Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Riepilogo

Qui presentiamo un protocollo per un sistema di coltura cellulare automatizzato. Questo sistema di coltura automatizzato riduce il lavoro e avvantaggia gli utenti, compresi i ricercatori che non hanno familiarità con la manipolazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), dal mantenimento delle cellule iPS alla differenziazione in vari tipi di cellule.

Abstract

Ci si aspetta che le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) con capacità infinita di autoproliferazione abbiano applicazioni in numerosi campi, tra cui la delucidazione delle patologie delle malattie rare, lo sviluppo di nuovi farmaci e la medicina rigenerativa che mira a ripristinare gli organi danneggiati. Ciononostante, l'implementazione sociale delle hiPSC è ancora limitata. Ciò è in parte dovuto alla difficoltà di riprodurre la differenziazione in coltura, anche con conoscenze avanzate e sofisticate competenze tecniche, a causa dell'elevata sensibilità delle iPSC ai minimi cambiamenti ambientali. L'applicazione di un sistema di coltura automatizzato può risolvere questo problema. Esperimenti con un'elevata riproducibilità indipendente dall'abilità di un ricercatore possono essere previsti secondo una procedura condivisa tra vari istituti. Sebbene in precedenza siano stati sviluppati diversi sistemi di coltura automatizzati in grado di mantenere le colture di iPSC e indurre la differenziazione, questi sistemi sono pesanti, grandi e costosi perché fanno uso di bracci robotici umanizzati e multi-articolati. Per migliorare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo sistema che utilizza un semplice sistema di guide di scorrimento dell'asse x-y-z, che consente di essere più compatto, più leggero e più economico. Inoltre, l'utente può facilmente modificare i parametri nel nuovo sistema per sviluppare nuove attività di movimentazione. Una volta stabilita un'attività, tutto ciò che l'utente deve fare è preparare l'iPSC, fornire in anticipo i reagenti e i materiali di consumo necessari per l'attività desiderata, selezionare il numero dell'attività e specificare l'ora. Abbiamo confermato che il sistema potrebbe mantenere le iPSC in uno stato indifferenziato attraverso diversi passaggi senza cellule feeder e differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui cardiomiociti, epatociti, progenitori neurali e cheratinociti. Il sistema consentirà esperimenti altamente riproducibili tra le istituzioni senza la necessità di ricercatori qualificati e faciliterà l'implementazione sociale delle hiPSC in una gamma più ampia di campi di ricerca, diminuendo gli ostacoli per i nuovi ingressi.

Introduzione

Questo articolo ha lo scopo di fornire procedure di gestione effettive e dettagliate per un sistema di coltura automatizzato per cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), che abbiamo prodotto collaborando con un'azienda, e di mostrare risultati rappresentativi.

Dalla pubblicazione dell'articolo nel 2007, l'iPSC ha attirato l'attenzione di tutto il mondo¹. A causa della sua maggiore caratteristica di essere in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica, ci si aspetta che venga applicato in vari campi come la medicina rigenerativa, chiarendo le cause delle malattie intrattabili e sviluppando nuovi farmaci terapeutici ^2,3. Inoltre, l'utilizzo di cellule somatiche umane derivate da iPSC potrebbe ridurre gli esperimenti sugli animali, che sono soggetti a significative restrizioni etiche. Sebbene siano costantemente necessarie numerose iPSC omogenee per la ricerca di nuovi metodi con le iPSC, è troppo laborioso gestirle. Inoltre, la gestione dell'iPSC è difficile a causa della sua elevata sensibilità, anche a sottili cambiamenti culturali e ambientali.

Per risolvere questo problema, ci si aspetta che i sistemi di coltura automatizzati eseguano attività al posto degli esseri umani. Alcuni gruppi hanno sviluppato alcuni sistemi automatizzati di coltura di cellule staminali pluripotenti umane per il mantenimento e la differenziazione cellulare e hanno pubblicato i loro risultati ^4,5,6. Questi sistemi equipaggiano uno o più bracci robotici multiarticolati. I bracci robotici non hanno solo il merito di imitare fortemente i movimenti del braccio umano, ma anche il demerito in quanto richiedono costi più elevati per il braccio (o i bracci), un imballaggio del sistema più grande e più pesante e sforzi di formazione che richiedono tempo da parte degli ingegneri per ottenere i movimenti mirati ^7,8. Al fine di facilitare l'introduzione dell'apparato in un maggior numero di strutture di ricerca nei punti di consumo economico, spaziale e delle risorse umane, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione delle iPSC in vari tipi di cellule⁹.

La nostra logica per il nuovo sistema era quella di adottare un sistema di binari ad assi X-Y-Z invece di bracci robotici multiarticolati⁹. Per sostituire le complesse funzioni simili a quelle di una mano dei bracci robotici, abbiamo applicato una nuova idea a questo sistema, in grado di modificare automaticamente tre tipi di punte funzionali specifiche del braccio. Qui, indichiamo anche come gli utenti possono facilmente creare pianificazioni delle attività con semplici ordini sul software a causa della mancanza di requisiti per i contributi degli ingegneri durante tutto il processo.

Uno dei sistemi di coltura robotica ha dimostrato la realizzazione di corpi embrioidi utilizzando piastre a 96 pozzetti come aggregati cellulari 3D per la differenziazione⁴. Il sistema qui riportato non è in grado di gestire piastre a 96 pozzetti. Uno ha ottenuto l'attuale grado di buone pratiche di fabbricazione (cGMP) utilizzando una linea cellulare, sebbene non fosse una cellula staminale pluripotente umana⁵. Il sistema di coltura automatizzato qui descritto è stato ora sviluppato con l'obiettivo specifico di aiutare gli esperimenti di laboratorio (Figura 1). Tuttavia, dispone di sistemi sufficienti per mantenere puliti livelli equivalenti a quelli di un armadio di sicurezza di livello IV.

Protocollo

Il Comitato Etico dell'Università di Medicina del Kansai ha approvato la generazione e l'uso delle iPSC sane derivate da volontari denominate KMUR001 (approvazione n. 2020197). Il donatore, che è stato reclutato apertamente, ha fornito un consenso informato formale e ha accettato l'uso scientifico delle cellule.

NOTA: L'interfaccia corrente (il software speciale denominato "ccssHMI" in esecuzione con il sistema operativo Windows XP) è la schermata operativa fondamentale. Sotto la suddetta interfaccia, sono disposte una serie di schede, che consentono agli utenti di avviare varie operazioni.

1. Operazioni di carico

1. Fare clic sul pulsante Caricamento nella schermata superiore del software. Fare clic sul pulsante Avvio preparazione caricamento .
2. Posizionare il/i piatto/i o il/i piatto/i da inserire nell'apparecchio in posizione nell'apparecchio.
   NOTA: Le informazioni necessarie per l'identificazione del piatto devono essere scritte su ciascun coperchio.
3. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.
4. Selezionare il tipo e la quantità di piatti o piatti nel software.
5. Fare clic sul pulsante Preparazione caricamento completata . Fare clic sul pulsante Avvio caricamento .
6. Dopo che una parabola è stata caricata nel sistema, selezionare le informazioni sulla parabola, ad esempio con celle iPS o senza celle iPS, sul software. Registra le note su ogni piatto nel software.
7. Fare clic sul pulsante Registrazione alla fine per completare l'operazione di caricamento.

2. Operazione di scarico

1. Fare clic sul pulsante Scarica nella schermata superiore del software. Selezionare il/i piatto/i da rimuovere nel software.
2. Dopo aver selezionato il/i piatto/i, fare clic sul pulsante Avvio preparazione scarico . Fare clic sul pulsante Avvio scarico .
3. Dopo che i piatti sono stati trasferiti dall'incubatrice al banco di lavoro nel sistema, premere il pulsante Rimozione piatto .
4. Aprire manualmente il finestrino scorrevole anteriore ed estrarre il/i piatto/i. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.

3. Supplemento di materiali di consumo: pipette, provette e fluidi

1. Per rifornire materiali di consumo come pipette, provette e fluidi, fare clic sul pulsante Materiali di consumo nella schermata superiore del software, quindi selezionare l'articolo da rifornire.
   1. Pipette
      1. Fare clic sul pulsante Pipettatrice . Seleziona il pulsante Rifornisci .
      2. Selezionare un rack che l'utente desidera rifornire nel software. Fare clic sul pulsante Rifornisci inizio .
      3. Dopo aver verificato che il coperchio dell'area di conservazione delle pipette sul banco di lavoro sia aperto, aprire manualmente la finestra scorrevole anteriore e riempire le pipette secondo necessità.
      4. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
      5. Fare clic sul pulsante Impostazione rifornimento e immettere le informazioni per il rifornimento, quindi fare clic sul pulsante Registrazione .
      6. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
   2. Tubi
      1. Fare clic sul pulsante Tubo . Seleziona il pulsante Rifornisci .
      2. Selezionare un rack che l'utente desidera rifornire nel software. Fare clic sul pulsante Rifornisci inizio .
      3. Dopo aver verificato che il rack si è spostato in alto, fare clic sul pulsante Rifornisci provetta .
      4. Aprire manualmente il finestrino scorrevole anteriore e riempire i tubi secondo necessità.
      5. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.
      6. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
      7. Fare clic sul pulsante Impostazione rifornimento e immettere le informazioni per il rifornimento, quindi fare clic sul pulsante Registrazione . Fare clic sul pulsante Chiudi .
   3. Medio
      1. Fare clic sul pulsante Medio . Seleziona il pulsante Rifornisci nel software.
      2. Selezionare uno dei tre rack che gli utenti desiderano rifornire. Fare clic sul pulsante Rifornisci inizio .
      3. Dopo aver verificato che il coperchio dell'area di stoccaggio del mezzo è stato aperto, aprire manualmente il finestrino scorrevole anteriore e riempire il fluido.
      4. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.
      5. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
      6. Fare clic sul pulsante Rifornisci e immettere le informazioni relative al supporto, inclusi il nome e la quantità del supporto. Se necessario, immettere ulteriori commenti.
      7. Fare clic sul pulsante Registrazione .
      8. Fare clic sul pulsante Chiudi .

4. Selezione dell'attività

1. Fare clic sul pulsante Attività nella schermata superiore del software.
2. Selezionare il pulsante Impostazione attività . Selezionare l'attività desiderata dall'elenco delle attività e fare clic sul pulsante Passaggio successivo .
3. Specificare la data e l'ora in cui eseguire l'attività, quindi fare clic sul pulsante Registrazione . Selezionare un piatto o un piatto per eseguire l'attività, quindi fare clic sul pulsante Registrazione .
4. Dopo aver riconfermato l'attività selezionata, fare clic sul pulsante Registrazione . Verificare che l'attività sia stata registrata nella schermata successiva.
5. Se necessario, impostare l'attività successiva nello stesso modo.
6. Fare clic sul pulsante Avvia alla fine. Quindi, l'attività verrà avviata automaticamente alla data e all'ora specificate.
   NOTA: Subito dopo aver terminato ogni attività, le luci UV (situate su due lati della cappa) si accendono automaticamente e dopo 5-30 minuti, in conformità con l'impostazione ausiliaria, si spengono per mantenere la cappa in condizioni asettiche. Per interrompere, gli utenti possono fare clic sul pulsante Start .
7. Se gli utenti desiderano annullare un'attività pianificata in anticipo, fare clic sul pulsante Interrompi .
8. Dopo aver selezionato l'attività da interrompere, fare clic sul pulsante Modifica attività .
9. Fare clic sul pulsante Annulla attività . Verificare che l'attività sia stata eliminata nella schermata successiva.

5. Controlla le immagini delle celle

1. Ogni attività include osservazioni microscopiche (scattare foto) prima e dopo il lavoro di attività. Osservare fotograficamente i progressi della coltura cellulare incorporando un'attività di fotografia microscopica prima o dopo ogni attività.
2. Seleziona programmi di attività preimpostati, inclusa la selezione anticipata di più posizioni specifiche della piastra o della piastra del pozzetto per l'osservazione a punto fisso per monitorare la stessa posizione nel tempo.

6. Passage e differenziazione

1. Seguire i passaggi nelle sezioni 1-5 e impostare il sistema di coltura cellulare automatizzato per eseguire il passaggio e la differenziazione. Le impostazioni dello strumento per il passaging, la differenziazione dei cardiomiociti, la differenziazione degli epatociti, la differenziazione delle cellule precursori neurali e la differenziazione dei cheratinociti sono mostrate rispettivamente nella Tabella 1, Tabella 2, Tabella 3, Tabella 4 e Tabella 5.

Risultati

Mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo
Abbiamo utilizzato tre linee hPSC (RIKEN-2F, 253G1 e KMUR001). Abbiamo ottimizzato il protocollo di manutenzione attraverso esperimenti giornalieri eseguiti manualmente e ulteriormente ottimizzato i programmi dettagliati attraverso i sette esperimenti preliminari eseguiti dal sistema. Ad esempio, le sollecitazioni di taglio causate dalle velocità del liquido del flusso dello spiedo da diverse pipette maneggiate dall'uomo e dal sistema s...

Discussione

Un passaggio critico del protocollo è che se un utente rileva errori, fare clic sul pulsante Annulla, Interrompi o Ripristina in qualsiasi momento e ricominciare dal primo passaggio. Il software può evitare errori umani, tra cui la doppia prenotazione, l'apertura delle porte mentre le attività del sistema sono attive e la mancanza di rifornimento. Un altro punto critico per una differenziazione efficace ed efficiente nella cellula somatica desiderata è la corretta selezione delle linee di cellule staminali pluripoten...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A