אבחון מהיר מבוסס תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) של זיהום הליקובקטר פילורי ועמידות לאנטיביוטיקה

Summary

הפרוטוקול מציג שיטה לא פולשנית לאבחון מהיר של זיהומי קיבה של הליקובקטר פילורי באמצעות בדיקת מיתרים וקובע את עמידותו האנטיביוטית לקלריתרומיצין ולבופלוקסצין באמצעות תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR).

Abstract

הליקובקטר פילורי הוא פתוגן אנושי עיקרי המדביק כמחצית מאוכלוסיית העולם והופך לאיום בריאותי חמור בשל עמידותו הגוברת לאנטיביוטיקה. זהו הגורם הסיבתי של דלקת גסטריטיס פעילה כרונית, מחלת כיב פפטי וסרטן קיבה והוא סווג כמסרטן מקבוצה I על ידי הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן. לכן, האבחון המהיר והמדויק של H. pylori וקביעת עמידותו לאנטיביוטיקה חשובים למיגור יעיל של פתוגן חיידקי זה. כיום, שיטות האבחון של H. pylori כוללות בעיקר את בדיקת הנשימה אוריאה (UBT), בדיקת האנטיגן, בדיקת נוגדנים בסרום, גסטרוסקופיה, בדיקת אוראז מהיר (RUT) ותרבית חיידקים. ביניהן, שלוש שיטות הגילוי הראשונות אינן פולשניות, כלומר הן בדיקות קלות לביצוע. עם זאת, לא ניתן לאחזר חיידקים באמצעות טכניקות אלה; לפיכך, לא ניתן לבצע בדיקות עמידות לתרופות. שלוש האחרונות הן בדיקות פולשניות, אך הן יקרות, דורשות מיומנויות גבוהות ויש להן פוטנציאל לגרום נזק לחולים. לכן, שיטה לא פולשנית, מהירה וסימולטנית לזיהוי H . pylori ובדיקת עמידות לתרופות חשובה מאוד למיגור יעיל של H. pylori בפרקטיקה הקלינית. פרוטוקול זה נועד להציג הליך ספציפי הכולל את בדיקת המיתרים בשילוב עם תגובת שרשרת כמותית של פולימראז (qPCR) לזיהוי מהיר של זיהום H. pylori ועמידות לאנטיביוטיקה. בניגוד לתרביות חיידקים, שיטה זו מאפשרת אבחון קל, מהיר ולא פולשני של מצב זיהום הליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות. באופן ספציפי, השתמשנו ב-qPCR כדי לזהות rea עבור זיהום H. pylori ומוטציות בגנים 23S rRNA ו-gyrA , אשר מקודדים עמידות נגד clarithromycin ו-levofloxacin, בהתאמה. בהשוואה לטכניקות גידול שגרתיות, פרוטוקול זה מספק טכניקה לא פולשנית, בעלות נמוכה וחוסכת זמן כדי לזהות זיהום H. pylori ולקבוע את עמידותו לאנטיביוטיקה באמצעות qPCR.

Introduction

H. pylori הוא חיידק בצורת ספירלה, תנועתי מאוד, גראם-שלילי שחי בעיקר באזור הפילורוס של הקיבה¹. זהו פתוגן נפוץ שמדביק כמעט 50% מאוכלוסיית העולם². לרוב האנשים עם זיהום H. pylori אין ביטויים קליניים, ורובם מפתחים מחלות שונות לאחר מספר שנים של זיהום, כולל דלקת קיבה כרונית, כיבים פפטיים, כיבי קיבה וסרטן קיבה³. במספר מחקרים המבוססים על אוכלוסיות שונות,^הודגמה יעילות סילוק H. pylori למניעת סרטן הקיבה ונגעים טרום סרטניים ^4,5. לכן, ארגון הבריאות העולמי (WHO) הסוכנות הבינלאומית לחקר הסרטן המליצה על מיגור H. pylori כאמצעי מניעה⁶.

השימוש בשיטות לא פולשניות לזיהוי זיהום H. pylori הוא מרכיב מרכזי בטיפול עבור רוב האנשים עם דיספפסיה אסימפטומטית. בדיקת נשימה אוריאה (UBT), בדיקת אנטיגן צואה H. pylori (SAT) ובדיקות סרולוגיות הן טכניקות לא פולשניות פופולריות. מבין אלה, UBT הוא ההליך הכי פחות פולשני ומדויק ביותר שיש. UBT משתמש באוראז, המצוי בשפע בהליקובקטר פילורי, כדי לבצע הידרוליזה של אוריאה עם תווית איזוטופית לאמוניה ופחמן דו חמצני (13C או 14C). לעומת זאת, הבדיקה האימונוכרומטוגרפית (ICA)⁷ נוחה, פשוטה ולא פולשנית לדגימה. עם זאת, דיוק הבדיקה מושפע ממספר גורמים, כגון איכות דגימת הצואה, הטמפרטורה והמרווח בין איסוף הדגימה לבדיקה. בדיקה נוספת המבוססת על התגובה החיסונית היא בדיקת נוגדנים בסרום H. pylori , המזהה נוגדנים בסרום של המטופל. עם זאת, בדיקה זו אינה מתאימה לניתוח לאחר הטיפול שכן הנוגדנים נשארים זמן רב לאחר ניקוי החיידק⁸. חסרון משמעותי נוסף הוא ששיטות אלה מאבחנות רק זיהום בהליקובקטר פילורי ואינן מאפשרות בדיקות עמידות לתרופות כדי להנחות טיפול מבוסס רגישות.

עבור שיטות בדיקה פולשניות, רקמת ביופסיית קיבה צריכה להילקח על ידי אנדוסקופיה ולאחר מכן נתון להיסטולוגיה, הבדיקה המהירה urase, ואת התרבות חיידקית. שיטות בדיקה אלה גם מוגבלות מאוד בשל מספר גורמים. כיום, טכניקות אלה מוגבלות לחולים קשישים, חולים בסיכון גבוה למחלה טרום סרטנית או ממאירה, וחולים שנכשלו בטיפול קו ראשון למחלת ריפלוקס קיבתי-ושטי או זיהום H. pylori ⁹. שנית, בשל מאפייני הגידול הייחודיים של H. pylori, שיעור ההצלחה של תרבית חיידקים מגיע רק 50%¹⁰. לפיכך, שיטות זיהוי מולקולרי מציעות תקווה חדשה להתגבר על הדרישות הגבוהות של שיטות גילוי פולשניות ולהנחות טיפול מבוסס רגישות. בין שיטות הזיהוי המולקולרי, PCR כמותי התפתח מאוד בשנים האחרונות. qPCR, בניגוד ל-PCR מסורתי, אינו דורש אלקטרופורזה בג'ל ומכמת במדויק DNA/RNA בדגימות על ידי הוספת פריימרים ובדיקות בשלב החישול. ערכות qPCR לזיהוי זיהום H. pylori ועמידות לתרופות זמינות כעת באופן מסחרי. עם זאת, לכל שיטה יש מגבלות; לכן, יש לשקול את האבחנה הקלינית והטיפול של המטופל בשילוב עם הסימפטומים שלו, הסימנים, ההיסטוריה, בדיקות מעבדה אחרות והתגובה לטיפול.

כיום, השיטה העיקרית לטיפול בזיהומים מסוג H.pylori היא נטילת אנטיביוטיקה, אך לאחרונה נעשה קשה יותר ויותר לטפל בזיהומים אלה בשל העלייה בעמידות לאנטיביוטיקה. לאחר מכן, נצפתה ירידה משמעותית ביעילות הטיפול בהליקובקטר פילורי ברחבי העולם, מה שהופך את מיגור ההליקובקטר פילורי לבעיה מרכזית בבריאות הציבור¹¹.

Clarithromycin ו- levofloxacin הן שתי האנטיביוטיקות רחבות הטווח המשמשות לטיפול בזיהומים הנגרמים על ידי H.pylori, אך מספר מחקרים דיווחו על עמידות נרחבת נגד שתי תרופות אלה במבודדי H.pylori. A2143G, A2142G ו-A2142C הן שלוש מתוך מוטציות נקודתיות רבות שנמצאו בגן rRNA 23S 2.9 kb שגורמות לעמידות לקלריתרומיצין על ידי מניעת קישור המקרוליד. יחד עם זאת, מוקדי המוטציה של הגן לעמידות ללבופלוקסצין ממוקמים בעיקר בששת אתרי המוטציות (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) של הגן gyrA ¹². גילוי מנגנוני עמידות אלה המבוססים על מוטציות גנטיות הוביל למעבר הדרגתי בזיהוי H. pylori דרך מחקרים מבוססי תרבות לבדיקות מולקולריות.

באופן כללי, קיים צורך קליני דחוף בשיטת אבחון לא פולשנית, יעילה וסימולטנית לאיתור זיהומים בהליקובקטר פילורי ועמידות לתרופות. אימצנו בדיקת מחרוזת משולבת ושיטת qPCR כדי להתגבר על קשיי הדגימה ולהשיג את המטרה של זיהוי סימולטני של זיהום H. pylori ועמידות לתרופות באמצעות בדיקות פריימר שונות.

Protocol

המחקר הנוכחי נערך בהתאם לשיקולים אתיים שנקבעו על ידי הוועדה האתית של בית החולים העממי המחוזי גואנגדונג, האוניברסיטה הרפואית הדרומית, גואנגג'ואו, סין (מספר אישור: KY-Q-2022-384-02). חולים בטווח הגילאים 18-60 נכללו במחקר זה. חולים הנוטלים אנטיביוטיקה, תרופות סיניות אנטיבקטריאליות, תרופות כגון מעכבי משאבת פרוטונים (PPI), או אנטגוניסטים לקולטן H₂ וכו ', בתוך שבועיים לפני הבדיקה לא נכללו במחקר זה. חולים שקיבלו טיפול נגד H.pylori בשלושת החודשים האחרונים לא נכללו גם במחקר זה. אנשים עם בעיות לב, כבד, כליות, נוירופתיה חמורה או מחלות נפש לא הורשו גם הם להשתתף במחקר זה. במחקר זה לא נכללו נשים הרות ואמהות מניקות. פירוט האספקה (ריאגנטים, כימיקלים, ציוד ותוכנות) שנעשה בהם שימוש במחקר זה מופיע בטבלת החומרים.

1. בדיקת מחרוזת לדגימת מי קיבה

1. בקשו מהמטופל לצום לילה לפני איסוף הדגימה.
2. למחרת, פתחו את ערכת בדיקת המיתרים, קחו את הקפסולה והחזיקו את הלולאה בקצה המיתר.
3. הדביקו את החוט על לחיו של המטופל, ובקשו ממנו להניח את הקפסולה על לשונו בסמוך לחלק האחורי של הגרון ולבלוע אותה בלגימת מים.
4. יש לאפשר לקפסולה להתמוסס בקיבתו של המטופל, ובכך לחשוף את החוט בתוך הקפסולה לספיגת ריר קיבה.
5. בקש מעוזר מיומן למשוך את החוט בזהירות שעה אחת לאחר שהמטופל בלע את הקפסולה.
6. חתכו את הקצה התחתון של החוט (40 ס"מ) הספוג בנוזל הקיבה, הניחו אותו בתמיסת שימור הדגימות TSE (Tris/מלוחים/EDTA), ולאחר מכן שלחו אותו למעבדה הקלינית בטמפרטורת החדר (RT) לגילוי הבא של H. pylori ולקביעת פרופילי העמידות לאנטיביוטיקה באמצעות qPCR.

2. מיצוי DNA

1. הניחו את המבחנות נושאות הדגימות על מדף מבחנה, מסומן כראוי, וערבבו אותן במשך 10 שניות.
2. הפוך את צלחת 32 הבארות (מיצוי חומצת גרעין או ערכת טיהור) מספר פעמים כדי להשהות מחדש את החרוזים המגנטיים. לאחר מערבולת קצרה במשך 10 שניות, הסירו בזהירות את איטום רדיד האלומיניום מהצלחת.
3. העברת 200 μL של נוזל קיבה מכל דגימה ו- H. pylori DNA כבקרה חיובית לבארות נפרדות.
4. הניחו את צלחת 32 הבארות בחריץ הדגימה המתאים של מכונת מיצוי חומצות הגרעין למיצוי DNA אוטומטי.
5. לאחר מיצוי ואישור DNA, התחל את בדיקת עמידות לאנטיביוטיקה עבור clarithromycin ו levofloxacin באמצעות qPCR על הדגימות החיוביות.
6. הניחו את נוזל הקיבה העודף ואת דגימות הדנ"א שחולצו בטמפרטורה של -20°C לאחסון לטווח ארוך ולשימוש עתידי.
7. בצע את כל השלבים הללו בארון בטיחות ביולוגית כדי למנוע זיהום.

3. qPCR לאיתור H. pylori ועמידות לאנטיביוטיקה (clarithromycin ו levofloxacin)

1. לבצע qPCR לזיהוי H. pylori ואת המוטציות החשודות עמידות לאנטיביוטיקה בגנום שלה.
   1. הפשיר את תערובת תגובת qPCR (ערכת זיהוי חומצות גרעין H. pylori ) על קרח, וערבב אותה על ידי תנועה וסיבוב כדי למנוע אובדן של מגיב.
   2. עבור כל דגימה על צלחת של 32 בארות, ערבבו 20 μL של תערובת תגובת PCR (premix של תגובת גנוטיפ [המכיל את האנזים Taq, deoxyribonucleoside triphosphate, מאגר תגובה ומגנזיום כלורי], עם פריימרים קדימה ואחורה של ureA , ובדיקת אורייא), ו-5 μL של הדנ"א שחולץ.
   3. הפעל את צלחת qPCR 32 באר במחשב qPCR. תכנת את המחזור התרמי: תערובת התגובה תגיב תחילה ברצף ב- 42 ° C ו- 95 ° C (שניהם למחזור אחד) למשך 2 דקות כל אחד; לאחר מכן, 40 מחזורים ב 95 ° C, denaturation במשך 10 שניות, ו חישול והרחבה ב 58 ° C במשך 45 שניות.
   4. הגדר את קליטת האות הפלואורסצנטי ל- FAM (H. pylori) ואת רכישת הנתונים לתקופת הארכת ההגברה. לאחר השלמת התגובה, שמור את הנתונים לניתוח תוצאות עתידיות.
   5. נתח את הנתונים באמצעות תוכנה ספציפית עבור qPCR, מכיוון שהמכשיר יבחר באופן אוטומטי ערכי סף בסיסיים.
   6. אם תוצאת הבדיקה עבור H. pylori חיובית, המכונה תתחיל באופן אוטומטי בדיקות עמידות לתרופות על הדגימה. החלף את ערכת המגיב בריאגנטים לאיתור מוטציות בגן rRNA 23S ובגן gyrA בערכת H. Pylori (qPCR).
      הערה: ערכת המגיבים (ריאגנטים לגילוי מוטציות בגן 23S rRNA ובגן gyrA בהליקובקטר פילורי [qPCR]) כוללת את תערובת תגובת ה-PCR (תערובת קדם-תגובה גנוטיפית [המכילה את האנזים Taq, טריפוספט דאוקסיריבונוקלאוזיד, מאגר תגובה, מגנזיום כלורי], פריימרים ובדיקות בדיקה). כל מוצרי בקרת האיכות השלילית הם מים סטריליים ומטוהרים. מוצר בקרת האיכות החיובית בערכת זיהוי חומצות הגרעין H. pylori הוא חרוזים סטנדרטיים של H. pylori (ATCC 43504). תוצרי בקרת האיכות החיוביים החזקים של H. pylori וחיוביים חלשים בערכה (ריאגנטים לגילוי מוטציות בגן rRNA 23S ומוטציות בגן gyrA ב- H. pylori) הם ה- DNA של זן H. pylori המומת המכיל את גן המטרה ואת הגן המוטנטי. באופן דומה, בהתבסס על המצב בפועל, כל תקני האבחון, כולל נוכחות של זיהום H. pylori או עמידות לתרופות, מוגדרים ל- CT ≤ 35 ויש להם עקומה טיפוסית בצורת S. ריכוז בקרת האיכות החלשה הוא 1.0 x 10³ עותקים / מ"ל, ואילו ריכוז בקרת האיכות החזקה הוא 1.0 x 10⁸ עותקים / מ"ל.

תוצאות

זיהוי זיהום H. pylori ועמידות לאנטיביוטיקה בנוזל הקיבה על ידי qPCR
ביצענו qPCR לזיהוי זיהום בהליקובקטר פילורי על-ידי הגברת הגן אורייא, וקבענו את פרופיל העמידות שלו לאנטיביוטיקה על-ידי מיקוד מוטציות נקודתיות בגן rRNA 23S ובגן gyrA (טבלה 1). ערכי בקרת האיכות של CT בכל...

Discussion

זיהוי H. pylori יכול להתבצע בשיטות פולשניות ולא פולשניות¹³. טכניקות פולשניות נפוצות כגון היסטופתולוגיה, בדיקת אוראז מהירה, תגובת שרשרת פולימראז (PCR) ותרבית חיידקים דורשות אנדוסקופיה וביופסיה. בדיקות סרולוגיות, בדיקות נשימה של אוריאה ובדיקות אימונוסורבנטיות מקושרות אנזימים (...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent