Eliminación de FAM83A para verificar su papel en el crecimiento de células de cáncer de cuello uterino y la sensibilidad al cisplatino

Resumen

Aquí, mostramos los procedimientos para el derribo de FAM83A ; los ensayos para detectar sus efectos sobre la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino; y la sensibilización de estas células al cisplatino. Este estudio proporciona un gen diana prometedor para el cáncer de cuello uterino y una referencia para futuras investigaciones farmacológicas.

Resumen

La exploración de los genes diana tumorales es de suma importancia para la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino. En este estudio, describimos los pasos involucrados en la identificación de un gen diana tumoral FAM83A en el cáncer de cuello uterino. En primer lugar, se empleó el conjunto de datos del Atlas del Genoma del Cáncer para validar la expresión y la importancia pronóstica de FAM83A en mujeres. Se utilizó un pequeño ARN interferente (siRNA) para la eliminación del gen FAM83A en las células HeLa y C33a . A continuación, se realizó la tinción con 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) para determinar los efectos sobre la capacidad de proliferación de las células tumorales. Se realizaron ensayos de cicatrización de heridas e inserción de membranas porosas para evaluar la migración de las células tumorales y las capacidades de invasión.

Se utilizó Western blot para cuantificar los niveles de proteínas relacionados con la apoptosis. La tinción con JC-1 se empleó para evaluar las alteraciones de la función mitocondrial. Además, se utilizó la intervención con cisplatino (diaminidicloroplatino, DDP) para evaluar el potencial terapéutico del gen diana. Se realizaron citometrías de flujo y ensayos de formación de colonias para validar aún más las características anticancerosas del gen. Como resultado, se demostró que el knockdown de FAM83A inhibe la proliferación, migración e invasión de las células de cáncer de cuello uterino y sensibiliza a estas células al cisplatino. Estas metodologías integrales validan colectivamente FAM83A como un gen diana asociado a tumores, que es prometedor como una posible diana terapéutica en la prevención y el tratamiento del cáncer de cuello uterino.

Introducción

El cáncer de cuello uterino es una preocupación mundial, ya que es uno de los principales tipos de neoplasias malignas ginecológicas en todo el mundo y es la principal causa de mortalidad relacionada con el cáncer en las mujeres¹. La cirugía radical y la quimiorradioterapia se asocian con altas tasas de curación en la etapa primaria. Sin embargo, los resultados del tratamiento para las pacientes en estadio avanzado de cáncer de cuello uterino que desarrollan enfermedad metastásica son muy desfavorables². Por lo tanto, es crucial comprender mejor los mecanismos biológicos que subyacen a la migración e invasión de las célu....

Protocolo

El estudio se ajustó plenamente a las directrices de publicación proporcionadas por la TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos e instrumentos utilizados en este protocolo.

1. Fuente de datos y análisis bioinformático

1. Obtenga datos de secuenciación de ARN de la base de datos del Atlas del Genoma del Cáncer (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) para el análisis de conglomerados. Utilice GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), una herramienta basada en la web para volver a calcular los d....

Discusión

La investigación de los genes diana tumorales es de suma importancia tanto para la prevención como para el tratamiento del cáncer de cuello uterino. La comprensión de los genes específicos que desempeñan un papel importante en el desarrollo y la progresión del cáncer de cuello uterino proporciona información valiosa sobre los mecanismos moleculares subyacentes de la enfermedad. Además, la identificación de estos genes diana puede conducir al desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas y terapias dirigidas. .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0