Knockdown di FAM83A per verificare il suo ruolo nella crescita delle cellule tumorali cervicali e nella sensibilità al cisplatino

Riepilogo

Qui, mostriamo le procedure per l'abbattimento di FAM83A ; i saggi per rilevare i suoi effetti sulla proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero; e la sensibilizzazione di queste cellule al cisplatino. Questo studio fornisce un promettente gene bersaglio per il cancro cervicale e un riferimento per ulteriori ricerche farmacologiche.

Abstract

L'esplorazione dei geni bersaglio del tumore è di fondamentale importanza per la prevenzione e il trattamento del cancro cervicale. In questo studio, delineiamo i passaggi coinvolti nell'identificazione di un gene bersaglio tumorale FAM83A nel cancro cervicale. In primo luogo, il set di dati Cancer Genome Atlas è stato utilizzato per convalidare l'espressione e il significato prognostico di FAM83A nelle donne. Un piccolo RNA interferente (siRNA) è stato utilizzato per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . Successivamente, è stata condotta la colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) per determinare gli effetti sulle capacità di proliferazione delle cellule tumorali. Sono stati eseguiti saggi di guarigione delle ferite e di inserimento di membrane porose per valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.

Il Western blotting è stato utilizzato per quantificare i livelli proteici correlati all'apoptosi. La colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Inoltre, l'intervento di cisplatino (diamminedicloroplatino, DDP) è stato utilizzato per valutare il potenziale terapeutico del gene bersaglio. Sono stati condotti saggi di citometria a flusso e di formazione di colonie per convalidare ulteriormente le caratteristiche antitumorali del gene. Di conseguenza, è stato dimostrato che il knockdown di FAM83A inibisce la proliferazione, la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali cervicali e sensibilizza queste cellule al cisplatino. Queste metodologie complete convalidano collettivamente FAM83A come gene bersaglio associato al tumore, promettente come potenziale bersaglio terapeutico nella prevenzione e nel trattamento del cancro cervicale.

Introduzione

Il cancro cervicale è una preoccupazione globale in quanto è uno dei principali tipi di neoplasie ginecologiche maligne in tutto il mondo ed è la principale causa di mortalità correlata al cancro nelle donne¹. La chirurgia radicale e la chemioradioterapia sono associate ad alti tassi di guarigione nella fase primaria. Tuttavia, i risultati del trattamento per le pazienti in fase avanzata di carcinoma cervicale che sviluppano una malattia metastatica sono molto sfavorevoli². Pertanto, è fondamentale comprendere ulteriormente i meccanismi biologici alla base della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del collo dell'utero e identificare potenziali bersagli terapeutici per la prevenzione e il trattamento di questa malattia.

L'identificazione dei geni bersaglio coinvolti nella progressione del cancro e la ricerca di modi per inibirne l'espressione o l'azione presentano opzioni terapeutiche promettenti. In questo studio, abbiamo identificato FAM83 come gene cancerogeno e abbiamo ulteriormente studiato i suoi effetti inibitori sulle cellule C33a e HeLa. Gli oncogeni della famiglia FAM83 (FAM83A-H) sono ampiamente riportati nei tumori umani ^3,4. Recentemente, FAM83A è stato segnalato per essere upregolato nei tumori del polmone⁵, della mammella⁶, dell'ovaio⁷ e del pancreas⁸, indicando che FAM83A svolge un ruolo importante nella progressione del cancro attraverso la promozione della proliferazione, dell'invasione, dei tratti simili alle cellule staminali e della resistenza ai farmaci nelle cellule tumorali. È importante sottolineare che FAM83A è stato identificato come uno dei nuovi geni candidati associati alla progressione della lesione cervicale e alla carcinogenesi⁹. Nonostante la conferma di un'elevata espressione di FAM83A nelle cellule tumorali cervicali umane, l'impatto specifico e i meccanismi sottostanti di FAM83A nel cancro cervicale rimangono poco chiari.

In questo studio, delineiamo i protocolli coinvolti nell'identificazione di FAM83A come gene bersaglio del tumore nel cancro cervicale e utilizziamo un piccolo RNA interferente (siRNA) per il knockdown del gene FAM83A nelle cellule HeLa e C33a . La colorazione con 5-etinil-2'-desossiuridina (EdU) è stata eseguita per determinare gli effetti sulla proliferazione delle cellule tumorali, mentre la guarigione delle ferite e i saggi di inserimento della membrana porosa hanno contribuito a valutare la migrazione delle cellule tumorali e le capacità di invasione.

