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本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 代表性结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

在这里，我们提出了一种自动化细胞培养系统的方案。这种自动化培养系统减少了劳动力，使用户受益，包括不熟悉处理诱导多能干细胞（iPS）细胞的研究人员，从iPS细胞的维持到分化为各种类型的细胞。

摘要

具有无限自我增殖能力的人类诱导多能干细胞（hiPSCs）有望在众多领域得到应用，包括阐明罕见病病理学、开发新药以及旨在恢复受损器官的再生医学。尽管如此，hiPSCs的社会实施仍然有限。这在一定程度上是因为iPSCs对微小环境变化的高度敏感性，即使拥有先进的知识和复杂的技术技能，也难以在培养物中复制分化。自动化培养系统的应用可以解决这个问题。根据不同研究所的共享程序，可以预期具有独立于研究人员技能的高可重复性的实验。尽管之前已经开发了几种可以维持 iPSC 培养物和诱导分化的自动化培养系统，但这些系统笨重、大且成本高昂，因为它们使用了人源化、多关节的机械臂。为了改善上述问题，我们开发了一种使用简单的 x-y-z 轴滑轨系统的新系统，使其更紧凑、更轻、更便宜。此外，用户可以轻松修改新系统中的参数以开发新的处理任务。一旦建立了任务，用户需要做的就是准备iPSC，提前提供所需任务所需的试剂和耗材，选择任务编号，并指定时间。我们证实，该系统可以在没有饲养细胞的情况下通过多次传代将 iPSC 维持在未分化状态，并分化为各种细胞类型，包括心肌细胞、肝细胞、神经祖细胞和角质形成细胞。该系统将实现跨机构高度可重复的实验，而无需熟练的研究人员，并将通过减少新条目的障碍，促进hiPSCs在更广泛的研究领域的社会实施。

引言

本文旨在为我们与一家公司合作生产的人诱导多能干细胞（iPSC）的自动化培养系统提供实际和详细的处理程序，并展示具有代表性的结果。

自2007年文章发表以来，iPSC一直受到全世界的关注1。由于其最大的特点是能够分化成任何类型的体细胞，因此有望应用于再生医学、阐明疑难杂症的病因和开发新的治疗药物等各个领域2,3。此外，使用人类iPSC衍生的体细胞可以减少动物实验，这些实验受到重大的伦理限制。尽管不断需要大量同质的 iPSC 来研究 iPSC 的新方法，但管理它们太费力了。此外，由于iPSC的敏感性很高，因此处理iPSC很困难，即使对细微的文化和环境变化也是如此。

为了解决这个问题，自动化培养系统应该代替人类执行任务。一些研究小组已经开发了一些用于细胞维持和分化的自动化人类多能干细胞培养系统，并发表了他们的成就4,5,6。这些系统配备了多关节机械臂。机械臂不仅具有高度模仿人类手臂运动的优点，而且缺点在于它们需要更高的手臂成本、更大更重的系统包装以及工程师为获得目标运动而耗时的教....

研究方案

关西医科大学伦理委员会批准了名为KMUR001的健康志愿者来源的iPSCs的产生和使用（批准号2020197）。公开招募的捐赠者提供了正式的知情同意书，并同意细胞的科学使用。

注意：当前界面（在Windows XP操作系统下运行的名为“ccssHMI”的特殊软件）是基本操作屏幕。在上述界面下，排列了一系列选项卡，允许用户启动各种操作。

1. 装载操作

  1. 点击 加载 软件顶部屏幕上的 按钮 。单击 “加载准备开始” 按钮。
  2. 将要输入设备的盘子或盘子放在设备中的位置。
    注意： 每个盖子上都应写有识别盘子的必要信息。
  3. 手动关闭前滑动窗并按下机械安全确认按钮。
  4. 在软件中选择盘子或盘子的类型和数量。
  5. 单击 “加载准备完成 ”按钮。单击 “加载开始 ”按钮。
  6. 将培养皿上传到系统后，在软件上选择皿上的信息，例如 有 iPS 细胞 或 不使用 iPS 细胞的信息。在软件中注册有关每道菜的注释。
  7. 点击最后的 注册 按钮，完成加载操....

代表性结果

维持人诱导的多能干细胞
我们使用了三种hPSC细胞系（RIKEN-2F、253G1和KMUR001）。我们通过每天的手动实验优化了维护方案，并通过系统进行的七次初步实验进一步优化了详细程序。例如，由人类和系统处理的不同移液器的唾液流速引起的剪切应力是完全不同的;因此，我们优化了酶消化的时间长度和系统细胞分散的移液次数。

将人诱导的多能干细胞维持在涂有 0.5.......

讨论

协议中的一个关键步骤是，如果用户发现任何故障，请随时单击取消、停止或重置按钮，然后从第一步重新开始。该软件可以避免人为错误，包括重复预订、在系统任务处于活动状态时开门以及缺乏补货。成功和有效分化为所需体细胞的另一个关键点是正确选择多能干细胞系，因为每个多能干细胞在其分化特性中都具有不可控的偏差14,15。

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项研究得到了日本大阪松下生产工程有限公司新业务促进中心的资助。

....

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15% bovine serum albumin fraction VFuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm plastic plates Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN Bioresource Research CenterHPS0002
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Actinin  mouseAbcamab9465
Activin A Nacali Tesque18585-81
AdenineThermo Fisher ScientificA14906.30
Albumin  rabbitDakoA0001
All-trans retinoic acidFuji Film Wako Chemical Inc. 186-01114
Automated culture systemPanasonic
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
bFGFFuji Film Wako Chemical Inc. 062-06661
BMP4 Thermo Fisher ScientificPHC9531
Bovine serum albuminMerck810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFMThermo Fisher Scientific10744019Human keratinocyte medium
DexamethasoneMerck266785
Dihexa TRC, Ontario, Canada13071-60-8rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometerCountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher ScientificC10228
DorsomorphinThermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 Fuji Film Wako Chemical Inc.12634010
EGFFuji Film Wako Chemical Inc. 053-07751
Essential 8 Thermo Fisher ScientificA1517001Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum Biowest, FL, United StatesS140T
FGF-basic Nacalai Tesque Inc.19155-07
ForskolinThermo Fisher ScientificJ63292.MF
GlutamineThermo Fisher Scientific25030081Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA11056
HNF-4A  goatSantacruz6556
HydrocortisoneThermo Fisher ScientificA16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinateMerckH2882
iMatrix511 Silk Nippi Inc., Tokyo, Japan892 021Cell culture matrix
Insulin-transferrin-seleniumThermo Fisher Scientific41400045
Keratin 1  mouseSantacruz376224
Keratin 10  rabbitBioLegend19054
KMUR001Kansai Medical University Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacementThermo Fisher Scientific10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate A8960, MerckA8960
Leibovitz’s L-15 medium Fuji Film Wako Chemical Inc.128-06075
MatrigelCorning Inc.354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin mouseSantacruz23927
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament  rabbitChemiconAB1987
NeutristemSartrius AG, Göttingen, Germany05-100-1Acell culture medium 
Oct 3/4  mouseBD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
Recombinant human albumin A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632 Sellec Inc., Tokyo, Japan129830-38-2
RIKEN 2FRKEN Bioresource Research CenterHPS0014undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific #1187512633020
SB431542Thermo Fisher Scientific301836-41-9
Sodium L-ascorbateMerckA4034-100G
SSEA-4  mouseMilliporeMAB4304
StemFit AK02N Ajinomoto, Tokyo, JapanAK02cell culture medium 
TnT rabbitAbcamab92546
TRA 1-81 mouseMilliporeMAB4381
TriiodothyronineThermo Fisher ScientificH34068.06
TripLETM express enzyme Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
Trypan blue solution Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
Tryptose phosphate brothMerckT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne, NB, United Kingdom5148
β figure-materials-7925 Tublin  mousePromegaG712A

参考文献

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human....

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