Eliminación de FAM83A para verificar su papel en el crecimiento de células de cáncer de cuello uterino y la sensibilidad al cisplatino

Resumen

Aquí, mostramos los procedimientos para el derribo de FAM83A ; los ensayos para detectar sus efectos sobre la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino; y la sensibilización de estas células al cisplatino. Este estudio proporciona un gen diana prometedor para el cáncer de cuello uterino y una referencia para futuras investigaciones farmacológicas.

Resumen

La exploración de los genes diana tumorales es de suma importancia para la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino. En este estudio, describimos los pasos involucrados en la identificación de un gen diana tumoral FAM83A en el cáncer de cuello uterino. En primer lugar, se empleó el conjunto de datos del Atlas del Genoma del Cáncer para validar la expresión y la importancia pronóstica de FAM83A en mujeres. Se utilizó un pequeño ARN interferente (siRNA) para la eliminación del gen FAM83A en las células HeLa y C33a . A continuación, se realizó la tinción con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) para determinar los efectos sobre la capacidad de proliferación de las células tumorales. Se realizaron ensayos de cicatrización de heridas e inserción de membranas porosas para evaluar la migración de las células tumorales y las capacidades de invasión.

Se utilizó Western blot para cuantificar los niveles de proteínas relacionados con la apoptosis. La tinción con JC-1 se empleó para evaluar las alteraciones de la función mitocondrial. Además, se utilizó la intervención con cisplatino (diaminidicloroplatino, DDP) para evaluar el potencial terapéutico del gen diana. Se realizaron citometrías de flujo y ensayos de formación de colonias para validar aún más las características anticancerosas del gen. Como resultado, se demostró que el knockdown de FAM83A inhibe la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino y sensibiliza a estas células al cisplatino. Estas metodologías integrales validan colectivamente FAM83A como un gen diana asociado a tumores, que es prometedor como una posible diana terapéutica en la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino.

Introducción

El cáncer de cuello uterino es una preocupación mundial, ya que es uno de los principales tipos de neoplasias malignas ginecológicas en todo el mundo y es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en las mujeres¹. La cirugía radical y la quimiorradioterapia se asocian con altas tasas de curación en la etapa primaria. Sin embargo, los resultados del tratamiento para las pacientes en estadio avanzado de cáncer de cuello uterino que desarrollan enfermedad metastásica son muy desfavorables². Por lo tanto, es crucial comprender mejor los mecanismos biológicos que subyacen a la migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino e identificar posibles dianas terapéuticas para la prevención y el tratamiento de esta enfermedad.

La identificación de genes diana implicados en la progresión del cáncer y la búsqueda de formas de inhibir su expresión o acción presentan opciones de tratamiento prometedoras. En este estudio, identificamos FAM83 como un gen causante de cáncer e investigamos más a fondo sus efectos inhibidores en las células C33a y HeLa. Los oncogenes de la familia FAM83 (FAM83A-H) están ampliamente reportados en cánceres humanos ^3,4. Recientemente, se informó que FAM83A está regulado al alza en los cánceres de pulmón⁵, mama⁶, ovario⁷ y páncreas⁸, lo que indica que FAM83A desempeña un papel importante en la progresión del cáncer al promover la proliferación, la invasión, los rasgos similares a las células madre y la resistencia a los medicamentos en las células tumorales. Es importante destacar que FAM83A se identificó como uno de los nuevos genes candidatos asociados con la progresión de las lesiones cervicales y la carcinogénesis⁹. A pesar de la confirmación de la expresión elevada de FAM83A en células de cáncer de cuello uterino humano, el impacto específico y los mecanismos subyacentes de FAM83A en el cáncer de cuello uterino siguen sin estar claros.

En este estudio, describimos los protocolos involucrados en la identificación de FAM83A como un gen diana tumoral en el cáncer de cuello uterino y utilizamos un pequeño ARN interferente (siRNA) para la eliminación del gen FAM83A en células HeLa y C33a . Se realizó la tinción con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) para determinar los efectos sobre la proliferación de células tumorales, mientras que la cicatrización de heridas y los ensayos de inserción de membranas porosas ayudaron a evaluar la migración de las células tumorales y las capacidades de invasión.

Se realizó Western blot para determinar los niveles de proteínas relacionadas con la apoptosis, y se empleó la tinción de JC-1 para evaluar las alteraciones de la función mitocondrial. Por lo tanto, informamos que FAM83A desempeña un papel crítico en la proliferación celular, la metástasis y la invasión en el cáncer de cuello uterino. A través de la disfunción mitocondrial y la apoptosis asociadas a la vía PI3K/AKT, FAM83A sensibilizó las células de cáncer de cuello uterino al cisplatino (diaminidicloroplatino, DDP). Este estudio proporciona una nueva diana para el cáncer de cuello uterino y posiblemente otros cánceres y una referencia para el desarrollo de estrategias para superar la resistencia de las células cancerosas a ciertos fármacos quimioterapéuticos.

Protocolo

El estudio se ajustó plenamente a las directrices de publicación proporcionadas por la TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Fuente de datos y análisis bioinformático

1. Obtenga datos de secuenciación de ARN de la base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) para el análisis de conglomerados. Utilice GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), una herramienta basada en la web para volver a calcular los datos de secuenciación de ARN sin procesar de muestras de proyectos TCGA, para detectar dianas farmacológicas candidatas contra el cáncer con una línea de procesamiento estándar.
   NOTA: El sitio web de GEPIA está disponible gratuitamente para todos los usuarios.
2. Acceda a la página de inicio del sitio web de GEPIA y haga clic en Análisis de tipo de cáncer, seleccione la opción Análisis de genes diferenciales y establezca los siguientes parámetros: Nombre del cáncer = CESE (definido como carcinoma de células escamosas de cuello uterino y adenocarcinoma de endocuello uterino en esta página web), |Log2FC| Punto de corte = 1, valor de corte q = 0,01, métodos diferenciales = ANOVA y distribución cromosómica = ambos. A continuación, haga clic en Lista para obtener una lista de genes que muestra la expresión diferencial entre los grupos tumorales y normales.
   NOTA: Se requiere una extensa revisión de la literatura para identificar genes candidatos expresados diferencialmente. En este estudio, teniendo en cuenta los antecedentes de la literatura disponible, nos centramos en el gen tumoral de interés, FAM83A.
3. A continuación, examine la expresión de FAM83A en el cáncer de cuello uterino y en los tejidos normales utilizando GEPIA procediendo a la opción Expression DIY en el sitio web y seleccione Boxplot como tipo de gráfico. Introduzca FAM83A en el campo de parámetros del gen y establezca los siguientes parámetros: |Log2FC| Valor de corte = 1; valor q Punto de corte = 0,01. Seleccione CESE como nombre del cáncer y Coincidir con los datos normales de TCGA para el campo de datos Normal coincidente , dejando todas las demás configuraciones en su valor predeterminado. Haga clic en Plot y permita que el sitio web genere un diagrama de caja que represente la expresión diferencial del gen FAM83A ; Guarde el diagrama de caja para futuras referencias y análisis.
4. Por último, analizar la supervivencia global de pacientes portadoras de tumores con diferentes niveles de expresión de FAM83A en cáncer de cuello uterino. Vaya a la opción Survival Plots en el sitio web, establezca el gen en FAM83A y seleccione Overall Survival como tipo de análisis. Agregue el nombre del tumor CESE, elija Meses para las Unidades del eje y deje todos los demás parámetros en su configuración predeterminada. Haga clic en Trazar y deje que el sitio web genere un gráfico de curva de supervivencia; Guarde este gráfico para futuras referencias y análisis.
5. Tener en cuenta tanto la expresión diferencial de FAM83A en tumores como su correlación con el análisis de supervivencia de las pacientes para identificar FAM83A como un gen diana terapéutica potencial en el cáncer de cuello uterino.

2. Experimentos basados en células

1. Cultivo celular
   1. Cultivo de líneas celulares tumorales humanas en el medio modificado a 37 °C en una atmósfera humidificada con 5% de CO₂ .
      NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre la línea celular y los componentes del medio de cultivo.
2. Transfección celular
   1. Utilice siRNA para reducir la expresión de FAM83A en las células.
      NOTA: Consulte la Tabla 1 para ver la secuencia específica de siRNA.
   2. Células de siembra en placas de 6 pocillos e incubar con la mezcla de 50 nM de si-FAM83A o siRNA-NC y 8 μL de agente de transfección o solo 8 μL de agente de transfección durante 4-6 h después de alcanzar una confluencia del 50%-70%. Agregue solo DMEM sin suero al control negativo.
   3. Después de la incubación, reemplace el medio que contiene el agente de transfección con DMEM + suero fetal para terneros al 10%. Además, 48 h después de la transfección, tratar con 5 μM de cisplatino (DDP) durante 24 h según lo previsto y recolectar todas las células para la extracción de ARN total y el análisis qRT-PCR.

3. Detección de EdU para el ensayo de proliferación celular

NOTA: Utilice el kit de proliferación celular EdU para evaluar la proliferación celular in vitro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

1. Siembre las células en placas de 6 pocillos e incorpórelas con 10 μM de solución de EdU durante 2 h. Fijar las células con paraformaldehído al 4% durante 15 min a temperatura ambiente (RT) y permeabilizar con Triton X-100 al 0,3% en PBS durante 10 min a RT.
2. Retire el tampón de permeabilización y agregue 500 μL de solución de reacción 1x. A continuación, incubar durante 30 minutos a RT en la oscuridad para la tinción nuclear.
3. Tiñir las células con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y visualizarlas bajo un microscopio de fluorescencia con un aumento de 200x. Tiñir los núcleos de las células en proliferación con EdU y examinarlos en busca de fluorescencia roja.
4. Por último, utilice un software para cuantificar los resultados contando al menos 10 campos aleatorios y calcule las tasas de proliferación utilizando la proporción de células fluorescentes positivas con respecto al total de células.

4. Ensayo de cicatrización de heridas

1. Células de siembra en placas de 6 pocillos a una densidad de 2 × 10⁵ celdas por pocillo.
2. Cuando las células alcancen el 90 % de confluencia, utilice una punta de micropipeta estéril de 10 μL para crear suavemente un rasguño lineal en la monocapa celular. Enjuague suavemente los pocillos con PBS estéril para eliminar las células desprendidas y los residuos causados por el rascado.
3. Además, incube las células en un medio que contenga 1% de FBS. Luego, observe y tome imágenes con el microscopio invertido para la curación de la región herida a las 12, 24 y 48 h.

5. Ensayo de inserto de membrana porosa

1. Preparar una suspensión celular en medio de cultivo celular a la concentración celular deseada (que contenga 4 × 10⁴ células), incluidas las células C33a transfectadas o de control y HeLa. Agregue la suspensión celular a la cámara superior de los insertos de membrana, asegurando una distribución uniforme. Agregue medio completo a la cámara inferior.
2. Después de la incubación durante 24 h, utilizar alcohol metílico y violeta cristalino al 0,1% para la fijación y tinción de las células que migran a las cámaras inferiores, respectivamente.
3. Utilice un microscopio invertido para tomar imágenes y, a continuación, analice el número de células migratorias contando al menos 10 campos aleatorios con ImageJ.
   1. Para el análisis de números con ImageJ, abra la imagen en el software ImageJ, vaya a la pestaña Imagen en el menú de herramientas, seleccione Ajustar y luego haga clic en Umbral. Ajuste la configuración del umbral, si es necesario, hasta que solo las celdas sean visibles sobre un fondo blanco.
   2. Haga clic en Aplicar en la ventana Umbral para aplicar esta configuración a la imagen. Ahora, seleccione la herramienta Varita (trazado) de la barra de herramientas (ubicada en la parte superior de la ventana).
   3. Haga clic en el área de la imagen donde se encuentran las celdas para seleccionar todas las celdas de la imagen con umbral. Después de resaltar las celdas, vaya a Analizar en el menú Herramienta y luego haga clic en Analizar partículas. En la ventana Analizar partículas, introduzca el tamaño deseado (p. ej., 0 - infinito) y los valores de circularidad (p. ej., 0,00 - 1,00) de acuerdo con los requisitos experimentales para incluir todas las celdas en el recuento.
   4. Haga clic en Aceptar y espere a que el software cuente las celdas y a que aparezca una nueva ventana con los resultados del análisis.

6. Ensayo de formación de colonias

1. Siembre 2 × 10⁵ células por pocillo de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de 6 pocillos con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM durante 24 h.
2. Después de un período de 24 horas de tratamiento farmacológico, separar las células con tripsina al 0,25% y volver a suspenderlas en el medio Eagle modificado (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de FBS. Siembre las células resuspendidas en una placa de 6 pocillos a una densidad de 1 × 10³ celdas por pocillo, y luego incube en una incubadora de CO₂ al 5% a una temperatura de 37 °C.
3. Después de la incubación durante ~7-10 días cuando las colonias son visibles, fije las células con polioximetileno al 4% y tiña con solución de tinción Giemsa durante 20 minutos.
4. Lave ligeramente las celdas y deje que las placas se sequen al aire. Tome imágenes de los grupos de colonias con el microscopio y cuente el número de colonias que contienen más de 50 células.

7. Análisis de despolarización de la membrana mitocondrial (MMP) con colorante JC-1

1. Siembre 1,2 × 10⁶ células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.
2. Incubar con 1x solución de tinción JC-1 durante 15-20 min bajo 5% de CO₂ a 37 °C utilizando un kit de ensayo de potencial de membrana mitocondrial de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
3. Lave las células y examínelas bajo un microscopio fluorescente a un aumento de 200x utilizando longitudes de onda de excitación y emisión para JC-1 a ~490 nm y 590 nm, respectivamente. Para visualizar la fluorescencia JC-1, utilice los filtros adecuados, como un filtro de excitación azul (450-490 nm) y un filtro de emisión rojo (paso largo > 590 nm) para capturar selectivamente la señal de fluorescencia emitida.

8. Análisis citométrico de flujo de mPTP

1. Siembre 1,2 × 10⁶ células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.
2. Retire el medio de cultivo de las células, vuelva a suspender las células en PBS y agregue 300 μL cada una (1x volumen) de solución de tinción de Calceína AM y solución de trabajo de extinción de fluorescencia para cubrir las células de manera uniforme. Incubar las células a 37 °C en un ambiente protegido de la luz durante 30-45 min, y sustituir el medio por medio de cultivo fresco precalentado a 37 °C. Incubar las células a 37 °C en un ambiente protegido de la luz durante 30 minutos adicionales para asegurar la hidrólisis completa de la Calceína AM por esterasas intracelulares, lo que da como resultado la generación de Calceína verde fluorescente intracelular.
3. Retire el medio de cultivo, lave las células 2-3 veces con PBS y agregue un tampón de detección. Detecte mPTP celular mediante citometría de flujo y una longitud de onda de excitación de 488 nm.

9. Citometría de flujo

1. Siembre 1,2 × 10⁶ células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.
2. Después de 24 h de tratamiento farmacológico, vuelva a suspender las células en 200 μL de solución tampón de unión y mezcle suavemente 10 μL de anexina V-FITC y 5 μL de yoduro de propidio (PI) en la suspensión celular. Incubar la mezcla durante 15 minutos evitando la luz y añadir 300 μL de solución tampón aglutinante a las células. Detecte la apoptosis celular mediante citometría de flujo a una longitud de onda de excitación de 488 nm.

10. Análisis RT-PCR

1. Siembre 1,2 × 10⁶ células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.
2. Extraiga el ARN total de las células tumorales utilizando el reactivo de extracción de ARN y convierta el ARN extraído en ADN complementario (ADNc) con la mezcla de síntesis de ADNc incubando a 42 °C durante 45 min y luego a 95 °C durante 5 min.
3. Prepare la mezcla de reacción de PCR que contiene ADN polimerasa, nucleótidos, tampón y los cebadores específicos del gen diseñados. Añadir la plantilla de ADNc a la mezcla de reacción para la reacción de PCR en tiempo real y realizar la PCR en el instrumento de PCR cuantitativa en tiempo real con las siguientes condiciones de termociclado: desnaturalización a 95 °C durante 30 s, seguida de 40 ciclos de 95 °C durante 5 s y 60 °C durante 30 s, y la etapa de curva de fusión a 95 °C durante 15 s, 60 °C durante 1 min y 95 °C durante 15 s. Cuantificar los niveles de ARNm mediante el método 2^−ΔΔCq utilizando GAPDH como control interno.
   NOTA: El sistema de reacción RT-PCR se muestra en la Tabla 1 y las secuencias de cebadores se muestran en la Tabla 1.
   1. Para calcular el valor 2^−ΔΔCq , mida los valores de Cq para el gen diana y el gen de referencia (GAPDH) en las muestras. Calcule el ΔCq restando el valor de Cq del gen de referencia del valor de Cq del gen objetivo para cada muestra. Calcule el ΔΔCq restando el ΔCq de una muestra de control del ΔCq de cada muestra experimental. Por último, calcula el valor 2^−ΔΔCq elevando 2 a la potencia del valor ΔΔCq.
      NOTA: El valor Cq representa el número de ciclo en el que la señal de fluorescencia alcanza el umbral establecido.

11. Análisis de Western blot

1. Siembre 1,2 × 10⁶ células tumorales de los grupos Si-NC y Si-FAM83A en una placa de seis pocillos y cultivo durante 24 h con o sin tratamiento con cisplatino (DDP) de 5 μM.
2. Recoja las células cultivadas y lávelas con solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada para eliminar cualquier medio de crecimiento o suero residual. Lisar las células utilizando el tampón de lisis RIPA que contiene fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) para liberar las proteínas celulares. Incubar las células en hielo durante unos minutos para asegurar una lisis completa y centrifugar a 4 °C, 12.000 × g durante 15 min. Recoja el sobrenadante para determinar su concentración de proteína.
3. Determine la concentración de proteínas en el lisado celular utilizando un kit de ensayo de proteínas BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezclar el lisado celular con un tampón de carga y calentar la mezcla a 95-100 °C durante 5-10 min para desnaturalizar las proteínas y asegurar una separación uniforme en el gel.
4. De cada muestra, cargue 30 μg de proteína total en un gel SDS-PAGE y haga funcionar el SDS-PAGE a un voltaje constante de 80 V. Detenga la electroforesis cuando el azul de bromofenol llegue al fondo del gel de separación.
5. Transfiera las proteínas separadas del gel a una membrana de difluoruro de polivinilo utilizando un sistema de transferencia húmeda en un baño de hielo con una corriente de 200 mA durante 1,5 h.
6. Bloquear la membrana con leche descremada al 5% en solución salina tamponada con Tris con tampón Tween-20 al 0,05% (TBST) durante 1 h a RT e incubar durante la noche a 4 °C con los anticuerpos respectivos indicados en la Tabla de Materiales.
7. Lavar la membrana varias veces con TBST e incubar con los anticuerpos secundarios (Tabla de Materiales) durante 1 h en RT, seguido de lavado con TBST. Visualice las bandas de proteínas utilizando un kit de detección de quimioluminiscencia mejorado y un sistema de generación de imágenes.

12. Análisis estadístico

1. Como todos los puntos de datos experimentales serán independientes, presente los datos como la media ± DE. Realice análisis estadísticos.
2. Utilice el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para comparaciones múltiples y la prueba de Dunnett para comparar cada grupo con el grupo de control. Utilice la prueba t de Student (dos colas no apareadas) para comparar dos grupos; consideran que P < 0,05 son significativos.

Resultados

Análisis de la base de datos TCGA y validación de PCR

A partir del análisis de la base de datos TCGA, realizamos un análisis comparativo de los niveles de expresión de ARNm en 306 muestras de células de cáncer de cuello uterino y 13 muestras de células normales para investigar la expresión diferencial de FAM83A. FAM83A fue regulado al alza en el cáncer de cuello uterino, mientras que ...

Discusión

La investigación de los genes diana tumorales es de suma importancia tanto para la prevención como para el tratamiento del cáncer de cuello uterino. La comprensión de los genes específicos que desempeñan un papel importante en el desarrollo y la progresión del cáncer de cuello uterino proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la enfermedad. Además, la identificación de estos genes diana puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y terapias dirigidas. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0