نظام استزراع آلي للحفاظ على الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان وتمييزها

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لنظام زراعة الخلايا الآلي. يقلل نظام الاستزراع الآلي هذا من العمالة ويفيد المستخدمين ، بما في ذلك الباحثين غير المعتادين على التعامل مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، من صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.

Abstract

من المتوقع أن يكون للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) ذات القدرة اللانهائية على التكاثر الذاتي تطبيقات في العديد من المجالات ، بما في ذلك توضيح أمراض الأمراض النادرة ، وتطوير أدوية جديدة ، والطب التجديدي الذي يهدف إلى استعادة الأعضاء التالفة. على الرغم من ذلك ، لا يزال التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs محدودا. ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة إعادة إنتاج التمايز في الثقافة ، حتى مع المعرفة المتقدمة والمهارات التقنية المتطورة ، بسبب الحساسية العالية ل iPSCs للتغيرات البيئية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تطبيق نظام الثقافة الآلي إلى حل هذه المشكلة. يمكن توقع تجارب ذات قابلية استنساخ عالية مستقلة عن مهارة الباحث وفقا لإجراء مشترك عبر مختلف المعاهد. على الرغم من أن العديد من أنظمة الاستزراع الآلي التي يمكنها الحفاظ على ثقافات iPSC وتحفيز التمايز قد تم تطويرها سابقا ، إلا أن هذه الأنظمة ثقيلة وكبيرة ومكلفة لأنها تستخدم أذرعا روبوتية إنسانية متعددة المفاصل. لتحسين المشكلات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير نظام جديد باستخدام نظام سكة منزلق بسيط للمحور x-y-z ، مما يسمح له بأن يكون أكثر إحكاما وأخف وزنا وأرخص. علاوة على ذلك ، يمكن للمستخدم بسهولة تعديل المعلمات في النظام الجديد لتطوير مهام معالجة جديدة. بمجرد إنشاء المهمة ، كل ما يحتاجه المستخدم هو إعداد iPSC ، وتوفير الكواشف والمواد الاستهلاكية اللازمة للمهمة المطلوبة مسبقا ، وتحديد رقم المهمة ، وتحديد الوقت. أكدنا أن النظام يمكنه الحفاظ على iPSCs في حالة غير متمايزة من خلال عدة ممرات بدون خلايا مغذية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب وخلايا الكبد والأسلاف العصبية والخلايا الكيراتينية. سيمكن النظام من إجراء تجارب قابلة للتكرار بدرجة كبيرة عبر المؤسسات دون الحاجة إلى باحثين مهرة وسيسهل التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs في مجموعة واسعة من مجالات البحث من خلال تقليل العقبات التي تحول دون الدخول الجديد.

Introduction

تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات معالجة فعلية ومفصلة لنظام زراعة آلي للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي أنتجناها بالتعاون مع شركة ، وإظهار نتائج تمثيلية.

منذ نشر المقال في عام 2007 ، جذبت iPSC الانتباه في جميع أنحاء العالم¹. نظرا لأعظم ميزة لها تتمثل في القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية ، فمن المتوقع أن يتم تطبيقها في مجالات مختلفة مثل الطب التجديدي ، وتوضيح أسباب الأمراض المستعصية ، وتطوير أدوية علاجية جديدة ^2,3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الخلايا الجسدية البشرية المشتقة من iPSC يمكن أن يقلل من التجارب على ....

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات بجامعة كانساي الطبية على توليد واستخدام iPSCs الصحية المشتقة من المتطوعين المسماة KMUR001 (الموافقة رقم 2020197). قدم المتبرع ، الذي تم تجنيده علنا ، موافقة رسمية مستنيرة ووافق على الاستخدام العلمي للخلايا.

ملاحظة: الواجهة الحالية (البرنامج الخاص المسمى "ccssHMI" الذي يعمل تحت نظام التشغيل Windows XP) هي شاشة التشغيل الأساسية. تحت الواجهة المذكورة أعلاه ، يتم ترتيب سلسلة من علامات التبويب ، مما يسمح للمستخدمين ببدء عمليات مختلفة.

1. عمليات التحميل

1. انقر على تحميل زر على الشاشة العلوية للبرنامج. انقر فوق الزر بدء إعداد التحميل .
....

النتائج

صيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
استخدمنا ثلاثة خطوط hPSC (RIKEN-2F و 253G1 و KMUR001). لقد قمنا بتحسين بروتوكول الصيانة من خلال التجارب اليومية التي يتم إجراؤها يدويا وقمنا بتحسين البرامج التفصيلية من خلال التجارب الأولية السبع التي يقوم بها النظام. على سبيل المثا?.......

Discussion

تتمثل إحدى الخطوات المهمة في البروتوكول في أنه إذا وجد المستخدم أي أخطاء ، فانقر فوق الزر "إلغاء" أو "إيقاف" أو "إعادة تعيين" في أي وقت وابدأ من جديد من الخطوة الأولى. يمكن للبرنامج تجنب الأخطاء البشرية ، بما في ذلك الحجز المزدوج ، وفتح الأبواب أثناء تنشيط مهام النظام ، ونقص التجديد. نقطة أخرى.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A