הפלת FAM83A כדי לאמת את תפקידו בצמיחת תאי סרטן צוואר הרחם וברגישות לציספלטין

Summary

כאן, אנו מציגים את ההליכים עבור FAM83A knockdown; הבדיקות לאיתור השפעותיו על התפשטות, הגירה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם; ואת הרגישות של תאים אלה כדי cisplatin. מחקר זה מספק גן מטרה מבטיח לסרטן צוואר הרחם והפניה למחקר תרופתי נוסף.

Abstract

חקר גני המטרה של הגידול הוא בעל חשיבות עליונה למניעה וטיפול בסרטן צוואר הרחם. במחקר זה, אנו מתארים את השלבים הכרוכים בזיהוי גן מטרה לגידול FAM83A בסרטן צוואר הרחם. ראשית, מערך הנתונים של אטלס גנום הסרטן שימש כדי לאמת את הביטוי ואת המשמעות הפרוגנוסטית של FAM83A אצל נשים. RNA מפריע קטן (siRNA) שימש להפלה של הגן FAM83A בתאי HeLa ו-C33a . לאחר מכן, 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) צביעה בוצעה כדי לקבוע את ההשפעות על יכולות ההתרבות של תאי הגידול. ריפוי פצעים ובדיקות החדרת קרום נקבובי בוצעו כדי להעריך את נדידת תאי הגידול ואת יכולות הפלישה.

כתם מערבי שימש לכימות רמות חלבון הקשורות לאפופטוזיס. צביעת JC-1 שימשה להערכת שינויים בתפקוד המיטוכונדריה. יתר על כן, נעשה שימוש בהתערבות cisplatin (diaminedichloroplatinum, DDP) כדי להעריך את הפוטנציאל הטיפולי של גן המטרה. בדיקות ציטומטריית זרימה והיווצרות מושבה נערכו כדי לאמת עוד יותר את המאפיינים האנטי-סרטניים של הגן. כתוצאה מכך, הוכח כי FAM83A מעכב התפשטות, נדידה ופלישה של תאי סרטן צוואר הרחם וגורם לרגישות תאים אלה לציספלטין. מתודולוגיות מקיפות אלה מאמתות באופן קולקטיבי את FAM83A כגן מטרה הקשור לגידול, וטומנות בחובן הבטחה כיעד טיפולי פוטנציאלי במניעה ובטיפול בסרטן צוואר הרחם.

Introduction

סרטן צוואר הרחם הוא דאגה עולמית מכיוון שהוא אחד הסוגים המובילים של ממאירות גינקולוגית בעולם והוא הגורם העיקרי לתמותה הקשורה לסרטן בקרב נשים¹. ניתוחים רדיקליים וכימותרפיה קשורים לשיעורי ריפוי גבוהים בשלב הראשוני. עם זאת, תוצאות הטיפול בחולות בשלב מתקדם של סרטן צוואר הרחם המפתחות מחלה גרורתית הן שליליות מאוד². לכן, חיוני להבין עוד יותר את המנגנונים הביולוגיים העומדים בבסיס ההגירה והפלישה של תאי סרטן צוואר הרחם ולזהות מטרות טיפוליות פוטנציאליות למניעה וטיפול במחלה זו.

זיהוי גני מטרה המעורבים בהתקדמות הסרטן ומציאת דרכים לעכב את ביטוים או פעולתם מציגים אפשרויות טיפול מבטיחות. במחקר זה זיהינו את....

Protocol

המחקר תאם לחלוטין את הנחיות הפרסום שסופקו על ידי TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים, הריאגנטים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. ניתוח מקורות נתונים וביואינפורמטיקה

1. קבל נתוני ריצוף RNA ממסד הנתונים של אטלס גנום הסרטן (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) לצורך ניתוח אשכולות. השתמש ב- GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), כלי מבוסס אינטרנט כדי לחשב מחדש נתוני RNA-Seq גולמיים של דגימות מפרויקטים של TCGA, כדי לסנן מטרות לתרופות מועמדות לסרטן עם צינור עיבוד סטנדרטי.
   הערה: אתר האינטרנט של GEPIA זמין באופן חופשי לכל המשתמשים.
....

תוצאות

ניתוח מסדי נתונים TCGA ותיקוף PCR

מניתוח מסד הנתונים של TCGA, ערכנו ניתוח השוואתי של רמות ביטוי mRNA ב-306 דגימות תאי סרטן צוואר הרחם וב-13 דגימות תאים נורמליים כדי לחקור את הביטוי הדיפרנציאלי של FAM83A. FAM83A היה מווסת בסרטן צוואר הרח?.......

Discussion

חקירת גני היעד של הגידול היא בעלת חשיבות עליונה הן למניעה והן לטיפול בסרטן צוואר הרחם. הבנת הגנים הספציפיים הממלאים תפקיד משמעותי בהתפתחות והתקדמות סרטן צוואר הרחם מספקת תובנה חשובה לגבי המנגנונים המולקולריים הבסיסיים של המחלה. יתר על כן, זיהוי גני מטרה אלה יכול להוביל לפיתוח אסטרטגיות ט.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0