Il Western blotting è stato eseguito per determinare i livelli di proteine correlate all'apoptosi e la colorazione JC-1 è stata impiegata per valutare le alterazioni della funzione mitocondriale. Pertanto, abbiamo riferito che FAM83A svolge un ruolo critico nella proliferazione cellulare, nelle metastasi e nell'invasione nel cancro cervicale. Attraverso la disfunzione mitocondriale e l'apoptosi associate alla via PI3K/AKT, il knockdown di FAM83A ha sensibilizzato le cellule tumorali cervicali al cisplatino (diamminesdicloroplatino, DDP). Questo studio fornisce un nuovo bersaglio per il cancro cervicale e possibilmente altri tumori e un riferimento per lo sviluppo di strategie per superare la resistenza delle cellule tumorali a determinati farmaci chemioterapici.

Protocollo

Lo studio è stato completamente conforme alle linee guida di pubblicazione fornite dal TCGA (https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines). Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

1. Fonte dei dati e analisi bioinformatica

1. Ottieni i dati di sequenziamento dell'RNA dal database Cancer Genome Atlas (TCGA) (https://cancergenome.nih.gov) per l'analisi dei cluster. Utilizzare GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/), uno strumento basato sul web per ricalcolare i dati grezzi RNA-Seq dei campioni provenienti dai progetti TCGA, per lo screening di bersagli di farmaci antitumorali candidati con una pipeline di elaborazione standard.
   NOTA: Il sito web GEPIA è disponibile gratuitamente per tutti gli utenti.
2. Accedere alla home page del sito web GEPIA e fare clic su Analisi del tipo di cancro, selezionare l'opzione Analisi dei geni differenziali e impostare i seguenti parametri: Nome del cancro = CESE (definito come carcinoma a cellule squamose cervicale e adenocarcinoma endocervicale in questa pagina web), |Log2FC| Cutoff = 1, Cutoff del valore q = 0,01, Metodi differenziali = ANOVA e Distribuzione cromosomica = entrambi. Quindi, fare clic su Elenco per ottenere un elenco di geni che mostra l'espressione differenziale tra i gruppi tumorali e normali.
   NOTA: Richiede un'ampia revisione della letteratura per identificare i geni candidati differenzialmente espressi. In questo studio, considerando il background della letteratura disponibile, ci concentriamo sul gene tumorale di interesse, FAM83A.
3. Quindi, esaminare l'espressione di FAM83A nel cancro cervicale e nei tessuti normali utilizzando GEPIA procedendo all'opzione Espressione fai-da-te sul sito Web e selezionare Boxplot come tipo di grafico. Inserire FAM83A nel campo dei parametri del gene e impostare i seguenti parametri: |Log2FC| Valore limite = 1; valore q Cutoff = 0,01. Selezionare CESE come nome del cancro e Corrispondenza dati TCGA normali per il campo dati Normale corrispondente , lasciando tutte le altre impostazioni predefinite. Clicca su Plot e consenti al sito web di generare un boxplot che rappresenti l'espressione differenziale del gene FAM83A ; Salvare il boxplot per riferimento e analisi futuri.
4. Infine, analizzare la sopravvivenza globale di pazienti portatori di tumori con diversi livelli di espressione di FAM83A nel carcinoma cervicale. Passare all'opzione Grafici di sopravvivenza sul sito Web, impostare il gene su FAM83A e selezionare Sopravvivenza globale come tipo di analisi. Aggiungere il nome del tumore CESE, scegliere Mesi per le unità dell'asse e lasciare tutti gli altri parametri alle impostazioni predefinite. Fai clic su Traccia e lascia che il sito Web generi un grafico della curva di sopravvivenza; Salvare questo grafico per riferimento e analisi future.
5. Prendere in considerazione sia l'espressione differenziale di FAM83A nei tumori che la sua correlazione con l'analisi della sopravvivenza dei pazienti per identificare FAM83A come potenziale gene bersaglio terapeutico nel cancro cervicale.

2. Esperimenti basati su cellule

1. Colture cellulari
   1. Coltura di linee cellulari tumorali umane nel terreno modificato a 37 °C in un'atmosfera umidificata al 5% di CO₂ .
      NOTA: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per le informazioni sulla linea cellulare e i componenti del terreno di coltura.
2. Trasfezione cellulare
   1. Usa il siRNA per abbattere l'espressione di FAM83A nelle cellule.
      NOTA: Vedere la Tabella 1 per la sequenza specifica di siRNA.
   2. Cellule seme in piastre a 6 pozzetti e incubare con la miscela di 50 nM si-FAM83A o siRNA-NC e 8 μL di agente di trasfezione o solo 8 μL di agente di trasfezione per 4-6 ore dopo aver raggiunto il 50%-70% di confluenza. Aggiungere solo DMEM senza siero al controllo negativo.
   3. Dopo l'incubazione, sostituire il terreno contenente l'agente di trasfezione con DMEM + 10% di siero fetale di vitello. Inoltre, 48 ore dopo la trasfezione, trattare con 5 μM di cisplatino (DDP) per 24 ore come previsto e prelevare tutte le cellule per l'estrazione dell'RNA totale e l'analisi qRT-PCR.

3. Rilevamento di EdU per il saggio di proliferazione cellulare

NOTA: Utilizzare il kit di proliferazione cellulare EdU per valutare la proliferazione cellulare in vitro secondo le istruzioni del produttore.

1. Seminare le cellule in piastre a 6 pozzetti e incubarle con una soluzione di EdU da 10 μM per 2 ore. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 10 minuti a RT.
2. Rimuovere il tampone di permeabilizzazione e aggiungere 500 μL di soluzione di reazione 1x. Quindi, incubare per 30 minuti a RT al buio per la colorazione nucleare.
3. Colorare le cellule con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) e visualizzarle al microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 200x. Colorare i nuclei delle cellule proliferanti con EdU ed esaminarli per la fluorescenza rossa.
4. Infine, utilizzare un software per quantificare i risultati contando almeno 10 campi casuali e calcolare i tassi di proliferazione utilizzando il rapporto tra le cellule fluorescenti-positive e le cellule totali.

4. Saggio di guarigione delle ferite

1. Cellule seme in piastre a 6 pozzetti a una densità di 2 × 10⁵ cellule per pozzetto.
2. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, utilizzare un puntale sterile per micropipette da 10 μL per creare delicatamente un graffio lineare nel monostrato cellulare. Sciacquare delicatamente i pozzetti con PBS sterile per rimuovere eventuali cellule staccate e detriti causati da graffi.
3. Inoltre, incubare le cellule in un terreno contenente l'1% di FBS. Quindi, osserva e scatta immagini con il microscopio invertito per la guarigione della regione ferita a 12, 24 e 48 ore.

5. Saggio dell'inserto a membrana porosa

1. Preparare una sospensione cellulare in terreno di coltura cellulare alla concentrazione cellulare desiderata (contenente 4 × 10⁴ cellule), comprese le cellule C33a trasfettate o di controllo e l'HeLa. Aggiungere la sospensione cellulare nella camera superiore degli inserti a membrana, garantendo una distribuzione uniforme. Aggiungere il terreno completo nella camera inferiore.
2. Dopo un'incubazione di 24 ore, utilizzare alcol metilico e violetto cristallino allo 0,1% per la fissazione e la colorazione delle cellule che migrano rispettivamente nelle camere inferiori.
3. Usa un microscopio invertito per scattare immagini e quindi analizzare il numero di cellule che migrano contando almeno 10 campi casuali con ImageJ.
   1. Per l'analisi dei numeri con ImageJ, aprire l'immagine nel software ImageJ, andare alla scheda Immagine nel menu degli strumenti, selezionare Regola, quindi fare clic su Soglia. Regolare le impostazioni di soglia, se necessario, fino a quando solo le celle sono visibili su uno sfondo bianco.
   2. Fare clic su Applica nella finestra Soglia per applicare queste impostazioni all'immagine. Ora, seleziona lo strumento Bacchetta (tracciamento) dalla barra degli strumenti (situata nella parte superiore della finestra).
   3. Fare clic sull'area dell'immagine in cui si trovano le celle per selezionare tutte le celle dell'immagine con soglia. Dopo aver evidenziato le celle, vai su Analizza nel menu Strumenti, quindi fai clic su Analizza particelle. Nella finestra Analizza particelle, immettere la dimensione desiderata (ad esempio, 0 - infinito) e i valori di circolarità (ad esempio, 0,00 - 1,00) in base ai requisiti sperimentali per includere tutte le celle nel conteggio.
   4. Fare clic su OK e attendere che il software conti le celle e che venga visualizzata una nuova finestra con i risultati dell'analisi.

6. Saggio di formazione delle colonie

1. Seme 2 × 10⁵ cellule per pozzetto di gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a 6 pozzetti con o senza trattamento con cisplatino (DDP) 5 μM per 24 ore.
2. Dopo un periodo di 24 ore di trattamento farmacologico, staccare le cellule utilizzando tripsina allo 0,25% e risospenderle nel terreno Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) contenente il 10% di FBS. Seminare le cellule risospese in una piastra a 6 pozzetti con una densità di 1 × 10³ cellule per pozzetto, quindi incubare in un incubatore al 5% di CO₂ a una temperatura di 37 °C.
3. Dopo l'incubazione per ~7-10 giorni quando le colonie sono visibili, fissare le cellule con poliossimetilene al 4% e colorarle con la soluzione colorante Giemsa per 20 minuti.
4. Lavare leggermente le celle e lasciare asciugare le piastre all'aria. Scatta immagini degli ammassi di colonie al microscopio e conta il numero di colonie che contengono più di 50 cellule.

7. Analisi della depolarizzazione della membrana mitocondriale (MMP) utilizzando il colorante JC-1

1. Seme 1,2 × 10⁶ cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
2. Incubare con 1x soluzione colorante JC-1 per 15-20 minuti al 5% di CO₂ a 37 °C utilizzando un kit per il saggio del potenziale di membrana mitocondriale secondo le istruzioni del produttore.
3. Lavare le cellule ed esaminarle al microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 200x utilizzando le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione per JC-1 rispettivamente a ~490 nm e 590 nm. Per visualizzare la fluorescenza JC-1, utilizzare filtri appropriati, come un filtro di eccitazione blu (450-490 nm) e un filtro di emissione rosso (> passa-lungo 590 nm) per catturare selettivamente il segnale di fluorescenza emesso.

8. Analisi citofluorimetrica di mPTP

1. Seme 1,2 × 10⁶ cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
2. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, risospendere le cellule in PBS e aggiungere 300 μL ciascuna (1x volume) di soluzione di colorazione Calcein AM e soluzione di lavoro di quenching fluorescente per coprire uniformemente le cellule. Incubare le cellule a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce per 30-45 minuti e sostituire il terreno con terreno di coltura fresco preriscaldato a 37 °C. Incubare le cellule a 37 °C in un ambiente protetto dalla luce per altri 30 minuti per garantire la completa idrolisi della Calceina AM da parte delle esterasi intracellulari, con conseguente generazione di Calceina intracellulare verde-fluorescente.
3. Rimuovere il terreno di coltura, lavare le cellule 2-3 volte con PBS e aggiungere il tampone di rilevamento. Rileva l'mPTP cellulare utilizzando la citometria a flusso e una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm.

9. Citometria a flusso

1. Seme 1,2 × 10⁶ cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
2. Dopo 24 ore di trattamento farmacologico, sospendere nuovamente le cellule in 200 μL di soluzione tampone legante e mescolare delicatamente 10 μL di annessina V-FITC e 5 μL di ioduro di propidio (PI) nella sospensione cellulare. Incubare la miscela per 15 minuti evitando la luce e aggiungere 300 μL di soluzione tampone legante alle cellule. Rilevare l'apoptosi cellulare utilizzando la citometria a flusso a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nm.

10. Analisi RT-PCR

1. Seme 1,2 × 10⁶ cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
2. Estrarre l'RNA totale dalle cellule tumorali utilizzando il reagente di estrazione dell'RNA e convertire l'RNA estratto in DNA complementare (cDNA) con la miscela di sintesi del cDNA incubando a 42 °C per 45 minuti e poi a 95 °C per 5 minuti.
3. Preparare la miscela di reazione PCR contenente DNA polimerasi, nucleotidi, tampone e primer gene-specifici progettati. Aggiungere il modello di cDNA alla miscela di reazione per la reazione di PCR in tempo reale ed eseguire la PCR sullo strumento di PCR quantitativa in tempo reale con le seguenti condizioni di ciclo termico: denaturazione a 95 °C per 30 s, seguita da 40 cicli di 95 °C per 5 s e 60 °C per 30 s, e la fase della curva di fusione a 95 °C per 15 s, 60 °C per 1 min e 95 °C per 15 s. Quantificare i livelli di mRNA utilizzando il metodo 2^−ΔΔCq utilizzando GAPDH come controllo interno.
   NOTA: Il sistema di reazione RT-PCR è mostrato nella Tabella 1 e le sequenze di primer sono mostrate nella Tabella 1.
   1. Per calcolare il valore 2^−ΔΔCq , misurare i valori di Cq per il gene bersaglio e il gene di riferimento (GAPDH) nei campioni. Calcolare il ΔCq sottraendo il valore Cq del gene di riferimento dal valore Cq del gene bersaglio per ciascun campione. Calcolare il ΔΔCq sottraendo il ΔCq di un campione di controllo dal ΔCq di ciascun campione sperimentale. Infine, calcolare il valore 2^−ΔΔCq elevando 2 alla potenza del valore ΔΔCq.
      NOTA: Il valore Cq rappresenta il numero di ciclo in corrispondenza del quale il segnale di fluorescenza raggiunge la soglia impostata.

11. Analisi Western blot

1. Seme 1,2 × 10⁶ cellule tumorali dei gruppi Si-NC e Si-FAM83A in una piastra a sei pozzetti e coltura per 24 ore con o senza trattamento con cisplatino (DDP) da 5 μM.
2. Raccogliere le cellule in coltura e lavarle con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS) per rimuovere eventuali residui di terreno di crescita o siero. Lisare le cellule utilizzando il tampone di lisi RIPA contenente fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) per rilasciare le proteine cellulari. Incubare le cellule su ghiaccio per alcuni minuti per garantire una lisi completa e centrifugare a 4 °C, 12.000 × g per 15 min. Raccogliere il surnatante per determinarne la concentrazione proteica.
3. Determinare la concentrazione proteica nel lisato cellulare utilizzando un kit di analisi delle proteine BCA secondo le istruzioni del produttore. Miscelare il lisato cellulare con un tampone di carico e riscaldare la miscela a 95-100 °C per 5-10 minuti per denaturare le proteine e garantire una separazione uniforme sul gel.
4. Da ciascun campione, caricare 30 μg di proteina totale su un gel SDS-PAGE e far funzionare l'SDS-PAGE a una tensione costante di 80 V. Interrompere l'elettroforesi quando il blu di bromofenolo raggiunge il fondo del gel di separazione.
5. Trasferire le proteine separate dal gel su una membrana di polivinildifluoruro utilizzando un sistema di trasferimento a umido su un bagno di ghiaccio con una corrente di 200 mA per 1,5 h.
6. Bloccare la membrana con latte scremato al 5% in soluzione salina tamponata Tris con tampone Tween-20 allo 0,05% (TBST) per 1 ora a RT e incubare per una notte a 4 °C con i rispettivi anticorpi indicati nella tabella dei materiali.
7. Lavare la membrana più volte con TBST e incubare con gli anticorpi secondari (Tabella dei materiali) per 1 ora a RT, seguita dal lavaggio con TBST. Visualizza le bande proteiche utilizzando un kit di rilevamento della chemiluminescenza avanzato e un sistema imager.

12. Analisi statistica

1. Poiché tutti i dati sperimentali saranno indipendenti, presentare i dati come media ± DS. Eseguire un'analisi statistica.
2. Utilizzare l'analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) per confronti multipli e il test di Dunnett per confrontare ciascun gruppo con il gruppo di controllo. Utilizzare il test t di Student (a due code non accoppiato) per confrontare due gruppi; considerare significativo P < 0,05.

Risultati

Analisi del database TCGA e validazione PCR

Dall'analisi del database TCGA, abbiamo condotto un'analisi comparativa dei livelli di espressione dell'mRNA in 306 campioni di cellule di cancro cervicale e 13 campioni di cellule normali per studiare l'espressione differenziale di FAM83A. FAM83A è stato sovraregolato nel cancro cervicale, mentre la sua espressione nel tessuto cervicale normale era ...

Discussione

Lo studio dei geni bersaglio del tumore è della massima importanza sia per la prevenzione che per il trattamento del cancro cervicale. La comprensione dei geni specifici che svolgono un ruolo significativo nello sviluppo e nella progressione del cancro cervicale fornisce preziose informazioni sui meccanismi molecolari alla base della malattia. Inoltre, l'identificazione di questi geni bersaglio può portare allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche e terapie mirate. In questo studio, descriviamo l'uso dell'analisi d...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0