자궁경부암 세포 성장 및 시스플라틴 감수성에서의 역할을 검증하기 위한 FAM83A 의 녹다운

요약

여기에서는 FAM83A 녹다운 절차를 보여줍니다. 자궁경부암 세포의 증식, 이동 및 침입에 대한 효과를 감지하기 위한 분석; 그리고 이 세포들이 시스플라틴에 감작됩니다. 이 연구는 자궁경부암에 대한 유망한 표적 유전자와 추가 약물 연구를 위한 참고 자료를 제공합니다.

초록

종양 표적 유전자의 탐색은 자궁경부암의 예방과 치료에 가장 중요합니다. 이 연구에서는 자궁경부암에서 종양 표적 유전자 FAM83A의 식별과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다. 첫째, 여성에서 FAM83A의 발현과 예후의 중요성을 검증하기 위해 Cancer Genome Atlas 데이터 세트를 사용했습니다. 작은 간섭 RNA(siRNA)는 HeLa 및 C33a 세포에서 FAM83A 유전자의 녹다운에 사용되었습니다. 다음으로, 종양 세포의 증식 능력에 미치는 영향을 확인하기 위해 5-ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU) 염색을 수행했습니다. 종양 세포 이동 및 침습 능력을 평가하기 위해 상처 치유 및 다공성 막 삽입 분석을 수행했습니다.

웨스턴 블로팅(Western blotting)은 세포사멸 관련 단백질 수준을 정량화하는 데 사용되었습니다. JC-1 염색은 미토콘드리아 기능 변화를 평가하기 위해 사용되었습니다. 또한, 시스플라틴(디아민디클로로플래티넘, DDP) 중재를 사용하여 표적 유전자의 치료 가능성을 평가했습니다. 유전자의 항암 특성을 추가로 검증하기 위해 유세포 분석 및 콜로니 형성 분석을 수행했습니다. 그 결과, FAM83A 녹다운은 자궁경부암 세포의 증식, 이동 및 침습을 억제하고 이 세포를 시스플라틴에 감작시키는 것으로 나타났습니다. 이러한 포괄적인 방법론은 FAM83A 를 종양 관련 표적 유전자로 총체적으로 검증하여 자궁경부암 예방 및 치료의 잠재적 치료 표적으로서의 가능성을 제시합니다.

서문

자궁경부암은 전 세계적으로 부인과 악성 종양의 주요 유형 중 하나이며 여성의 암 관련 사망률의 주요 원인이기 때문에 전 세계적인 관심사입니다¹. 근치적 수술과 화학방사선 요법은 1차 단계에서 높은 완치율과 관련이 있습니다. 그러나 자궁경부암이 진행된 환자에서 전이성 질환이 발생한 환자의 치료 결과는 매우 좋지 않다². 따라서 자궁경부암 세포의 이동과 침습의 기저에 있는 생물학적 메커니즘을 더 깊이 이해하고 이 질병의 예방 및 치료를 위한 잠재적인 치료 표적을 식별하는 것이 중요합니다.

암 진행에 관여하는 표적 유전자를 확인하고 그 발현이나 작용을 억제하는 방법을 찾는 것은 유망한 치료 옵션을 제시합니다. 이 연구에서 우리는 FAM83을 암 유발 유전자로 확인하고 C33a 및 HeLa 세포에 대한 억제 효과를 추가로 조사했습니다. FAM83 계열 종양유전자(FAM83A-H)는 인간 암에서 널리 보고되고 있다 ^3,4. 최근 FAM83A는 폐⁵

프로토콜

이 연구는 TCGA(https://cancergenome.nih.gov/publications/publicationguidelines)에서 제공한 출판 지침을 완전히 준수했습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 재료, 시약 및 기기와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.

1. 데이터 소스 및 생물정보학 분석

1. 클러스터 분석을 위해 TCGA(Cancer Genome Atlas) 데이터베이스(https://cancergenome.nih.gov)에서 RNA 염기서열 분석 데이터를 얻습니다. 웹 기반 도구인 GERPA(http://gepia.cancer-pku.cn/)를 사용하여 TCGA 프로젝트 샘플의 원시 RNA-Seq 데이터를 다시 계산하고 표준 처리 파이프라인으로 후보 항암제 표적을 스크리닝합니다.
   참고: GEPIA 웹사이트는 모든 사용자가 무료로 사용할 수 있습니다.
2. GEPIA 웹사이트 홈페이지에 접속하여 Cancer Type Analysis(암 유형 분석)를 클릭하고, Differential gene analysis(감별 유전자 분석 ) 옵션을 선택하고, 다음 매개변수를 설정합니다. 암 이....

토론

종양 표적 유전자의 조사는 자궁경부암의 예방과 치료에 가장 중요합니다. 자궁경부암의 발병과 진행에 중요한 역할을 하는 특정 유전자를 이해하면 질병의 근본적인 분자 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 또한 이러한 표적 유전자를 식별하면 새로운 치료 전략 및 표적 치료법을 개발할 수 있습니다. 이 연구에서는 TCGA 데이터 세트 분석을 사용하여 FAM83A 를 표적 유전?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cells and Medium Formulation
C33a	American Type Culture Collection
Hela	American Type Culture Collection
Modified medium			10% fetal bovine serum and + antibiotics (100 U/mL penicillin and 100 U/mL streptomycin)
Antibody Information
AKT	4691, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Bcl2	26593-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:1,000
Caspase 3	19677-1-AP, Proteintech Group, Inc		‘1:2,000
cleaved-caspase3	abs132005; Absin Bioscience Inc.		‘1:1,000
Cytc	10993-1-AP; Proteintech Group		‘1:1,000
GAPDH	10494-1-AP, Proteintech Group, Inc.		‘1:8,000
mTOR	2983, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
PI3K	4292, Cell Signaling Technology Inc		‘1:1,000
p-AKT	4060, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-mTOR (Ser2448)	#5536, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
p-PI3K p85 subunit	17366, Cell Signaling Technology Inc.		‘1:1,000
Secondary antibodies	GB23303, Servicebio		‘1:2,000
Materials
6-well plate	Corning, NPY
Alexa Fluor 555	Beyotime
BCA Protein assay kit	Beyotime, China		P0011
ChemiDoc XRS Imager System	BioRad
Enhanced chemiluminescence detection kit	Servicebio, Inc.,China		cat. no. G2014
Fluorescence microscope	Olympus Corporation, Tokyo, Japan
Hifair II 1st Strand cDNA Synthesis Super Mix	11123ES60, Yeasen Biotech o., Ltd., China
			Inverted microscope	Olympus, Tokyo, Japan;
Millicell transwell inserts	Millipore,Bedford, MA, USA
Mitochondrial membrane potential assay kit	Beyotime, China
PMSF	ST506, Beyotime Biotech, Jiangsu, China		#ST506
Real-time quantitative PCR instrument	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. China.
			RIPA Lysis Buffer	Beyotime Biotech, Jiangsu, China
TRIzol reagent	Invitrogen		15596026
TRIzol reagent	Takara Bio Inc., Otsu, Japan
Software
Image-Pro	plus 6.0