자궁경부암 세포 성장 및 시스플라틴 감수성에서의 역할을 검증하기 위한 FAM83A 의 녹다운

요약

여기에서는 FAM83A 녹다운 절차를 보여줍니다. 자궁경부암 세포의 증식, 이동 및 침입에 대한 효과를 감지하기 위한 분석; 그리고 이 세포들이 시스플라틴에 감작됩니다. 이 연구는 자궁경부암에 대한 유망한 표적 유전자와 추가 약물 연구를 위한 참고 자료를 제공합니다.

초록

종양 표적 유전자의 탐색은 자궁경부암의 예방과 치료에 가장 중요합니다. 이 연구에서는 자궁경부암에서 종양 표적 유전자 FAM83A의 식별과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다. 첫째, 여성에서 FAM83A의 발현과 예후의 중요성을 검증하기 위해 Cancer Genome Atlas 데이터 세트를 사용했습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)는 HeLa 및 C33a 세포에서 FAM83A 유전자의 녹다운에 사용되었습니다. 다음으로, 종양 세포의 증식 능력에 미치는 영향을 확인하기 위해 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 염색을 수행했습니다. 종양 세포 이동 및 침습 능력을 평가하기 위해 상처 치유 및 다공성 막 삽입 분석을 수행했습니다.

웨스턴 블로팅(Western blotting)은 세포사멸 관련 단백질 수준을 정량화하는 데 사용되었습니다. JC-1 염색은 미토콘드리아 기능 변화를 평가하기 위해 사용되었습니다. 또한, 시스플라틴(디아민디클로로플래티넘, DDP) 중재를 사용하여 표적 유전자의 치료 가능성을 평가했습니다. 유전자의 항암 특성을 추가로 검증하기 위해 유세포 분석 및 콜로니 형성 분석을 수행했습니다. 그 결과, FAM83A 녹다운은 자궁경부암 세포의 증식, 이동 및 침습을 억제하고 이 세포를 시스플라틴에 감작시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 포괄적인 방법론은 FAM83A 를 종양 관련 표적 유전자로 총체적으로 검증하여 자궁경부암 예방 및 치료의 잠재적 치료 표적으로서의 가능성을 제시합니다.

서문

자궁경부암은 전 세계적으로 부인과 악성 종양의 주요 유형 중 하나이며 여성의 암 관련 사망률의 주요 원인이기 때문에 전 세계적인 관심사입니다¹. 근치적 수술과 화학방사선 요법은 1차 단계에서 높은 완치율과 관련이 있습니다. 그러나 자궁경부암이 진행된 환자에서 전이성 질환이 발생한 환자의 치료 결과는 매우 좋지 않다². 따라서 자궁경부암 세포의 이동과 침습의 기저에 있는 생물학적 메커니즘을 더 깊이 이해하고 이 질병의 예방 및 치료를 위한 잠재적인 치료 표적을 식별하는 것이 중요합니다.

암 진행에 관여하는 표적 유전자를 확인하고 그 발현이나 작용을 억제하는 방법을 찾는 것은 유망한 치료 옵션을 제시합니다. 이 연구에서 우리는 FAM83을 암 유발 유전자로 확인하고 C33a 및 HeLa 세포에 대한 억제 효과를 추가로 조사했습니다. FAM83 계열 종양유전자(FAM83A-H)는 인간 암에서 널리 보고되고 있다 ^3,4. 최근 FAM83A는 폐⁵암,^{유방 암},^{난소 암 7}암,^{췌장 8}암에서 상향 조절되는 것으로 보고되었으며, 이는 FAM83A가 종양 세포의 증식, 침습, 줄기세포 유사 형질 및 약물 내성을 촉진하여 암 진행에 중요한 역할을 한다는 것을 나타냅니다. 중요한 것은 FAM83A가 자궁경부 병변 진행 및 발암과 관련된 새로운 후보 유전자 중 하나로 확인되었다는 점이다⁹. 인간 자궁경부암 세포에서 FAM83A 발현이 증가한 것으로 확인되었음에도 불구하고, 자궁경부암에서 FAM83A의 구체적인 영향과 기전은 여전히 불분명하다.

이 연구에서는 자궁경부암에서 FAM83A를 종양 표적 유전자로 식별하는 데 관련된 프로토콜을 간략하게 설명하고 HeLa 및 C33a 세포에서 FAM83A 유전자의 녹다운을 위해 작은 간섭 RNA(siRNA)를 사용합니다. 종양 세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 염색을 수행했으며, 상처 치유 및 다공성 막 삽입 분석은 종양 세포 이동 및 침습 능력을 평가하는 데 도움이 되었습니다.

세포사멸 관련 단백질의 수준을 측정하기 위해 웨스턴 블로팅을 수행하고, 미토콘드리아 기능 변화를 평가하기 위해 JC-1 염색을 사용했습니다. 따라서 FAM83A 가 자궁경부암의 세포 증식, 전이 및 침범에 중요한 역할을 한다고 보고했습니다. PI3K/AKT 경로 관련 미토콘드리아 기능 장애 및 세포사멸을 통해 FAM83A 녹다운은 자궁경부암 세포를 시스플라틴(디아민디클로로플래티넘, DDP)에 감작시켰습니다. 이 연구는 자궁경부암 및 기타 암에 대한 새로운 표적과 특정 화학 요법 약물에 대한 암세포의 내성을 극복하기 위한 전략 개발을 위한 참고 자료를 제공합니다.

프로토콜

이 연구는 TCGA(https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines)에서 제공한 출판 지침을 완전히 준수했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 데이터 소스 및 생물정보학 분석

1. 클러스터 분석을 위해 TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터베이스(https://cancergenome.nih.gov)에서 RNA 염기서열 분석 데이터를 얻습니다. 웹 기반 도구인 GERPA(http://gepia.cancer-pku.cn/)를 사용하여 TCGA 프로젝트 샘플의 원시 RNA-Seq 데이터를 다시 계산하고 표준 처리 파이프라인으로 후보 항암제 표적을 스크리닝합니다.
   참고: GEPIA 웹사이트는 모든 사용자가 무료로 사용할 수 있습니다.
2. GEPIA 웹사이트 홈페이지에 접속하여 Cancer Type Analysis(암 유형 분석)를 클릭하고, Differential gene analysis(감별 유전자 분석 ) 옵션을 선택하고, 다음 매개변수를 설정합니다. 암 이름 = CESE (이 웹페이지에서 Cervical squamous cell carcinoma 및 endocervical adenocarcinoma 로 정의됨), |로그2FC| 컷오프 = 1, q-값 컷오프 = 0.01, 미분 방법 = ANOVA, 염색 체 분포 = 둘 다. 그런 다음 목록을 클릭하여 종양과 정상 그룹 간의 차이 발현을 보여주는 유전자 목록을 얻습니다.
   참고: 차등적으로 발현된 후보 유전자를 식별하기 위해서는 광범위한 문헌 검토가 필요합니다. 이 연구에서는 이용 가능한 문헌의 배경을 고려하여 관심 종양 유전자인 FAM83A에 초점을 맞춥니다.
3. 그런 다음 웹 사이트의 Expression DIY 옵션으로 이동하여 GEPIA를 사용하여 자궁경부암 및 정상 조직에서 FAM83A의 발현을 조사하고 차트 유형으로 Boxplot을 선택합니다. 유전자 매개변수 필드에 FAM83A를 입력하고 다음 매개변수를 설정합니다.로그2FC| 컷오프 값 = 1; q-값 구분값 = 0.01. 암 이름으로 CESE를 선택하고 Matched Normal data(정상 일치 데이터) 필드에 대해 Match TCGA normal data(TCGA 정상 데이터 일치)를 선택하고 다른 모든 설정은 기본값으로 둡니다. 플롯을 클릭하고 웹사이트가 FAM83A 유전자의 차등 발현을 나타내는 상자 그림을 생성하도록 합니다. 나중에 참조하고 분석할 수 있도록 상자 그림을 저장합니다.
4. 마지막으로, 자궁경부암에서 다양한 수준의 FAM83A 발현을 가진 종양 보유 환자의 전체 생존을 분석합니다. 웹 사이트에서 Survival Plot(생존 플롯) 옵션으로 이동하여 Gene(유전자)을 FAM83A로 설정하고 분석 유형으로 Overall Survival(전체 생존)을 선택합니다. 종양 이름 CESE를 추가하고, 축 단위에 대해 Months를 선택하고, 다른 모든 매개변수는 기본 설정으로 둡니다. 플롯을 클릭하고 웹 사이트에서 생존 곡선 차트를 생성하도록 합니다. 나중에 참조하고 분석할 수 있도록 이 차트를 저장하십시오.
5. 종양에서 FAM83A 의 차등 발현과 환자 생존 분석과의 상관관계를 모두 고려하여 FAM83A 를 자궁경부암의 잠재적 치료 표적 유전자로 식별합니다.

2. 세포 기반 실험

1. 세포 배양
   1. 가습된 5%_CO2 분위기에서 37°C의 변형된 배지에서 인간 종양 세포주를 배양합니다.
      참고: 세포주 정보 및 배양 배지 구성 요소에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
2. 세포 transfection
   1. siRNA를 사용하여 세포에서 FAM83A 발현을 knock down합니다.
      참고: 특정 siRNA 염기서열에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.
   2. 6-웰 플레이트에 세포를 파종하고 50%-70% 밀도를 달성한 후 50nM si-FAM83A 또는 siRNA-NC와 8μL의 transfection agent 또는 8μL의 transfection agent만 혼합하여 4-6시간 동안 배양합니다. 무혈청 DMEM만 음성 대조군에 추가하십시오.
   3. 배양 후 형질주입제가 함유된 배지를 DMEM + 10% 태아 송아지 혈청으로 교체합니다. 또한, transfection 48시간 후 의도한 대로 24시간 동안 5μM 시스플라틴(DDP)으로 처리하고 전체 RNA 추출 및 qRT-PCR 분석을 위해 모든 세포를 수확합니다.

3. 세포 증식 분석을 위한 EdU 검출

참고: EdU 세포 증식 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 체외 세포 증식을 평가하십시오.

1. 세포를 6웰 플레이트에 시드하고 10μM EdU 용액으로 2시간 동안 배양합니다. 실온(RT)에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고 RT에서 10분 동안 PBS에서 0.3% Triton X-100으로 투과시킵니다.
2. 투과화 완충액을 제거하고 500μL의 1x 반응 용액을 추가합니다. 그런 다음 핵 염색을 위해 어두운 곳에서 RT에서 30분 동안 배양합니다.
3. 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)로 세포를 염색하고 형광 현미경으로 200x 배율로 시각화합니다. 증식하는 세포의 핵을 EdU로 염색하고 적색 형광을 검사합니다.
4. 마지막으로, 소프트웨어를 사용하여 최소 10개의 무작위 필드를 계산하여 결과를 정량화하고 전체 세포에 대한 형광 양성 세포의 비율을 사용하여 증식 속도를 계산합니다.

4. 상처 치유 분석

1. 6웰 플레이트에 2 × 10 웰당⁵ 개의 세포를 시드합니다.
2. 세포가 90%의 밀도에 도달하면 멸균 10μL 마이크로피펫 팁을 사용하여 세포 단층에 선형 스크래치를 부드럽게 만듭니다. 멸균 PBS로 웰을 부드럽게 헹구어 긁힘으로 인한 분리된 세포와 파편을 제거합니다.
3. 또한, 1 % FBS를 함유 한 배지에서 세포를 배양합니다. 그런 다음 12시간, 24시간, 48시간에 상처 부위가 치유되는 것을 도립 현미경으로 관찰하고 이미지를 촬영합니다.

5. 다공성 멤브레인 삽입 분석

1. 형질주입 또는 대조군 C33a 세포 및 HeLa를 포함하여 원하는 세포 농도(4 × 10⁴ 세포 포함)에서 세포 배양 배지에서 세포 현탁액을 준비합니다. 멤브레인 인서트의 상단 챔버에 셀 현탁액을 추가하여 균일한 분포를 보장합니다. 하부 챔버에 완전한 배지를 추가합니다.
2. 24시간 동안 배양한 후 메틸 알코올과 0.1% 크리스탈 바이올렛을 사용하여 각각 하부 챔버로 이동하는 세포의 고정 및 염색을 수행합니다.
3. 도립 현미경을 사용하여 이미지를 촬영한 다음 ImageJ로 최소 10개의 무작위 필드를 계산하여 이동하는 세포의 수를 분석합니다.
   1. ImageJ를 사용한 숫자 분석의 경우 ImageJ 소프트웨어에서 이미지를 열고 도구 메뉴의 이미지 탭으로 이동하여 조정을 선택한 다음 임계값을 클릭합니다. 필요한 경우 흰색 배경에 셀만 표시될 때까지 임계값 설정을 조정합니다.
   2. 임계값 창에서 적용을 클릭하여 이러한 설정을 이미지에 적용합니다. 이제 도구 모음(창 상단에 있음)에서 Wand(추적) 도구를 선택합니다.
   3. 셀이 있는 이미지 영역을 클릭하여 임계값이 적용된 이미지의 모든 셀을 선택합니다. 셀이 강조 표시되면 Tool 메뉴에서 Analyze로 이동한 다음 Analyze Particles를 클릭합니다. 파티클 분석 창에서 실험 요구 사항에 따라 원하는 크기(예: 0 - 무한대)와 원형도 값(예: 0.00 - 1.00)을 입력하여 모든 셀을 카운트에 포함합니다.
   4. 확인을 클릭하고 소프트웨어가 셀 수를 계산하고 분석 결과와 함께 새 창이 나타날 때까지 기다립니다.

6. 콜로니 형성 분석

1. 시드 2 × 5 μM 시스플라틴 (DDP) 처리 유무에 관계없이 6 웰 플레이트에서 Si-NC 및 Si-FAM83A 그룹의 웰 당 2⁵ 세포를 24 시간 동안 시드합니다.
2. 약물 치료의 24 시간 기간 후, 0.25 % 트립신을 사용하여 세포를 분리하고 10 % FBS를 함유 한 Dulbecco의 변형 된 독수리 배지 (DMEM)에서 재현탁시킵니다. 웰당 1 × 10³ 세포의 밀도로 6웰 플레이트에 재현탁 세포를 시드한 다음 37°C의 온도에서 5%_CO2 인큐베이터에서 배양합니다.
3. 콜로니가 보이는 ~7-10일 동안 배양 한 후 4% 폴리옥시메틸렌으로 세포를 고정하고 20분 동안 Giemsa 염색액으로 염색합니다.
4. 세포를 약간 씻고 플레이트를 자연 건조시킵니다. 현미경으로 콜로니 클러스터의 이미지를 촬영하고 50개 이상의 세포를 포함하는 콜로니의 수를 계산합니다.

7. JC-1 염료를 이용한 미토콘드리아 막 탈분극(MMP) 분석

1. Si-NC 및 Si-FAM83A의 1.2 × 10⁶개의 종양 세포를 6웰 플레이트로 파종하고 5μM 시스플라틴(DDP) 처리 유무에 관계없이 24시간 동안 배양합니다.
2. 제조업체의 지침에 따라 미토콘드리아 막 전위 분석 키트를 사용하여 37°C에서 5%_CO2 하에서 15-20분 동안 1x JC-1 염색 용액으로 배양합니다.
3. 세포를 세척하고 각각 ~490nm 및 590nm에서 JC-1에 대한 여기 및 방출 파장을 사용하여 200x 배율로 형광 현미경으로 검사합니다. JC-1 형광을 시각화하려면 청색 여기 필터(450-490nm) 및 적색 방출 필터(장역 통과 > 590nm)와 같은 적절한 필터를 사용하여 방출된 형광 신호를 선택적으로 캡처합니다.

8. mPTP의 유세포 분석

1. Si-NC 및 Si-FAM83A의 1.2 × 10⁶개의 종양 세포를 6웰 플레이트로 파종하고 5μM 시스플라틴(DDP) 처리 유무에 관계없이 24시간 동안 배양합니다.
2. 세포에서 배양 배지를 제거하고 PBS에 세포를 재현탁시킨 다음 Calcein AM 염색 용액과 형광 소멸 작업 용액을 각각 300μL(1x 부피)로 추가하여 세포를 고르게 덮습니다. 37°C에서 30-45분 동안 빛이 차단된 환경에서 세포를 배양하고 배지를 37°C에서 예열된 신선한 배양 배지로 교체합니다. 세포를 37°C에서 30분 동안 빛이 차단된 환경에서 추가로 30분 동안 배양하여 세포 내 에스테라아제에 의한 Calcein AM의 완전한 가수분해를 보장하여 세포 내 녹색 형광 Calcein을 생성합니다.
3. 배양 배지를 제거하고 PBS로 세포를 2-3배 세척한 다음 검출 완충액을 추가합니다. 유세포 분석과 488nm의 여기 파장을 사용하여 세포 mPTP를 검출합니다.

9. 유세포 분석

1. Si-NC 및 Si-FAM83A의 1.2 × 10⁶개의 종양 세포를 6웰 플레이트로 파종하고 5μM 시스플라틴(DDP) 처리 유무에 관계없이 24시간 동안 배양합니다.
2. 24시간의 약물 처리 후 200μL의 결합 완충 용액에 세포를 다시 현탁시키고 10μL의 Annexin V-FITC와 5μL의 요오드화 프로피듐(PI)을 세포 현탁액에 부드럽게 혼합합니다. 빛을 피하면서 혼합물을 15분 동안 배양하고 300μL의 결합 완충 용액을 세포에 추가합니다. 488nm의 여기 파장에서 유세포 분석을 사용하여 세포 사멸을 검출합니다.

10. RT-PCR 분석

1. Si-NC 및 Si-FAM83A의 1.2 × 10⁶개의 종양 세포를 6웰 플레이트로 파종하고 5μM 시스플라틴(DDP) 처리 유무에 관계없이 24시간 동안 배양합니다.
2. RNA 추출 시약을 사용하여 종양 세포에서 전체 RNA를 추출하고 추출된 RNA를 cDNA Synthesis Mix를 사용하여 42°C에서 45분 동안 배양한 다음 95°C에서 5분 동안 배양하여 상보적 DNA(cDNA)로 변환합니다.
3. DNA 중합효소, 뉴클레오티드, 완충액 및 설계된 유전자 특이적 프라이머를 포함하는 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. Real-Time PCR 반응을 위한 반응 혼합물에 cDNA 템플릿을 첨가하고 다음과 같은 열순환 조건에서 Real-Time 정량적 PCR 기기에서 PCR을 수행합니다: 95°C에서 30초 동안 변성, 이어서 5초 동안 95°C 및 30초 동안 60°C의 40 사이클, 95°C에서 15초 동안 용융 곡선 단계, 60°C에서 1분, 95°C에서 15초 동안 GAPDH를 내부 대조군으로 사용하는 2^−ΔΔCq 분석법을 사용하여 mRNA 수준을 정량화합니다.
   참고: RT-PCR 반응 시스템은 표 1에 나와 있으며 프라이머 염기서열은 표 1에 나와 있습니다.
   1. 2^−ΔΔCq 값을 계산하려면 샘플에서 표적 유전자 및 참조 유전자(GAPDH)에 대한 Cq 값을 측정합니다. 각 샘플에 대한 표적 유전자의 Cq 값에서 참조 유전자의 Cq 값을 빼서 ΔCq를 계산합니다. 각 실험 샘플의 ΔCq에서 대조 샘플의 ΔCq를 빼서 ΔΔCq를 계산합니다. 마지막으로 2를 ΔΔCq 값의 거듭제곱으로 올려 2^−ΔΔCq 값을 계산합니다.
      알림: Cq 값은 형광 신호가 설정된 임계값에 도달하는 사이클 번호를 나타냅니다.

