Un sistema de cultivo automatizado para mantener y diferenciar células madre pluripotentes inducidas por humanos

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para un sistema automatizado de cultivo celular. Este sistema de cultivo automatizado reduce la mano de obra y beneficia a los usuarios, incluidos los investigadores que no están familiarizados con el manejo de células madre pluripotentes inducidas (iPS), desde el mantenimiento de las células iPS hasta la diferenciación en varios tipos de células.

Resumen

Se espera que las células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSC) con una capacidad infinita de autoproliferación tengan aplicaciones en numerosos campos, incluida la elucidación de patologías de enfermedades raras, el desarrollo de nuevos medicamentos y la medicina regenerativa con el objetivo de restaurar órganos dañados. A pesar de ello, la implementación social de las hiPSC sigue siendo limitada. Esto se debe, en parte, a la dificultad de reproducir la diferenciación en la cultura, incluso con conocimientos avanzados y habilidades técnicas sofisticadas, debido a la alta sensibilidad de las iPSC a los cambios ambientales más pequeños. La aplicación de un sistema de cultivo automatizado puede resolver este problema. Se pueden esperar experimentos con alta reproducibilidad, independientemente de la habilidad de un investigador, de acuerdo con un procedimiento compartido entre varios institutos. Aunque anteriormente se han desarrollado varios sistemas de cultivo automatizados que pueden mantener cultivos iPSC e inducir la diferenciación, estos sistemas son pesados, grandes y costosos porque hacen uso de brazos robóticos humanizados y multiarticulados. Para mejorar los problemas anteriores, desarrollamos un nuevo sistema que utiliza un sistema de rieles deslizantes de eje x-y-z simple, lo que le permite ser más compacto, liviano y económico. Además, el usuario puede modificar fácilmente los parámetros del nuevo sistema para desarrollar nuevas tareas de manipulación. Una vez que se establece una tarea, todo lo que el usuario debe hacer es preparar el iPSC, suministrar los reactivos y consumibles necesarios para la tarea deseada con anticipación, seleccionar el número de tarea y especificar el tiempo. Confirmamos que el sistema podía mantener las iPSC en un estado indiferenciado a través de varios pasajes sin células alimentadoras y diferenciarse en varios tipos de células, incluidos cardiomiocitos, hepatocitos, progenitores neurales y queratinocitos. El sistema permitirá experimentos altamente reproducibles en todas las instituciones sin necesidad de investigadores cualificados y facilitará la implementación social de las hiPSC en una gama más amplia de campos de investigación al disminuir los obstáculos para nuevas entradas.

Introducción

Este artículo tiene como objetivo proporcionar procedimientos de manejo reales y detallados para un sistema de cultivo automatizado de células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSC), que producimos en colaboración con una empresa, y mostrar resultados representativos.

Desde la publicación del artículo en 2007, iPSC ha atraído la atención de todo el mundo¹. Debido a su mayor característica de poder diferenciarse en cualquier tipo de célula somática, se espera que se aplique en diversos campos como la medicina regenerativa, la elucidación de las causas de enfermedades intratables y el desarrollo de nuevos fármacos terapéuticos ^2,3. Además, el uso de células somáticas humanas derivadas de iPSC podría reducir los experimentos con animales, que están sujetos a importantes restricciones éticas. Aunque se requieren constantemente numerosas iPSC homogéneas para investigar nuevos métodos con iPSC, es demasiado laborioso gestionarlas. Además, el manejo de iPSC es difícil debido a su alta sensibilidad, incluso a cambios culturales y ambientales sutiles.

Para resolver este problema, se espera que los sistemas de cultivo automatizados realicen tareas en lugar de humanos. Algunos grupos han desarrollado algunos sistemas automatizados de cultivo de células madre pluripotentes humanas para el mantenimiento y la diferenciación celular y han publicado sus logros ^4,5,6. Estos sistemas equipan brazos robóticos multiarticulados. Los brazos robóticos no solo tienen el mérito de imitar en gran medida los movimientos de los brazos humanos, sino también el de que requieren costos más altos para los brazos, un empaquetamiento del sistema más grande y pesado, y esfuerzos educativos que consumen mucho tiempo por parte de los ingenieros para obtener los movimientos deseados ^7,8. Con el fin de facilitar la introducción del aparato en más instalaciones de investigación en los puntos de consumo económico, espacial y de recursos humanos, hemos desarrollado un novedoso sistema de cultivo automatizado para el mantenimiento y diferenciación de iPSC en varios tipos de células⁹.

Nuestra justificación para el nuevo sistema fue adoptar un sistema de rieles de eje X-Y-Z en lugar de brazos robóticos multiarticulados⁹. Para reemplazar las complejas funciones similares a las manos de los brazos robóticos, aplicamos una nueva idea a este sistema, que puede cambiar automáticamente tres tipos de puntas de brazo funcionales específicas. Aquí, también indicamos cómo los usuarios pueden hacer fácilmente programaciones de tareas con pedidos simples en el software debido a la falta de requisitos para las contribuciones de los ingenieros a lo largo del proceso.

Uno de los sistemas de cultivo robótico ha demostrado la fabricación de cuerpos embrioides utilizando placas de 96 pocillos como agregados celulares 3D para la diferenciación⁴. El sistema que se informa aquí no puede manejar placas de 96 pocillos. Una de ellas alcanzó el grado actual de buenas prácticas de fabricación (cGMP) utilizando una línea celular, aunque no se trataba de una célula madre pluripotente humana⁵. El sistema de cultivo automatizado que se detalla aquí se ha desarrollado con el objetivo específico de ayudar a los experimentos de laboratorio (Figura 1). Sin embargo, cuenta con suficientes sistemas para mantener limpios niveles equivalentes a los de un armario de seguridad de nivel IV.

Protocolo

El Comité de Ética de la Universidad Médica de Kansai aprobó la generación y el uso de las iPSC sanas derivadas de voluntarios denominadas KMUR001 (aprobación n.º 2020197). El donante, que fue reclutado abiertamente, dio su consentimiento informado formal y estuvo de acuerdo con el uso científico de las células.

NOTA: La interfaz actual (el software especial llamado "ccssHMI" que se ejecuta en el sistema operativo Windows XP) es la pantalla de operación fundamental. En la interfaz antes mencionada, se organizan una serie de pestañas que permiten a los usuarios iniciar diversas operaciones.

1. Operaciones de carga

1. Haga clic en el botón Cargar en la pantalla superior del software. Haga clic en el botón Inicio de preparación de carga .
2. Coloque el(los) plato(s) o plato(s) que se introducirá en el aparato en su posición en el aparato.
   NOTA: La información necesaria para la identificación del plato debe estar escrita en cada tapa.
3. Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
4. Seleccione el tipo y la cantidad de plato(s) o plato(s) en el software.
5. Haga clic en el botón Preparación de carga completada . Haga clic en el botón Inicio de carga .
6. Después de cargar una antena parabólica en el sistema, seleccione la información de la antena, como con celdas iPS o sin celdas iPS, en el software. Registre notas sobre cada plato en el software.
7. Haga clic en el botón Registro al final para completar la operación de carga.

2. Operación de descarga

1. Haga clic en el botón Descargar en la pantalla superior del software. Seleccione los platos que desea eliminar en el software.
2. Después de seleccionar los platos, haga clic en el botón Inicio de preparación de descarga . Haga clic en el botón Inicio de descarga .
3. Después de que la(s) placa(s) se haya transferido(s) de la incubadora al banco de trabajo del sistema, presione el botón Extracción de platos .
4. Abra manualmente la ventana corredera frontal y saque los platos. Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.

3. Suplemento de consumibles: pipetas, tubos y medio

1. Para reponer consumibles como pipetas, tubos y medios, haga clic en el botón Consumibles en la pantalla superior del software y, a continuación, seleccione el artículo que desea reponer.
   1. Pipetas
      1. Haga clic en el botón Pipeta . Seleccione el botón Reabastecer .
      2. Seleccione un bastidor que el usuario desee reabastecer en el software. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
      3. Después de confirmar que la tapa del área de almacenamiento de pipetas en el banco de trabajo está abierta, abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga las pipetas según sea necesario.
      4. Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad. Haga clic en el botón Reabastecer completado .
      5. Haga clic en el botón Configuración de reabastecimiento e introduzca la información para el reabastecimiento, luego haga clic en el botón Registro .
      6. Haga clic en el botón Reabastecer completado .
   2. Tubos
      1. Haz clic en el botón Tubo . Seleccione el botón Reabastecer .
      2. Seleccione un bastidor que el usuario desee reabastecer en el software. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
      3. Después de confirmar que la rejilla se ha movido a la parte superior, haga clic en el botón Reabastecer tubo .
      4. Abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga los tubos según sea necesario.
      5. Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
      6. Haga clic en el botón Reabastecer completado .
      7. Haga clic en el botón Configuración de reabastecimiento e introduzca la información para el reabastecimiento, luego haga clic en el botón Registro . Haga clic en el botón Cerrar .
   3. Medio
      1. Haga clic en el botón Medio . Seleccione el botón Reabastecer en el software.
      2. Seleccione un bastidor de los tres que los usuarios desean reabastecer. Haga clic en el botón Iniciar reabastecimiento .
      3. Después de confirmar que se ha abierto la tapa del área de almacenamiento mediana, abra manualmente la ventana corredera frontal y reponga el medio.
      4. Cierre manualmente la ventana corredera delantera y presione el botón mecánico de confirmación de seguridad.
      5. Haga clic en el botón Reabastecer completado .
      6. Haga clic en el botón Reabastecer e introduzca la información del medio, incluido el nombre y la cantidad del medio. Introduzca comentarios adicionales si es necesario.
      7. Haga clic en el botón Registro .
      8. Haga clic en el botón Cerrar .

4. Selección de tareas

1. Haga clic en el botón Tarea en la pantalla superior del software.
2. Seleccione el botón Configuración de tareas . Seleccione la tarea deseada de la lista de tareas y haga clic en el botón Siguiente paso .
3. Especifique la fecha y la hora para realizar la tarea y, a continuación, haga clic en el botón Registro . Seleccione un plato para realizar la tarea y, a continuación, haga clic en el botón Registro .
4. Después de volver a confirmar la tarea seleccionada, haga clic en el botón Registro . Confirme que la tarea se ha registrado en la siguiente pantalla.
5. Si es necesario, establezca la siguiente tarea de la misma manera.
6. Haga clic en el botón Inicio al final. A continuación, la tarea se iniciará automáticamente en la fecha y hora especificadas.
   NOTA: Inmediatamente después de terminar cada tarea, las luces UV (ubicadas en ambos lados de la campana) se encienden automáticamente y, después de 5-30 minutos, de acuerdo con la configuración auxiliar, se apagan para mantener la campana en condiciones asépticas. Para detenerlo, los usuarios pueden hacer clic en el botón Inicio .
7. Si los usuarios desean cancelar una tarea programada por adelantado, haga clic en el botón Detener .
8. Después de seleccionar la tarea que se va a anular, haga clic en el botón Editar tarea .
9. Haga clic en el botón Cancelar tarea . Confirme que la tarea se ha eliminado en la siguiente pantalla.

5. Revisa las imágenes de las celdas

1. Cada tarea incluye observaciones microscópicas (toma de fotos) antes y después del trabajo de la tarea. Observar fotográficamente el progreso del cultivo celular incorporando una tarea de fotografía microscópica antes o después de cada tarea.
2. Seleccione programas de tareas preestablecidos, incluida la selección de múltiples ubicaciones específicas del plato o la placa de pocillos con anticipación para la observación de puntos fijos para monitorear la misma ubicación a lo largo del tiempo.

6. Pasaje y diferenciación

1. Siga los pasos de las secciones 1 a 5 y configure el sistema automatizado de cultivo celular para realizar el paso y la diferenciación. Los ajustes del instrumento para el paso, la diferenciación de cardiomiocitos, la diferenciación de hepatocitos, la diferenciación de células precursoras neurales y la diferenciación de queratinocitos se muestran en la Tabla 1, Tabla 2, Tabla 3, Tabla 4 y Tabla 5, respectivamente.

Resultados

Mantenimiento de células madre pluripotentes inducidas por humanos
Se utilizaron tres líneas hPSC (RIKEN-2F, 253G1 y KMUR001). Hemos optimizado el protocolo de mantenimiento a través de experimentos diarios realizados manualmente y optimizado aún más los programas detallados a través de los siete experimentos preliminares realizados por el sistema. Por ejemplo, las tensiones de cizallamiento causadas por las velocidades del líquido del flujo de saliva de diferentes pipetas manejadas por humanos...

Discusión

Un paso crítico en el protocolo es que si un usuario encuentra alguna falla, haga clic en el botón cancelar, detener o restablecer en cualquier momento y comience de nuevo desde el primer paso. El software puede evitar errores humanos, como la doble reserva, la apertura de puertas mientras las tareas del sistema están activas y la falta de reabastecimiento. Otro punto crítico para una diferenciación exitosa y eficiente a la célula somática deseada es la selección adecuada de líneas de células madre pluripotente...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.15% bovine serum albumin fraction V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
10 cm plastic plates	Corning Inc., NY, United States	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoethanol	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinin  mouse	Abcam	ab9465
Activin A	Nacali Tesque	18585-81
Adenine	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumin  rabbit	Dako	A0001
All-trans retinoic acid	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Automated culture system	Panasonic
B-27 supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Bovine serum albumin	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, United States #HY-10182	252917-06-9
Defined Keratinocyte-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Human keratinocyte medium
Dexamethasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-Dihexadecylglycerol
Disposable hemocytometer	CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorphin	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco’s modified Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.	12634010
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essential 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Human pluripotent stem cell medium
Fetal bovine serum	Biowest, FL, United States	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.MF
Glutamine	Thermo Fisher Scientific	25030081	Glutamine supplement
Goat IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  goat	Santacruz	6556
Hydrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Hydrocortisone 21-hemisuccinate	Merck	H2882
iMatrix511 Silk	Nippi Inc., Tokyo, Japan	892 021	Cell culture matrix
Insulin-transferrin-selenium	Thermo Fisher Scientific	41400045
Keratin 1  mouse	Santacruz	376224
Keratin 10  rabbit	BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		Patient-derived iPSCs
Knockout serum replacement	Thermo Fisher Scientific	10828010
L-ascorbic acid 2-phosphate	A8960, Merck	A8960
Leibovitz’s L-15 medium	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.	354277
Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
N-2 supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin mouse	Santacruz	23927
Neurobasal medium	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilament  rabbit	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Göttingen, Germany	05-100-1A	cell culture medium
Oct 3/4  mouse	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan	14249-24
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Recombinant human albumin	A0237, Merck, Darmstadt, Germany	A9731
Rho kinase inhibitor, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Japan	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	undifferentiated hiPSCs
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020
SB431542	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodium L-ascorbate	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore	MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Japan	AK02	cell culture medium
TnT rabbit	Abcam	ab92546
TRA 1-81 mouse	Millipore	MAB4381
Triiodothyronine	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM express enzyme	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States	12604013
Trypan blue solution	Nacalai Tesque, Kyoto, Japan	20577-34
Tryptose phosphate broth	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, United Kingdom	5148
β  Tublin  mouse	Promega	G712A