Quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)-basierte Schnelldiagnose von Helicobacter pylori-Infektion und Antibiotikaresistenz

Zusammenfassung

Das Protokoll stellt eine nicht-invasive Methode zur schnellen Diagnose von Helicobacter pylori-Mageninfektionen durch den String-Test vor und bestimmt die Antibiotikaresistenz gegen Clarithromycin und Levofloxacin mittels quantitativer Polymerase-Kettenreaktion (qPCR).

Zusammenfassung

Helicobacter pylori ist ein bedeutender menschlicher Krankheitserreger, der etwa die Hälfte der Weltbevölkerung infiziert und aufgrund seiner zunehmenden Antibiotikaresistenz zu einer ernsthaften Gesundheitsgefahr wird. Es ist der Erreger von chronisch aktiver Gastritis, Magengeschwüren und Magenkrebs und wurde von der Internationalen Agentur für Krebsforschung als Karzinogen der Gruppe I eingestuft. Daher sind die schnelle und genaue Diagnose von H. pylori und die Bestimmung seiner Antibiotikaresistenz wichtig für die effiziente Ausrottung dieses bakteriellen Erregers. Zu den Diagnosemethoden von H. pylori gehören derzeit vor allem der Harnstoff-Atemtest (UBT), der Antigentest, der Serum-Antikörpertest, die Gastroskopie, der Urease-Schnelltest (RUT) und die Bakterienkultur. Unter ihnen sind die ersten drei Nachweismethoden nicht-invasiv, was bedeutet, dass sie einfach durchzuführen sind. Bakterien können mit diesen Techniken jedoch nicht zurückgewonnen werden. Daher können keine Arzneimittelresistenztests durchgeführt werden. Bei den letzten drei handelt es sich um invasive Untersuchungen, die jedoch kostspielig sind, hohe Fähigkeiten erfordern und das Potenzial haben, den Patienten Schaden zuzufügen. Daher ist eine nicht-invasive, schnelle und simultane Methode zum Nachweis von H. pylori und zur Prüfung von Arzneimittelresistenzen sehr wichtig, um H. pylori in der klinischen Praxis effizient zu eraminieren . Ziel dieses Protokolls ist es, ein spezifisches Verfahren vorzustellen, das den String-Test in Kombination mit der quantitativen Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) zum schnellen Nachweis von H. pylori-Infektionen und Antibiotikaresistenzen umfasst. Im Gegensatz zu Bakterienkulturen ermöglicht diese Methode eine einfache, schnelle und nicht-invasive Diagnose des Infektionsstatus und der Arzneimittelresistenz von H. pylori. Konkret haben wir qPCR verwendet, um Rea für eine H. pylori-Infektion und Mutationen in den Genen 23S rRNA und gyrA nachzuweisen, die für Resistenzen gegen Clarithromycin bzw. Levofloxacin kodieren. Im Vergleich zu routinemäßig verwendeten Kultivierungstechniken bietet dieses Protokoll eine nicht-invasive, kostengünstige und zeitsparende Technik zum Nachweis einer H. pylori-Infektion und zur Bestimmung der Antibiotikaresistenz mittels qPCR.

Einleitung

H. pylori ist ein spiralförmiges, hochbewegliches, gramnegatives Bakterium, das hauptsächlich in der Pylorusregion des Magens^{lebt 1}. Es handelt sich um einen weit verbreiteten Krankheitserreger, der fast 50 % der Weltbevölkerung infiziert². Die meisten Menschen mit einer H. pylori-Infektion haben keine klinischen Manifestationen, und die meisten entwickeln nach mehreren Jahren der Infektion verschiedene Krankheiten, darunter chronische Gastritis, Magengeschwüre, Magengeschwüre und Magenkrebs³. In mehreren Studien, die auf verschiedenen Populationen basierten, wurde die Wirksamkei....

Protokoll

Die vorliegende Studie wurde in Übereinstimmung mit ethischen Erwägungen durchgeführt, die von der Ethikkommission des Guangdong Provincial People's Hospital, Southern Medical University, Guangzhou, China, aufgestellt wurden (Zulassungsnummer: KY-Q-2022-384-02). Patienten im Alter von 18 bis 60 Jahren wurden in diese Studie eingeschlossen. Patienten, die innerhalb von 2 Wochen vor der Testung Antibiotika, antibakterielle chinesische Medikamente, Medikamente wie Protonenpumpenhemmer (PPI) oder H2-Rezeptor-Antagonisten usw. einnahmen, wurden nicht in diese Studie eingeschlossen. Diejenigen Patienten, die in den letzten 3 Monaten eine Behandlung gegen H. p....

Diskussion

Der Nachweis von H. pylori kann sowohl mit invasiven als auch mit nicht-invasiven Methoden durchgeführt werden¹³. Häufig verwendete invasive Techniken wie Histopathologie, Urease-Schnelltest, Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und bakterielle Kultivierung erfordern Endoskopie und Biopsie. Zu den nicht-invasiven Verfahren gehören serologische Tests, Harnstoff-Atemtests und Enzyme-linked Immunosorbent Assays (ELISA)¹⁴. Während nichtinvasive Methoden einfach durchzuf.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent