A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نقدم بروتوكولا لنظام زراعة الخلايا الآلي. يقلل نظام الاستزراع الآلي هذا من العمالة ويفيد المستخدمين ، بما في ذلك الباحثين غير المعتادين على التعامل مع الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) ، من صيانة الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات إلى التمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا.

Abstract

من المتوقع أن يكون للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (hiPSCs) ذات القدرة اللانهائية على التكاثر الذاتي تطبيقات في العديد من المجالات ، بما في ذلك توضيح أمراض الأمراض النادرة ، وتطوير أدوية جديدة ، والطب التجديدي الذي يهدف إلى استعادة الأعضاء التالفة. على الرغم من ذلك ، لا يزال التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs محدودا. ويرجع ذلك جزئيا إلى صعوبة إعادة إنتاج التمايز في الثقافة ، حتى مع المعرفة المتقدمة والمهارات التقنية المتطورة ، بسبب الحساسية العالية ل iPSCs للتغيرات البيئية الدقيقة. يمكن أن يؤدي تطبيق نظام الثقافة الآلي إلى حل هذه المشكلة. يمكن توقع تجارب ذات قابلية استنساخ عالية مستقلة عن مهارة الباحث وفقا لإجراء مشترك عبر مختلف المعاهد. على الرغم من أن العديد من أنظمة الاستزراع الآلي التي يمكنها الحفاظ على ثقافات iPSC وتحفيز التمايز قد تم تطويرها سابقا ، إلا أن هذه الأنظمة ثقيلة وكبيرة ومكلفة لأنها تستخدم أذرعا روبوتية إنسانية متعددة المفاصل. لتحسين المشكلات المذكورة أعلاه ، قمنا بتطوير نظام جديد باستخدام نظام سكة منزلق بسيط للمحور x-y-z ، مما يسمح له بأن يكون أكثر إحكاما وأخف وزنا وأرخص. علاوة على ذلك ، يمكن للمستخدم بسهولة تعديل المعلمات في النظام الجديد لتطوير مهام معالجة جديدة. بمجرد إنشاء المهمة ، كل ما يحتاجه المستخدم هو إعداد iPSC ، وتوفير الكواشف والمواد الاستهلاكية اللازمة للمهمة المطلوبة مسبقا ، وتحديد رقم المهمة ، وتحديد الوقت. أكدنا أن النظام يمكنه الحفاظ على iPSCs في حالة غير متمايزة من خلال عدة ممرات بدون خلايا مغذية والتمايز إلى أنواع مختلفة من الخلايا ، بما في ذلك خلايا عضلة القلب وخلايا الكبد والأسلاف العصبية والخلايا الكيراتينية. سيمكن النظام من إجراء تجارب قابلة للتكرار بدرجة كبيرة عبر المؤسسات دون الحاجة إلى باحثين مهرة وسيسهل التنفيذ الاجتماعي ل hiPSCs في مجموعة واسعة من مجالات البحث من خلال تقليل العقبات التي تحول دون الدخول الجديد.

Introduction

تهدف هذه المقالة إلى توفير إجراءات معالجة فعلية ومفصلة لنظام زراعة آلي للخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان (iPSC) ، والتي أنتجناها بالتعاون مع شركة ، وإظهار نتائج تمثيلية.

منذ نشر المقال في عام 2007 ، جذبت iPSC الانتباه في جميع أنحاء العالم1. نظرا لأعظم ميزة لها تتمثل في القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا الجسدية ، فمن المتوقع أن يتم تطبيقها في مجالات مختلفة مثل الطب التجديدي ، وتوضيح أسباب الأمراض المستعصية ، وتطوير أدوية علاجية جديدة 2,3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام الخلايا الجسدية البشرية المشتقة من iPSC يمكن أن يقلل من التجارب على ....

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات بجامعة كانساي الطبية على توليد واستخدام iPSCs الصحية المشتقة من المتطوعين المسماة KMUR001 (الموافقة رقم 2020197). قدم المتبرع ، الذي تم تجنيده علنا ، موافقة رسمية مستنيرة ووافق على الاستخدام العلمي للخلايا.

ملاحظة: الواجهة الحالية (البرنامج الخاص المسمى "ccssHMI" الذي يعمل تحت نظام التشغيل Windows XP) هي شاشة التشغيل الأساسية. تحت الواجهة المذكورة أعلاه ، يتم ترتيب سلسلة من علامات التبويب ، مما يسمح للمستخدمين ببدء عمليات مختلفة.

1. عمليات التحميل

  1. انقر على تحميل زر على الشاشة العلوية للبرنامج. انقر فوق الزر بدء إعداد التحميل .
  2. ....

النتائج

صيانة الخلايا الجذعية متعددة القدرات التي يسببها الإنسان
استخدمنا ثلاثة خطوط hPSC (RIKEN-2F و 253G1 و KMUR001). لقد قمنا بتحسين بروتوكول الصيانة من خلال التجارب اليومية التي يتم إجراؤها يدويا وقمنا بتحسين البرامج التفصيلية من خلال التجارب الأولية السبع التي يقوم بها النظام. على سبيل المثا?.......

Discussion

تتمثل إحدى الخطوات المهمة في البروتوكول في أنه إذا وجد المستخدم أي أخطاء ، فانقر فوق الزر "إلغاء" أو "إيقاف" أو "إعادة تعيين" في أي وقت وابدأ من جديد من الخطوة الأولى. يمكن للبرنامج تجنب الأخطاء البشرية ، بما في ذلك الحجز المزدوج ، وفتح الأبواب أثناء تنشيط مهام النظام ، ونقص التجديد. نقطة أخرى.......

Disclosures

ليس لدى المؤلف ما يكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذه الدراسة بمنحة من مركز ترويج الأعمال الجديدة ، شركة باناسونيك لهندسة الإنتاج المحدودة ، أوساكا ، اليابان.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15% bovine serum albumin fraction VFuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm plastic plates Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN Bioresource Research CenterHPS0002
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Actinin  mouseAbcamab9465
Activin A Nacali Tesque18585-81
AdenineThermo Fisher ScientificA14906.30
Albumin  rabbitDakoA0001
All-trans retinoic acidFuji Film Wako Chemical Inc. 186-01114
Automated culture systemPanasonic
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
bFGFFuji Film Wako Chemical Inc. 062-06661
BMP4 Thermo Fisher ScientificPHC9531
Bovine serum albuminMerck810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFMThermo Fisher Scientific10744019Human keratinocyte medium
DexamethasoneMerck266785
Dihexa TRC, Ontario, Canada13071-60-8rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometerCountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher ScientificC10228
DorsomorphinThermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 Fuji Film Wako Chemical Inc.12634010
EGFFuji Film Wako Chemical Inc. 053-07751
Essential 8 Thermo Fisher ScientificA1517001Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum Biowest, FL, United StatesS140T
FGF-basic Nacalai Tesque Inc.19155-07
ForskolinThermo Fisher ScientificJ63292.MF
GlutamineThermo Fisher Scientific25030081Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA11056
HNF-4A  goatSantacruz6556
HydrocortisoneThermo Fisher ScientificA16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinateMerckH2882
iMatrix511 Silk Nippi Inc., Tokyo, Japan892 021Cell culture matrix
Insulin-transferrin-seleniumThermo Fisher Scientific41400045
Keratin 1  mouseSantacruz376224
Keratin 10  rabbitBioLegend19054
KMUR001Kansai Medical University Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacementThermo Fisher Scientific10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate A8960, MerckA8960
Leibovitz’s L-15 medium Fuji Film Wako Chemical Inc.128-06075
MatrigelCorning Inc.354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin mouseSantacruz23927
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament  rabbitChemiconAB1987
NeutristemSartrius AG, Göttingen, Germany05-100-1Acell culture medium 
Oct 3/4  mouseBD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
Recombinant human albumin A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632 Sellec Inc., Tokyo, Japan129830-38-2
RIKEN 2FRKEN Bioresource Research CenterHPS0014undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific #1187512633020
SB431542Thermo Fisher Scientific301836-41-9
Sodium L-ascorbateMerckA4034-100G
SSEA-4  mouseMilliporeMAB4304
StemFit AK02N Ajinomoto, Tokyo, JapanAK02cell culture medium 
TnT rabbitAbcamab92546
TRA 1-81 mouseMilliporeMAB4381
TriiodothyronineThermo Fisher ScientificH34068.06
TripLETM express enzyme Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
Trypan blue solution Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
Tryptose phosphate brothMerckT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne, NB, United Kingdom5148
β figure-materials-7925 Tublin  mousePromegaG712A

References

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved