison et mélanger délicatement 10 μL d’annexine V-FITC et 5 μL d’iodure de propidium (IP) dans la suspension cellulaire. Incuber le mélange pendant 15 min en évitant la lumière et ajouter 300 μL de solution tampon de liaison aux cellules. Détecter l’apoptose cellulaire à l’aide de la cytométrie en flux à une longueur d’onde d’excitation de 488 nm.

10. Analyse RT-PCR

1. Semez 1,2 × 10⁶ cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
2. Extraire l’ARN total des cellules tumorales à l’aide du réactif d’extraction d’ARN et convertir l’ARN extrait en ADN complémentaire (ADNc) avec le mélange de synthèse d’ADNc en incubant à 42 °C pendant 45 min, puis à 95 °C pendant 5 min.
3. Préparez le mélange réactionnel PCR contenant l’ADN polymérase, les nucléotides, le tampon et les amorces spécifiques au gène conçues. Ajouter le modèle d’ADNc au mélange réactionnel pour la réaction de PCR en temps réel et effectuer la PCR sur l’instrument de PCR quantitatif en temps réel avec les conditions de thermocyclage suivantes : dénaturation à 95 °C pendant 30 s, suivie de 40 cycles à 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s, et de l’étape de la courbe de fusion à 95 °C pendant 15 s, 60 °C pendant 1 min et 95 °C pendant 15 s. Quantifier les niveaux d’ARNm à l’aide de la méthode 2^−ΔΔCq en utilisant GAPDH comme contrôle interne.
   REMARQUE : Le système de réaction RT-PCR est illustré dans le tableau 1 et les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau 1.
   1. Pour calculer la valeur 2^−ΔΔCq , mesurez les valeurs de Cq pour le gène cible et le gène de référence (GAPDH) dans les échantillons. Calculez le ΔCq en soustrayant la valeur Cq du gène de référence de la valeur Cq du gène cible pour chaque échantillon. Calculer le ΔΔCq en soustrayant le ΔCq d’un échantillon témoin du ΔCq de chaque échantillon expérimental. Enfin, calculez la valeur 2^−ΔΔCq en élevant 2 à la puissance de la valeur ΔΔCq.
      REMARQUE : La valeur Cq représente le numéro de cycle auquel le signal de fluorescence atteint le seuil défini.

11. Analyse par transfert Western

1. Semez 1,2 × 10⁶ cellules tumorales des groupes Si-NC et Si-FAM83A dans une plaque à six puits et cultivez-les pendant 24 h avec ou sans traitement au cisplatine (DDP) à 5 μM.
2. Collectez les cellules cultivées et lavez-les avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée pour éliminer tout milieu de croissance ou sérum résiduel. Lyser les cellules à l’aide d’un tampon de lyse RIPA contenant du fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF) pour libérer les protéines cellulaires. Incuber les cellules sur de la glace pendant quelques minutes pour assurer une lyse complète et centrifuger à 4 °C, 12 000 × g pendant 15 min. Prélever le surnageant pour déterminer sa concentration en protéines.
3. Déterminer la concentration de protéines dans le lysat cellulaire à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA selon les instructions du fabricant. Mélangez le lysat cellulaire avec un tampon de charge et chauffez le mélange à 95-100 °C pendant 5-10 min pour dénaturer les protéines et assurer une séparation uniforme sur le gel.
4. À partir de chaque échantillon, chargez 30 μg de protéines totales sur un gel SDS-PAGE et faites fonctionner le SDS-PAGE sous une tension constante de 80 V. Arrêtez l’électrophorèse lorsque le bleu de bromophénol atteint le fond du gel de séparation.
5. Transférer les protéines séparées du gel sur une membrane de polyfluorure de vinyle à l’aide d’un système de transfert humide sur un bain de glace avec un courant de 200 mA pendant 1,5 h.
6. Bloquer la membrane avec du lait écrémé à 5 % dans une solution saline tamponnée Tris avec un tampon Tween-20 à 0,05 % (TBST) pendant 1 h à RT et incuber pendant la nuit à 4 °C avec les anticorps respectifs indiqués dans le tableau des matériaux.
7. Laver la membrane plusieurs fois avec TBST et incuber avec les anticorps secondaires (Table des matériaux) pendant 1 h à RT, suivi d’un lavage avec TBST. Visualisez les bandes protéiques à l’aide d’un kit de détection de chimiluminescence amélioré et d’un système d’imagerie.

12. Analyse statistique

1. Étant donné que tous les points de données expérimentaux seront indépendants, présentez les données sous la forme de la moyenne ±écart-type.
2. Utilisez l’analyse de variance à un facteur (ANOVA) pour les comparaisons multiples et le test de Dunnett pour comparer chaque groupe avec le groupe témoin. Utilisez le test t de Student (bilatéral non apparié) pour comparer deux groupes ; considèrent que P < 0,05 sont significatifs.

Résultats

Analyse de la base de données TCGA et validation PCR

À partir de l’analyse de la base de données TCGA, nous avons effectué une analyse comparative des niveaux d’expression de l’ARNm dans 306 échantillons de cellules cancéreuses du col de l’utérus et 13 échantillons de cellules normales afin d’étudier l’expression différentielle de FAM83A. FAM83A a été régulé à la haus...

Discussion

L’étude des gènes cibles de la tumeur est de la plus haute importance pour la prévention et le traitement du cancer du col de l’utérus. La compréhension des gènes spécifiques qui jouent un rôle important dans le développement et la progression du cancer du col de l’utérus fournit des informations précieuses sur les mécanismes moléculaires sous-jacents de la maladie. De plus, l’identification de ces gènes cibles peut conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques et de thérapies...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0