11. 웨스턴 블롯 분석

1. Si-NC 및 Si-FAM83A의 1.2 × 10⁶개의 종양 세포를 6웰 플레이트로 파종하고 5μM 시스플라틴(DDP) 처리 유무에 관계없이 24시간 동안 배양합니다.
2. 배양된 세포를 수집하고 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 잔류 성장 배지 또는 혈청을 제거합니다. 세포 단백질을 방출하기 위해 페닐메틸 설포닐 플루오라이드(PMSF)를 함유한 RIPA 용해 완충액을 사용하여 세포를 용해합니다. 완전히 용해되도록 얼음 위에서 몇 분 동안 세포를 배양하고 4°C, 12,000× g 에서 15분 동안 원심분리합니다. 단백질 농도를 결정하기 위해 상층액을 수집합니다.
3. 제조업체의 지침에 따라 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 세포 용해물의 단백질 농도를 측정합니다. 세포 용해물을 로딩 버퍼와 혼합하고 혼합물을 95-100°C에서 5-10분 동안 가열하여 단백질을 변성시키고 겔에서 균일하게 분리되도록 합니다.
4. 각 샘플에서 총 단백질 30μg을 SDS-PAGE 겔에 로드하고 80V의 일정한 전압에서 SDS-PAGE를 실행합니다. 브로모페놀 블루가 분리 겔의 바닥에 도달하면 전기영동을 중지합니다.
5. 겔에서 분리된 단백질을 1.5시간 동안 200mA의 전류로 얼음 수조에서 습식 전달 시스템을 사용하여 폴리비닐디플루오라이드 막으로 옮깁니다.
6. 0.05% Tween-20 완충액(TBST)이 포함된 Tris-완충 식염수에 5% 무지방 우유로 멤브레인을 RT에서 1시간 동안 차단하고 재료 표에 제공된 각 항체로 4°C에서 밤새 배양합니다.
7. TBST로 멤브레인을 여러 번 세척하고 RT에서 1시간 동안 2차 항체(재료 표)로 배양한 후 TBST로 세척합니다. 향상된 화학발광 검출 키트와 이미저 시스템을 사용하여 단백질 밴드를 시각화합니다.

12. 통계 분석

1. 모든 실험 데이터 포인트가 독립적이므로 데이터를 평균 ± SD로 표시합니다. 통계 분석을 수행합니다.
2. 다중 비교에는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하고 각 그룹을 통제 그룹과 비교하는 데는 Dunnett의 검정을 사용합니다. 두 그룹을 비교하기 위해 스튜던트 t-검정(쌍을 이루지 않은 양측 검정)을 사용합니다. P < 0.05를 유의한 것으로 간주합니다.

결과

TCGA 데이터베이스 분석 및 PCR 검증

TCGA 데이터베이스 분석을 통해 자궁경부암 세포 검체 306개와 정상세포 검체 13개에서 mRNA 발현량을 비교 분석하여 FAM83A의 발현을 조사하였습니다. FAM83A는 자궁경부암에서 상향 조절된 반면, 정상 자궁경부 조직에서는 발현이 무시할 수 있는 수준이었습니다(

토론

종양 표적 유전자의 조사는 자궁경부암의 예방과 치료에 가장 중요합니다. 자궁경부암의 발병과 진행에 중요한 역할을 하는 특정 유전자를 이해하면 질병의 근본적인 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 이러한 표적 유전자를 식별하면 새로운 치료 전략 및 표적 치료법을 개발할 수 있습니다. 이 연구에서는 TCGA 데이터 세트 분석을 사용하여 FAM83A 를 표적 유전?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0