ヒト人工多能性幹細胞の維持・分化のための自動培養システム

要約

ここでは、自動細胞培養システムのプロトコールを紹介します。この自動培養システムは、iPS細胞の維持管理から各種細胞への分化まで、人工多能性幹細胞(iPS細胞)の取り扱いに不慣れな研究者など、ユーザーの手間を軽減し、メリットがあります。

要約

無限の自己増殖能力を持つヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)は、希少疾患の病態解明、新薬開発、損傷臓器の修復を目的とした再生医療など、多くの分野での応用が期待されています。しかし、iPS細胞の社会実装はまだまだ限定的です。これは、iPS細胞が微細な環境変化に対して高い感度を持つため、高度な知識や高度な技術をもってしても、培養における分化の再現が困難であることも一因です。自動培養システムの適用により、この問題を解決できます。研究者の技量によらず、再現性の高い実験が、各機関で共通の手順で実施されることが期待されます。iPS細胞の培養を維持し、分化を誘導できる自動培養システムはこれまでにもいくつか開発されていますが、これらのシステムは、ヒト化された多関節ロボットアームを使用するため、重く、大きく、コストがかかります。上記の課題を改善すべく、シンプルなX-Y-Z軸スライドレール方式を採用し、小型・軽量・安価化を実現した新システムを開発しました。さらに、ユーザーは新しいシステムのパラメータを簡単に変更して、新しい処理タスクを開発することができます。タスクが決まれば、あとはiPS細胞を準備し、目的のタスクに必要な試薬や消耗品を事前に用意し、タスク番号を選択し、時間を指定するだけです。このシステムにより、iPS細胞をフィーダー細胞を使わずに数回継代で未分化状態に維持し、心筋細胞、肝細胞、神経前駆細胞、ケラチノサイトなど様々な細胞種に分化できることを確認しました。これにより、熟練した研究者を必要とせず、施設間で再現性の高い実験が可能となり、新規参入の障壁が減り、より幅広い研究分野でのiPS細胞の社会実装が促進されます。

概要

本稿では、企業と共同で作製したヒト人工多能性幹細胞(iPS細胞)の自動培養システムについて、実際の詳細な取り扱い手順と代表的な成果を示すことを目的としています。

2007年の論文発表以来、iPS細胞は世界中で注目を集めています¹。あらゆる体細胞に分化できるという最大の特徴から、再生医療、難治性疾患の原因解明、新規治療薬の開発など、さまざまな分野への応用が期待されています^2,3。また、ヒトiPS細胞由来の体細胞を用いることで、倫理的制約の大きい動物実験を減らすことができます。iPS細胞を用いた新しい方法の研究には、常に多くの均質なiPS細胞が必要ですが、その管理は手間がかかります。また、iPS細胞は感度が高いため、微妙な文化や環境の変化にも敏感に反応するため、取り扱いが困難です。

この問題を解決するために、自動化された培養システムが人間の代わりにタスクを実行することが期待されています。いくつかのグループは、細胞の維持と分化のためのいくつかの自動化されたヒト多能性幹細胞培養システムを開発し、その成果を発表しました^4,5,6<....

プロトコル

関西医科大学倫理委員会は、KMUR001と名付けられた健康なボランティア由来iPS細胞の作製と使用を承認しました(承認番号2020197)。公然と募集されたドナーは、正式なインフォームドコンセントを提供し、細胞の科学的使用に同意しました。

メモ: 現在のインターフェイス(Windows XPオペレーティングシステムで実行されている「ccssHMI」という名前の特別なソフトウェア)は、基本的な操作画面です。前述のインターフェイスの下には、一連のタブが配置されており、ユーザーはさまざまな操作を開始できます。

1. ローディング作業

1. ソフトウェアのトップ画面にある [読み込み 中]ボタンをクリックします。「 Loading Preparation Start 」ボタンをクリックします。
2. 装置に入れる皿またはプレートを装置内の所定の位置に置きます。
   注意: 皿の識別に必要な情報は、各蓋に記入する必要があります。
3. フロントスライドウィンドウを手動で閉じ、機械的な安全確認ボタンを押します。
4. ソフトウェアで料理またはプレートの種類と数量を選択します。
5. 「 Loading Preparation Completed ....

ディスカッション

プロトコルの重要なステップは、ユーザーが障害を見つけた場合、いつでもキャンセル、停止、またはリセットボタンをクリックして、最初のステップからやり直すことです。このソフトウェアは、ダブルブッキング、システムタスクがアクティブなときにドアを開ける、補充の欠如などの人為的ミスを回避できます。目的の体細胞への分化を成功させ、効率的に行うためのもう一つの重要?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A