التشخيص السريع القائم على تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) لعدوى هيليكوباكتر بيلوري ومقاومة المضادات الحيوية

Summary

يقدم البروتوكول طريقة غير جراحية للتشخيص السريع لعدوى المعدة هيليكوباكتر بيلوري من خلال اختبار الأوتار ويحدد مقاومتها للمضادات الحيوية للكلاريثروميسين والليفوفلوكساسين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR).

Abstract

هيليكوباكتر بيلوري هي أحد مسببات الأمراض البشرية الرئيسية التي تصيب ما يقرب من نصف سكان العالم وأصبحت تهديدا صحيا خطيرا بسبب مقاومتها المتزايدة للمضادات الحيوية. وهو العامل المسبب لالتهاب المعدة النشط المزمن ومرض القرحة الهضمية وسرطان المعدة وقد تم تصنيفه على أنه مادة مسرطنة من المجموعة الأولى من قبل الوكالة الدولية لبحوث السرطان. لذلك ، فإن التشخيص السريع والدقيق لبكتيريا الملوية البوابية وتحديد مقاومتها للمضادات الحيوية مهمان للقضاء الفعال على هذا العامل الممرض البكتيري. حاليا ، تشمل طرق تشخيص H. pylori بشكل أساسي اختبار التنفس اليوريا (UBT) ، واختبار المستضد ، واختبار الأجسام المضادة في الدم ، وتنظير المعدة ، واختبار اليورياز السريع (RUT) ، والثقافة البكتيرية. من بينها ، طرق الكشف الثلاثة الأولى غير جراحية ، مما يعني أنها اختبارات سهلة الإجراء. ومع ذلك ، لا يمكن استرداد البكتيريا من خلال هذه التقنيات. وبالتالي ، لا يمكن إجراء اختبار مقاومة الأدوية. الثلاثة الأخيرة هي فحوصات غازية ، لكنها مكلفة ، وتتطلب مهارات عالية ، ولديها القدرة على التسبب في ضرر للمرضى. لذلك ، فإن الطريقة غير الغازية والسريعة والمتزامنة للكشف عن H. pylori واختبار مقاومة الأدوية مهمة جدا للقضاء على H. pylori بكفاءة في الممارسة السريرية . يهدف هذا البروتوكول إلى تقديم إجراء محدد يتضمن اختبار الأوتار بالاشتراك مع تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للكشف السريع عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة المضادات الحيوية. على عكس المزارع البكتيرية ، تسمح هذه الطريقة بالتشخيص السهل والسريع وغير الباضع لحالة عدوى الملوية البوابية ومقاومة الأدوية. على وجه التحديد ، استخدمنا qPCR للكشف عن rea لعدوى H. pylori والطفرات في جينات 23S rRNA و gyrA ، والتي تشفر المقاومة ضد كلاريثروميسين وليفوفلوكساسين ، على التوالي. بالمقارنة مع تقنيات الاستزراع المستخدمة بشكل روتيني ، يوفر هذا البروتوكول تقنية غير جراحية ومنخفضة التكلفة وموفرة للوقت للكشف عن عدوى الملوية البوابية وتحديد مقاومتها للمضادات الحيوية باستخدام qPCR.

Introduction

H. pylori هي بكتيريا حلزونية الشكل ، شديدة الحركة ، سالبة الجرام تعيش بشكل رئيسي في منطقة البواب في المعدة¹. إنه ممرض شائع يصيب ما يقرب من 50٪ من سكان العالم². معظم الأشخاص المصابين بعدوى الملوية البوابية ليس لديهم مظاهر سريرية ، ومعظمهم يصابون بأمراض مختلفة بعد عدة سنوات من العدوى ، بما في ذلك التهاب المعدة المزمن والقرحة الهضمية وقرحة المعدة وسرطان المعدة³. في العديد من الدراسات القائمة على مجموعات سكانية مختلفة ، تم إثبات فعالية القضاء على H. pylori للوقاية من سرطان المعدة والآفات السابقة للتسرطن ^4,5. لذلك ، ن....

Protocol

أجريت هذه الدراسة وفقا للاعتبارات الأخلاقية التي وضعتها اللجنة الأخلاقية لمستشفى مقاطعة قوانغدونغ الشعبي ، الجامعة الطبية الجنوبية ، قوانغتشو ، الصين (رقم الموافقة: KY-Q-2022-384-02). تم تضمين المرضى في الفئة العمرية 18-60 سنة في هذه الدراسة. لم يتم تضمين المرضى الذين يتناولون المضادات الحيوية والأدوية الصينية المضادة للبكتيريا والأدوية مثل مثبطات مضخة البروتون (PPI) أو مضادات مستقبلات H₂ ، وما إلى ذلك ، في غضون أسبوعين قبل الاختبار في هذه الدراسة. كما تم استبعاد المرضى الذين تلقوا العلاج ضد H.pylori في الأشهر ال 3 الماضية من هذه الدراسة. كما لم يسمح لأولئك الذين يعانون من مشاكل خطيرة في القلب أو الكبد أو الكلى أو الاعتلال العصبي الحاد أو الأمراض ا....

النتائج

الكشف عن عدوى الملوية البوابية ومقاومة المضادات الحيوية في سوائل المعدة بواسطة qPCR
أجرينا qPCR للكشف عن عدوى الملوية البوابية عن طريق تضخيم جين ureA وتحديد ملف مقاومته للمضادات الحيوية من خلال استهداف طفرات نقطية في جين 23S rRNA وجين gyrA (الجدول 1). كانت قيم ا?.......

Discussion

يمكن إجراء الكشف عن بكتيريا الملوية البوابية باستخدام كل من الطرق الغازية وغير الغازية¹³. تتطلب التقنيات الغازية شائعة الاستخدام مثل التشريح المرضي واختبار اليورياز السريع وتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) والزراعة البكتيرية التنظير الداخلي والخزعة. يوصى بإجراء الاختبا.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent