JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протокол для автоматизированной системы культивирования клеток. Эта автоматизированная система культивирования сокращает трудозатраты и приносит пользу пользователям, в том числе исследователям, незнакомым с обращением с индуцированными плюрипотентными стволовыми клетками (iPS), от поддержания iPS-клеток до дифференцировки в различные типы клеток.

Аннотация

Ожидается, что индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (ИПСК) с бесконечной способностью к самораспространению найдут применение во многих областях, включая выяснение патологий редких заболеваний, разработку новых лекарств и регенеративную медицину, направленную на восстановление поврежденных органов. Несмотря на это, социальное применение ИПСК по-прежнему ограничено. Отчасти это связано с трудностью воспроизведения дифференциации в культуре, даже при наличии продвинутых знаний и сложных технических навыков, из-за высокой чувствительности ИПСК к мельчайшим изменениям окружающей среды. Решить эту проблему может применение автоматизированной системы культуры. Эксперименты с высокой воспроизводимостью, не зависящие от квалификации исследователя, можно ожидать в соответствии с общей процедурой для различных институтов. Несмотря на то, что ранее было разработано несколько автоматизированных систем культивирования, которые могут поддерживать культуры ИПСК и индуцировать дифференциацию, эти системы являются тяжелыми, большими и дорогостоящими, поскольку в них используются гуманизированные, многошарнирные роботизированные руки. Чтобы решить вышеуказанные проблемы, мы разработали новую систему, использующую простую систему направляющих по осям x-y-z, что позволило сделать ее более компактной, легкой и дешевой. Кроме того, пользователь может легко изменять параметры в новой системе для разработки новых задач по обработке. После того, как задача поставлена, все, что нужно сделать пользователю, это подготовить iPSC, заранее поставить реагенты и расходные материалы, необходимые для выполнения нужной задачи, выбрать номер задачи и указать время. Мы подтвердили, что система может поддерживать ИПСК в недифференцированном состоянии через несколько пассажей без фидерных клеток и дифференцироваться в различные типы клеток, включая кардиомиоциты, гепатоциты, нейральные предшественники и кератиноциты. Система позволит проводить высоковоспроизводимые эксперименты в разных учреждениях без необходимости в квалифицированных исследователях и будет способствовать социальному внедрению ИПСК в более широкий спектр областей исследований, уменьшая препятствия для новых заявок.

Введение

Цель данной статьи – представить реальные и подробные процедуры работы с автоматизированной системой культивирования индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК), которую мы создали в сотрудничестве с компанией, и показать репрезентативные результаты.

С момента публикации статьи в 2007 году ИПСК привлекает внимание во всем мире1. Из-за его величайшей особенности дифференцироваться в любой тип соматических клеток, ожидается, что он будет применяться в различных областях, таких как регенеративная медицина, выяснение причин трудноизлечимых заболеваний и разработка новых терапевтическихпрепаратов. Кроме того, использование соматических клеток, полученных из ИПСК человека, может сократить количество экспериментов на животных, которые подвергаются значительным этическим ограничениям. Несмотря на то, что для исследования новых методов с помощью ИПСК постоянно требуется большое количество однородных ИПСК, управление ими слишком трудоемко. Кроме того, обращение с ИПСК затруднено из-за его высокой чувствительности, даже к незначительным культурным и экологическим изменениям.

Чтобы решить эту проблему, предполагается, что автоматизированные системы культуры будут выполнять задачи вместо людей. Некоторые группы разработали несколько автоматизированных систем культивирования плюрипотентных стволовых клеток человека для поддержания и дифференцировки клеток и опубликовали свои достижения 4,5,6. Эти системы оснащены многошарнирными роботизированными манипуляторами. Достоинства роботизированных манипуляторов заключаются не только в том, что они в высокой степени имитируют движения человеческой руки, но и в том, что они требуют более высокой стоимости манипулятора (рук), более крупной и тяжелой системы и трудоемких усилий инженеров по обучению для получения целенаправленных движений 7,8. Для того, чтобы облегчить внедрение аппарата в большее количество исследовательских учреждений в точках экономического, космического и человеческого потребления, мы разработали новую автоматизированную систему культивирования для поддержания и дифференцировки ИПСК в различные типы клеток9.

Наше обоснование для новой системы заключалось в том, чтобы использовать рельсовую систему осей X-Y-Z вместо многошарнирных роботизированных манипуляторов9. Чтобы заменить сложные функции роботизированных манипуляторов, мы применили новую идею к этой системе, которая может автоматически изменять три типа конкретных функциональных наконечников манипуляторов. Здесь мы также покажем, как пользователи могут легко составлять графики задач с помощью простых заказов на программное обеспечение из-за отсутствия требований к вкладу инженеров на протяжении всего процесса.

Одна из роботизированных культуральных систем продемонстрировала создание эмбриоидных тел с использованием 96-луночных планшетов в качестве 3D-клеточных агрегатов для дифференцировки4. Система, описанная здесь, не может работать с 96-луночными планшетами. Один из них достиг текущего уровня надлежащей производственной практики (cGMP) с использованием клеточной линии, хотя это не была плюрипотентная стволоваяклетка человека. Автоматизированная система культивирования, описанная здесь, была разработана специально для помощи в лабораторных экспериментах (рис. 1). Тем не менее, он имеет достаточное количество систем для поддержания уровня чистоты, эквивалентного шкафу безопасности уровня IV.

протокол

Комитет по этике Медицинского университета Кансай одобрил создание и использование здоровых ИПСК добровольного происхождения под названием KMUR001 (одобрение No 2020197). Донор, который был открыто завербован, предоставил официальное информированное согласие и согласился с научным использованием клеток.

ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий интерфейс (специальное программное обеспечение под названием "ccssHMI", работающее под управлением операционной системы Windows XP) является основным рабочим экраном. Под вышеупомянутым интерфейсом организован ряд вкладок, позволяющих пользователям инициировать различные операции.

1. Погрузочные работы

  1. Нажмите кнопку «Загрузка » на верхнем экране программы. Нажмите кнопку Loading Preparation Start (Начало подготовки к загрузке ).
  2. Поместите тарелку (тарелки) или тарелку (тарелки), которые нужно ввести в устройство, в нужное положение в аппарате.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимая информация для идентификации тарелки должна быть написана на каждой крышке.
  3. Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.
  4. Выберите тип и количество блюд или тарелок в программном обеспечении.
  5. Нажмите кнопку Подготовка к загрузке завершена . Нажмите кнопку Loading Start .
  6. После того, как блюдо загружено в систему, выберите информацию о тарелке, например, с iPS-ячейками или без iPS-клеток, в программном обеспечении. Пропишите заметки о каждом блюде в программе.
  7. Нажмите кнопку «Регистрация » в конце, чтобы завершить операцию загрузки.

2. Операция разгрузки

  1. Нажмите кнопку «Выгрузить » на верхнем экране программного обеспечения. Выберите тарелку (тарелки), которую нужно удалить в программном обеспечении.
  2. После выбора блюд нажмите кнопку «Начало подготовки к разгрузке ». Нажмите кнопку Начало выгрузки .
  3. После того, как тарелка (тарелки) была перенесена из инкубатора на верстак в системе, нажмите кнопку Извлечение тарелки .
  4. Вручную откройте переднее раздвижное окно и выньте тарелку. Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.

3. Дополнение расходных материалов: пипеток, пробирок и сред

  1. Чтобы пополнить расходные материалы, такие как пипетки, пробирки и среда, нажмите кнопку « Расходные материалы » на верхнем экране программного обеспечения, затем выберите предмет, который нужно пополнить.
    1. Пипетки
      1. Нажмите кнопку Пипетка . Нажмите кнопку Пополнить .
      2. Выберите стойку, которую пользователь хочет пополнить на программном обеспечении. Нажмите кнопку « Пополнить начало ».
      3. Убедившись, что крышка отсека для хранения пипеток на верстаке открыта, вручную откройте переднее сдвижное окно и пополняйте пипетки по мере необходимости.
      4. Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности. Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
      5. Нажмите кнопку «Настройка пополнения » и введите информацию для пополнения, затем нажмите кнопку «Регистрация ».
      6. Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
    2. Трубы
      1. Нажмите кнопку Tube (Трубка ). Нажмите кнопку Пополнить .
      2. Выберите стойку, которую пользователь хочет пополнить на программном обеспечении. Нажмите кнопку « Пополнить начало ».
      3. Убедившись, что стойка переместилась наверх, нажмите кнопку «Пополнить трубку ».
      4. Вручную откройте переднее сдвижное окно и пополняйте трубки по мере необходимости.
      5. Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.
      6. Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
      7. Нажмите кнопку «Настройка пополнения » и введите информацию для пополнения, затем нажмите кнопку «Регистрация ». Нажмите кнопку Закрыть .
    3. Терпимая
      1. Нажмите кнопку «Средний ». Нажмите кнопку « Пополнить » в программном обеспечении.
      2. Выберите одну стойку из трех, которые пользователи хотят пополнить. Нажмите кнопку « Пополнить начало ».
      3. Убедившись, что крышка отсека для хранения носителя открыта, вручную откройте переднее сдвижное окно и пополните запас материала.
      4. Вручную закройте переднее сдвижное стекло и нажмите механическую кнопку подтверждения безопасности.
      5. Нажмите кнопку «Пополнить завершено ».
      6. Нажмите кнопку « Пополнить » и введите информацию о носителе, включая название и количество носителя. При необходимости введите дополнительные комментарии.
      7. Нажмите кнопку «Регистрация ».
      8. Нажмите кнопку Закрыть .

4. Выбор задачи

  1. Нажмите кнопку «Задача » на верхнем экране программы.
  2. Нажмите кнопку Постановка задачи . Выберите нужную задачу из списка задач и нажмите кнопку «Следующий шаг ».
  3. Укажите дату и время выполнения задачи, а затем нажмите кнопку Регистрация . Выберите блюдо или тарелку для выполнения задания, а затем нажмите кнопку Регистрация .
  4. После повторного подтверждения выбранной задачи нажмите кнопку Регистрация . Подтвердите, что задача зарегистрирована на следующем экране.
  5. При необходимости таким же образом поставьте следующую задачу.
  6. Нажмите кнопку «Пуск » в конце. После этого задача запустится автоматически в указанную дату и время.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу после завершения каждой задачи автоматически включаются УФ-лампы (расположенные с двух сторон вытяжки), а через 5-30 минут, в соответствии со вспомогательной настройкой, они выключаются, чтобы сохранить вытяжку в асептическом состоянии. Чтобы остановиться, пользователи могут нажать кнопку Пуск .
  7. Если пользователи хотят отменить запланированную задачу заранее, нажмите кнопку Остановить .
  8. После выбора задачи для прерывания нажмите кнопку Редактировать задачу .
  9. Нажмите кнопку Отмена задачи . Подтвердите, что задача удалена, на следующем экране.

5. Проверьте картинки ячеек

  1. Каждое задание включает в себя микроскопические наблюдения (фотографирование) до и после работы. Наблюдайте за процессом культивирования клеток фотографически, выполняя задание по микроскопической фотографии до или после каждого задания.
  2. Выберите предустановленные программы задач, в том числе заранее выберите несколько конкретных местоположений чашки или лунки для наблюдения с фиксированной точкой для мониторинга одного и того же местоположения с течением времени.

6. Пассаж и дифференциация

  1. Выполните действия, описанные в разделах 1-5, и настройте автоматизированную систему культивирования клеток для выполнения пассажа и дифференцировки. Настройки приборов для пассажа, дифференцировки кардиомиоцитов, дифференцировки гепатоцитов, дифференцировки нейральных клеток-предшественников и дифференцировки кератиноцитов приведены в таблице 1, таблице 2, таблице 3, таблице 4 и таблице 5 соответственно.

Результаты

Поддержание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека
Мы использовали три линии hPSC (RIKEN-2F, 253G1 и KMUR001). Мы оптимизировали протокол технического обслуживания с помощью ежедневных экспериментов, выполняемых вручную, и дополнительно оптимизировали подробные прог...

Обсуждение

Критически важным шагом в протоколе является то, что если пользователь обнаружит какие-либо неисправности, нажмите кнопку отмены, остановки или сброса в любое время и начните с первого шага. Программное обеспечение позволяет избежать человеческих ошибок, в том числе двойного брониров?...

Раскрытие информации

Автору нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было поддержано грантом Центра содействия развитию нового бизнеса, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Осака, Япония.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.15% bovine serum albumin fraction VFuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan9048-46-8
1% GlutaMAXThermo Fisher Scientific35050061
10 cm plastic plates Corning Inc., NY, United States430167
253G1RKEN Bioresource Research CenterHPS0002
2-mercaptoethanolThermo Fisher Scientific21985023
Actinin  mouseAbcamab9465
Activin A Nacali Tesque18585-81
AdenineThermo Fisher ScientificA14906.30
Albumin  rabbitDakoA0001
All-trans retinoic acidFuji Film Wako Chemical Inc. 186-01114
Automated culture systemPanasonic
B-27 supplementThermo Fisher Scientific17504044
bFGFFuji Film Wako Chemical Inc. 062-06661
BMP4 Thermo Fisher ScientificPHC9531
Bovine serum albuminMerck810037
CHIR-99021 MCE, NJ, United States #HY-10182252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFMThermo Fisher Scientific10744019Human keratinocyte medium
DexamethasoneMerck266785
Dihexa TRC, Ontario, Canada13071-60-8rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometerCountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher ScientificC10228
DorsomorphinThermo Fisher Scientific1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 Fuji Film Wako Chemical Inc.12634010
EGFFuji Film Wako Chemical Inc. 053-07751
Essential 8 Thermo Fisher ScientificA1517001Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum Biowest, FL, United StatesS140T
FGF-basic Nacalai Tesque Inc.19155-07
ForskolinThermo Fisher ScientificJ63292.MF
GlutamineThermo Fisher Scientific25030081Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA11056
HNF-4A  goatSantacruz6556
HydrocortisoneThermo Fisher ScientificA16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinateMerckH2882
iMatrix511 Silk Nippi Inc., Tokyo, Japan892 021Cell culture matrix
Insulin-transferrin-seleniumThermo Fisher Scientific41400045
Keratin 1  mouseSantacruz376224
Keratin 10  rabbitBioLegend19054
KMUR001Kansai Medical University Patient-derived iPSCs 
Knockout serum replacementThermo Fisher Scientific10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate A8960, MerckA8960
Leibovitz’s L-15 medium Fuji Film Wako Chemical Inc.128-06075
MatrigelCorning Inc.354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21202
N-2 supplementThermo Fisher Scientific17502048
Nestin mouseSantacruz23927
Neurobasal mediumThermo Fisher Scientific21103049
Neurofilament  rabbitChemiconAB1987
NeutristemSartrius AG, Göttingen, Germany05-100-1Acell culture medium 
Oct 3/4  mouseBD611202
PBS(-)Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488Thermo ScientificA21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546Thermo ScientificA10040
Recombinant human albumin A0237, Merck, Darmstadt, GermanyA9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632 Sellec Inc., Tokyo, Japan129830-38-2
RIKEN 2FRKEN Bioresource Research CenterHPS0014undifferentiated hiPSCs 
RPMI 1640 Thermo Fisher Scientific #1187512633020
SB431542Thermo Fisher Scientific301836-41-9
Sodium L-ascorbateMerckA4034-100G
SSEA-4  mouseMilliporeMAB4304
StemFit AK02N Ajinomoto, Tokyo, JapanAK02cell culture medium 
TnT rabbitAbcamab92546
TRA 1-81 mouseMilliporeMAB4381
TriiodothyronineThermo Fisher ScientificH34068.06
TripLETM express enzyme Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States12604013
Trypan blue solution Nacalai Tesque, Kyoto, Japan20577-34
Tryptose phosphate brothMerckT8782-500G
Wnt-C59 Bio-techne, NB, United Kingdom5148
β figure-materials-6381 Tublin  mousePromegaG712A

Ссылки

  1. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  2. Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
  3. Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
  4. Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
  5. Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
  6. Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647 (2015).
  7. McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
  8. Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41 (2017).
  9. Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990 (2022).
  10. Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
  11. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  12. Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
  13. Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
  14. International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
  15. Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены