Нокдаун FAM83A для проверки его роли в росте клеток рака шейки матки и чувствительности к цисплатину

Резюме

Здесь мы покажем процедуры нокдауна FAM83A ; анализы для выявления его влияния на пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака шейки матки; и сенсибилизация этих клеток к цисплатину. Это исследование предоставляет многообещающий ген-мишень для рака шейки матки и эталон для дальнейших исследований лекарственных препаратов.

Аннотация

Исследование генов-мишеней опухоли имеет первостепенное значение для профилактики и лечения рака шейки матки. В этом исследовании мы описываем этапы, связанные с идентификацией гена-мишени опухоли FAM83A при раке шейки матки. Во-первых, набор данных Атласа генома рака был использован для проверки экспрессии и прогностической значимости FAM83A у женщин. Малая интерферирующая РНК (миРНК) использовалась для нокдауна гена FAM83A в клетках HeLa и C33a . Затем было проведено окрашивание 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU) для определения влияния на пролиферативные способности опухолевых клеток. Для оценки способности опухолевых клеток к миграции и инвазии были проведены анализы на заживление ран и вставку пористой мембраны.

Вестерн-блоттинг был использован для количественной оценки уровней белка, связанных с апоптозом. Для оценки изменений функции митохондрий использовали окрашивание JC-1. Кроме того, для оценки терапевтического потенциала гена-мишени было использовано вмешательство цисплатина (диаминдихлорплатины, DDP). Для дальнейшей валидации противоопухолевых характеристик гена были проведены проточная цитометрия и анализ образования колоний. В результате было показано, что нокдаун FAM83A ингибирует пролиферацию, миграцию и инвазию клеток рака шейки матки и сенсибилизирует эти клетки к цисплатину. Эти комплексные методики в совокупности подтверждают, что FAM83A является геном-мишенью, ассоциированным с опухолью, перспективным в качестве потенциальной терапевтической мишени в профилактике и лечении рака шейки матки.

Введение

Рак шейки матки является глобальной проблемой, поскольку он является одним из ведущих видов гинекологических злокачественных новообразований во всем мире и основной причиной смертности от рака у женщин¹. Радикальная хирургия и химиолучевая терапия связаны с высокими показателями излечения на первичной стадии. Однако результаты лечения пациенток на поздней стадии рака шейки матки, у которых развивается метастатическое заболевание, весьма неблагоприятны². Поэтому крайне важно глубже понять биологические механизмы, лежащие в основе миграции и инвазии клеток рака шейки матки, и определить потенциальные терапевтические мишени для профилактики и лечения этого заболевания.

Идентификация генов-мишеней, участвующих в прогрессировании рака, и поиск способов ингибирования их экспрессии или действия представляют собой многообещающие варианты лечения. В этом исследовании мы идентифицировали FAM83 как ген, вызывающий рак, и дополнительно изучили его ингибирующее воздействие на клетки C33a и HeLa. Онкогены семейства FAM83 (FAM83A-H) широко известны при раке человека ^3,4. Недавно сообщалось о повышенной регуляции FAM83A при раке легких⁵, молочной железы⁶, яичников⁷ и поджелудочной железы⁸, что указывает на то, что FAM83A играет важную роль в прогрессировании рака, способствуя пролиферации, инвазии, признакам, подобным стволовым клеткам, и лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Важно отметить, что FAM83A был идентифицирован как один из новых генов-кандидатов, связанных с прогрессированием поражения шейки матки и канцерогенезом⁹. Несмотря на подтверждение повышенной экспрессии FAM83A в клетках рака шейки матки человека, специфическое влияние и лежащие в его основе механизмы FAM83A при раке шейки матки остаются неясными.

В этом исследовании мы описываем протоколы, участвующие в идентификации FAM83A в качестве гена-мишени опухоли при раке шейки матки, и используем небольшую интерферирующую РНК (миРНК) для нокдауна гена FAM83A в клетках HeLa и C33a . Для определения влияния на пролиферацию опухолевых клеток было проведено окрашивание 5-этинил-2'-дезоксиуридином (EdU), в то время как ранозаживление и анализ вставки пористой мембраны помогли оценить миграцию опухолевых клеток и способность к инвазии.

Для определения уровней белков, связанных с апоптозом, проводили вестерн-блоттинг, а для оценки изменений митохондриальной функции использовали окрашивание JC-1. Таким образом, мы сообщили, что FAM83A играет решающую роль в пролиферации, метастазировании и инвазии клеток при раке шейки матки. Через митохондриальную дисфункцию и апоптоз, ассоциированный с PI3K/AKT, FAM83A нокдаун сенсибилизировал клетки рака шейки матки к цисплатину (диаминдихлорплатине, DDP). Это исследование предоставляет новую мишень для рака шейки матки и, возможно, других видов рака, а также ориентир для разработки стратегий преодоления резистентности раковых клеток к определенным химиотерапевтическим препаратам.

протокол

Исследование полностью соответствовало рекомендациям по публикациям, предоставленным TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). См. Таблицу материалов для получения подробной информации, связанной со всеми материалами, реагентами и инструментами, используемыми в этом протоколе.

1. Анализ источников данных и биоинформатики

1. Получение данных секвенирования РНК из базы данных Атласа генома рака (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) для кластерного анализа. Используйте GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), веб-инструмент для повторного вычисления необработанных данных РНК-секвенирования образцов из проектов TCGA, для скрининга потенциальных мишеней для лекарств от рака с помощью стандартного конвейера обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-сайт GEPIA находится в свободном доступе для всех пользователей.
2. Зайдите на главную страницу веб-сайта GEPIA и нажмите « Анализ типа рака», выберите опцию «Дифференциальный анализ генов » и установите следующие параметры: Название рака = CESE (определяется как плоскоклеточная карцинома шейки матки и эндоцервикальная аденокарцинома на этой веб-странице), |Лог2ФК| Cutoff = 1, q-value Cutoff = 0.01, Differential Methods = ANOVA и Chromosomal Distribution = оба. Затем нажмите на Список, чтобы получить список генов, показывающий дифференциальную экспрессию между опухолевыми и нормальными группами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для выявления дифференциально экспрессируемых генов-кандидатов требуется обширный обзор литературы. В этом исследовании, принимая во внимание имеющуюся литературу, мы сосредоточимся на интересующем нас опухолевом гене FAM83A.
3. Затем изучите экспрессию FAM83A в раке шейки матки и нормальных тканях с помощью EPIA, перейдя к опции «Выражение своими руками » на веб-сайте и выберите «Блочная диаграмма » в качестве типа диаграммы. Введите FAM83A в поле параметра гена и установите следующие параметры: |Лог2ФК| Значение отсечения = 1; q-значение Cutoff = 0.01. Выберите CESE в качестве названия рака и Сопоставить нормальные данные TCGA для поля данных Matched Normal , оставив все остальные настройки по умолчанию. Нажмите на Plot (График ) и разрешите веб-сайту создать ящичковую диаграмму, представляющую дифференциальную экспрессию гена FAM83A ; Сохраните блочную диаграмму для дальнейшего использования и анализа.
4. Наконец, проанализируйте общую выживаемость пациенток с опухолями с различными уровнями экспрессии FAM83A при раке шейки матки. Перейдите к опции Survival Plots на веб-сайте, установите Gene на FAM83A и выберите Overall Survival в качестве типа анализа. Добавьте имя опухоли CESE, выберите Months (Месяцы) в поле Axis Units (Единицы измерения оси) и оставьте для всех остальных параметров значения по умолчанию. Нажмите кнопку Построить график и позвольте веб-сайту создать диаграмму кривой выживаемости; Сохраните эту диаграмму для дальнейшего использования и анализа.
5. Учитывайте как дифференциальную экспрессию FAM83A в опухолях, так и ее корреляцию с анализом выживаемости пациентов, чтобы идентифицировать FAM83A как потенциальный терапевтический ген-мишень при раке шейки матки.

2. Клеточные эксперименты

1. Клеточная культура
   1. Культивирование линий опухолевых клеток человека в модифицированной среде при 37 °С в увлажненной атмосфере 5%_СО2 .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Информацию о клеточной линии и компонентах питательной среды см. в таблице материалов .
2. Трансфекция клеток
   1. Используйте миРНК, чтобы подавить экспрессию FAM83A в клетках.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конкретная последовательность миРНК приведена в таблице 1 .
   2. Клетки помещают в 6-луночные планшеты и инкубируют со смесью 50 нМ si-FAM83A или миРНК-NC и 8 мкл трансфекционного агента или только 8 мкл трансфекционного агента в течение 4-6 ч после достижения 50%-70% слияния. Добавляйте в отрицательный контроль только безсывороточный DMEM.
   3. После инкубации замените среду, содержащую трансфекционный агент, на ДМЕМ + 10% фетальную телячью сыворотку. Далее, через 48 ч после трансфекции, обработать 5 мкМ цисплатином (DDP) в течение 24 ч по назначению и собрать все клетки для экстракции общей РНК и анализа qRT-PCR.

3. Обнаружение EdU для анализа пролиферации клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте набор для пролиферации клеток EdU для оценки пролиферации клеток in vitro в соответствии с инструкциями производителя.

1. Высевают клетки в 6-луночные планшеты и инкубируют их с 10 мкМ раствором EdU в течение 2 ч. Фиксируют клетки 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре (RT) и пермеабилизируют 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 10 мин при RT.
2. Удалите буфер пермеабилизации и добавьте 500 мкл 1-кратного реакционного раствора. Затем инкубируют в течение 30 мин при РТ в темноте для ядерного окрашивания.
3. Окрасьте клетки 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и визуализируйте их под флуоресцентным микроскопом при 200-кратном увеличении. Окрасьте ядра пролиферирующих клеток EdU и исследуйте их на красную флуоресценцию.
4. Наконец, используйте программное обеспечение для количественной оценки результатов, подсчитав не менее 10 случайных полей, и рассчитайте скорость пролиферации, используя отношение флуоресцентно-положительных клеток к общему количеству клеток.

4. Ранозаживляющий анализ

1. Затравочные ячейки в 6-луночные планшеты при плотности 2 × 10⁵ ячеек на лунку.
2. Когда клетки достигнут 90% слияния, используйте стерильный наконечник микропипетки объемом 10 мкл, чтобы аккуратно создать линейную царапину в монослое клетки. Осторожно промойте лунки стерильным PBS, чтобы удалить все отслоившиеся клетки и мусор, вызванные царапинами.
3. Далее инкубируют клетки в среде, содержащей 1% ФБС. Затем наблюдайте и делайте снимки с помощью инвертированного микроскопа для заживления раненой области через 12, 24 и 48 часов.

5. Анализ пористой мембранной вставки

1. Готовят клеточную суспензию в питательной среде с нужной концентрацией клеток (содержащей 4 × 10⁴ клеток), включая трансфицированные или контрольные клетки С33а и HeLa. Добавьте клеточную суспензию в верхнюю камеру мембранных вставок, обеспечивая равномерное распределение. Добавьте полную среду в нижнюю камеру.
2. После инкубации в течение 24 ч используют метиловый спирт и 0,1% кристаллический фиолетовый для фиксации и окрашивания клеток, мигрирующих в нижние камеры соответственно.
3. Используйте инвертированный микроскоп для получения изображений, а затем проанализируйте количество мигрирующих клеток, подсчитав не менее 10 случайных полей с помощью ImageJ.
   1. Для анализа чисел с помощью ImageJ откройте изображение в программе ImageJ, перейдите на вкладку Image в меню инструментов, выберите Adjust, а затем нажмите Threshold. При необходимости отрегулируйте пороговые значения до тех пор, пока на белом фоне не будут видны только ячейки.
   2. Нажмите « Применить » в окне «Порог », чтобы применить эти настройки к изображению. Теперь выберите инструмент « Палочка (трассировка)» на панели инструментов (расположенной в верхней части окна).
   3. Щелкните по области изображения, где расположены ячейки, чтобы выбрать все ячейки в пороговом изображении. После того, как ячейки будут выделены, перейдите в раздел «Анализ» в меню «Инструменты», а затем нажмите «Анализ частиц». В окне "Анализ частиц" введите желаемый размер (например, 0 - бесконечность) и значения округлости (например, 0,00 - 1,00) в соответствии с экспериментальными требованиями, чтобы включить все ячейки в подсчет.
   4. Нажмите кнопку ОК и подождите, пока программа подсчитает ячейки и появится новое окно с результатами анализа.

6. Анализ формирования колоний

1. Высевают 2 × 10⁵ клеток на лунку групп Si-NC и Si-FAM83A в 6-луночном планшете с обработкой цисплатином 5 мкМ (DDP) или без нее в течение 24 ч.
2. После 24-часового периода медикаментозного лечения отделяют клетки с помощью 0,25% трипсина и ресуспендируют их в модифицированной среде Eagle (DMEM) Dulbecco, содержащей 10% FBS. Высевают ресуспендированные клетки в 6-луночную тарелку при плотности 1 × 10³ клетки на лунку, а затем инкубируют в 5%-ном инкубаторе_СО2 при температуре 37 °С.
3. После инкубации в течение ~7-10 дней, когда будут видны колонии, зафиксируйте клетки 4% полиоксиметиленом и окрасьте их раствором для окрашивания Гимза в течение 20 мин.
4. Слегка промойте ячейки и дайте пластинам высохнуть на воздухе. Сделайте снимки кластеров колоний под микроскопом и подсчитайте количество колоний, содержащих более 50 клеток.

7. Анализ деполяризации митохондриальной мембраны (ММП) с использованием красителя JC-1

1. Посев 1,2 × 10⁶ опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
2. Инкубируют с 1x раствором окрашивания JC-1 в течение 15-20 мин при 5%_CO2 при 37 °C, используя набор для анализа потенциала митохондриальной мембраны в соответствии с инструкциями производителя.
3. Промывают клетки и исследуют их под флуоресцентным микроскопом при 200-кратном увеличении с использованием длин волн возбуждения и излучения для JC-1 на длинах волн ~490 нм и 590 нм соответственно. Для визуализации флуоресценции JC-1 используйте соответствующие фильтры, такие как синий фильтр возбуждения (450-490 нм) и красный эмиссионный фильтр (длиннопроходный > 590 нм) для избирательного захвата излучаемого флуоресцентного сигнала.

8. Проточный цитометрический анализ mPTP

1. Посев 1,2 × 10⁶ опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
2. Удалите питательную среду из клеток, повторно суспендируйте клетки в PBS и добавьте по 300 мкл (1x объем) раствора для окрашивания кальцеина AM и рабочего раствора для тушения флуоресценции, чтобы равномерно покрыть клетки. Инкубируют клетки при 37 °C в защищенном от света помещении в течение 30-45 мин и заменяют среду свежей предварительно нагретой питательной средой при 37 °C. Инкубируют клетки при 37 °C в защищенной от света среде в течение дополнительных 30 мин, чтобы обеспечить полный гидролиз кальцеина AM внутриклеточными эстеразами, в результате чего образуется внутриклеточный зеленый флуоресцентный кальцеин.
3. Удалите питательную среду, промойте клетки 2-3 раза PBS и добавьте буфер обнаружения. Детектирование клеточного mPTP с помощью проточной цитометрии и длины волны возбуждения 488 нм.

9. Проточная цитометрия

1. Посев 1,2 × 10⁶ опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
2. После 24 ч обработки препаратом повторно суспендируют клетки в 200 мкл связывающего буферного раствора и осторожно смешивают 10 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл йодида пропидия (PI) с клеточной суспензией. Инкубируйте смесь в течение 15 мин, избегая света, и добавьте к клеткам 300 мкл связывающего буферного раствора. Обнаружение апоптоза клеток с помощью проточной цитометрии при длине волны возбуждения 488 нм.

10. ОТ-ПЦР-анализ

1. Посев 1,2 × 10⁶ опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
2. Извлеките общую РНК из опухолевых клеток с помощью реагента для экстракции РНК и превратите извлеченную РНК в комплементарную ДНК (кДНК) с помощью смеси для синтеза кДНК путем инкубации при 42 °C в течение 45 мин, а затем при 95 °C в течение 5 мин.
3. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР, содержащую ДНК-полимеразу, нуклеотиды, буфер и разработанные геноспецифические праймеры. Добавьте матрицу кДНК в реакционную смесь для реакции ПЦР в реальном времени и выполните ПЦР на приборе для количественной ПЦР в реальном времени со следующими условиями термоциклирования: денатурация при 95 °C в течение 30 с, затем 40 циклов при 95 °C в течение 5 с и 60 °C в течение 30 с и стадия кривой плавления при 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 1 мин и 95 °C в течение 15 с. Количественная оценка уровней мРНК с помощью метода 2^−ΔΔCq с использованием GAPDH в качестве внутреннего контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Реакционная система ОТ-ПЦР показана в таблице 1, а последовательности праймеров — в таблице 1.
   1. Чтобы вычислить значение 2^−ΔΔCq , измерьте значения Cq для целевого гена и референсного гена (GAPDH) в образцах. Вычислите ΔCq, вычитая значение Cq эталонного гена из значения Cq целевого гена для каждого образца. Вычислите ΔΔCq, вычитая ΔCq контрольного образца из ΔCq каждого экспериментального образца. Наконец, вычислите значение 2^−ΔΔCq , возведя 2 в степень значения ΔΔCq.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Значение Cq представляет собой номер цикла, при котором сигнал флуоресценции достигает установленного порога.

11. Вестерн-блоттинг

1. Посев 1,2 × 10⁶ опухолевых клеток из групп Si-NC и Si-FAM83A в шестилуночный планшет и культивирование в течение 24 ч с обработкой 5 мкМ цисплатином (DDP) или без нее.
2. Соберите культивируемые клетки и промойте их ледяным фосфатно-солевым буфером (PBS), чтобы удалить остатки питательной среды или сыворотки. Лизируйте клетки с помощью лизисного буфера RIPA, содержащего фенилметилсульфонилфторид (PMSF), для высвобождения клеточных белков. Инкубируют клетки на льду в течение нескольких минут, чтобы обеспечить полный лизис, и центрифугируют при 4 °C, 12 000 × g в течение 15 минут. Соберите надосадочную жидкость, чтобы определить ее концентрацию белка.
3. Определите концентрацию белка в клеточном лизате с помощью набора для анализа белка BCA в соответствии с инструкциями производителя. Смешайте клеточный лизат с загрузочным буфером и нагрейте смесь при температуре 95-100 °C в течение 5-10 мин для денатурации белков и обеспечения равномерного разделения на геле.
4. Из каждого образца загрузите 30 мкг общего белка в гель SDS-PAGE и запустите SDS-PAGE под постоянным напряжением 80 В. Прекратите электрофорез, когда бромфеноловый синий достигнет дна разделительного геля.
5. Отделенные белки из геля переносят на поливинилдифторидную мембрану с помощью системы мокрого переноса на ледяной бане током 200 мА в течение 1,5 ч.
6. Заблокируйте мембрану 5%-ным обезжиренным молоком в трис-буферном солевом растворе с 0,05%-ным буфером Tween-20 (TBST) в течение 1 ч при RT и инкубируйте в течение ночи при 4 °C с соответствующими антителами, указанными в таблице материалов.
7. Мембрану промывают несколько раз TBST и инкубируют со вторичными антителами (таблица материалов) в течение 1 ч при RT с последующей промывкой TBST. Визуализируйте белковые полосы с помощью усовершенствованного набора для обнаружения хемилюминесценции и системы визуализации.

12. Статистический анализ

1. Поскольку все экспериментальные данные будут независимыми, представьте данные в виде среднего значения ± SD. Выполните статистический анализ.
2. Используйте односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для множественных сравнений и критерий Даннета для сравнения каждой группы с контрольной группой. Использовать t-критерий Стьюдента (непарный двусторонний) для сравнения двух групп; считать P < 0,05 значимым.

Результаты

Анализ базы данных TCGA и проверка ПЦР

На основе анализа базы данных TCGA мы провели сравнительный анализ уровней экспрессии мРНК в 306 образцах клеток рака шейки матки и 13 образцах нормальных клеток для изучения дифференциальной ?...

Обсуждение

Исследование генов-мишеней опухоли имеет первостепенное значение как для профилактики, так и для лечения рака шейки матки. Понимание конкретных генов, которые играют значительную роль в развитии и прогрессировании рака шейки матки, дает ценную информацию о лежащих в основе молекулярн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0