基于定量聚合酶链反应（qPCR）的幽 门螺杆菌 感染和抗生素耐药快速诊断

摘要

该协议提出了一种通过串测试快速诊断 幽门螺杆菌 胃感染的非侵入性方法，并使用定量聚合酶链反应（qPCR）确定其对克拉霉素和左氧氟沙星的抗生素耐药性。

摘要

幽门螺杆菌是一种主要的人类病原体，感染了全球约一半的人口，并且由于其抗生素耐药性的增加而正在成为严重的健康威胁。它是慢性活动性胃炎、消化性溃疡病和胃癌的病原体，已被国际癌症研究机构列为 I 组致癌物。因此，快速准确地诊断幽门螺杆菌并测定其抗生素耐药性对于有效根除该细菌病原体具有重要意义。目前，幽门螺杆菌的诊断方法主要包括尿素呼气试验（UBT）、抗原试验、血清抗体试验、胃镜检查、快速尿素酶试验（RUT）和细菌培养。其中，前三种检测方法是非侵入性的，这意味着它们很容易进行测试。然而，细菌不能通过这些技术回收;因此，不能进行耐药性测试。最后三种是侵入性检查，但它们成本高昂，需要高技能，并且有可能对患者造成损害。因此，一种无创、快速、同步的幽门螺杆菌检测和耐药性检测方法对于临床上有效根除幽门螺杆菌非常重要。该协议旨在提出一种涉及串测试与定量聚合酶链反应（qPCR）相结合的特定程序，以快速检测幽门螺杆菌感染和抗生素耐药性。与细菌培养不同，该方法可以轻松、快速、无创地诊断幽门螺杆菌感染状态和耐药性。具体来说，我们使用qPCR检测幽门螺杆菌感染的rea以及分别编码对克拉霉素和左氧氟沙星的耐药性的23S rRNA和gyrA基因突变。与常规使用的培养技术相比，该方案提供了一种无创、低成本和省时的技术来检测幽门螺杆菌感染并使用 qPCR 确定其抗生素耐药性。

引言

幽门螺杆菌 是一种螺旋形、高度运动的革兰氏阴性细菌，主要生活在胃的幽门区域¹。它是一种常见的病原体，感染全球近 50% 的人口²。大多数 幽门螺杆菌 感染者没有临床表现，大多数在感染几年后会发展出不同的疾病，包括慢性胃炎、消化性溃疡、胃溃疡和胃癌³。在几项基于不同人群的研究中，已经证明了消除 幽门螺杆菌 预防胃癌和癌前病变的有效性^4，5。因此，世界卫生组织（WHO）国际癌症研究机构建议将根除 幽门螺杆菌 作为预防措施⁶。

使用无创方法识别 幽门螺杆菌 感染是大多数无症状消化不良患者治疗的关键组成部分。尿素呼气试验 （UBT）、 幽门螺杆菌 粪便抗原试验 （SAT） 和血清学检测是流行的无创技术。其中，UBT是侵入性最小且最准确的程序。UBT使用幽 门螺杆菌中大量存在的脲酶将同位素标记的尿素水解成氨和二氧化碳（13C或14C）。相比之下，免疫层析（ICA）⁷ 方便、简单且无创取样。但是，测试的准确性受多....

研究方案

本研究是根据中国广州南方医科大学广东省人民医院伦理委员会建立的伦理考虑进行的（批准文号：KY-Q-2022-384-02）。本研究纳入了18-60岁年龄段的患者。检测前2周内服用抗生素、抗菌中药、质子泵抑制剂（PPI）或_H2 受体拮抗剂等药物的患者未纳入本研究。那些在过去3个月内接受过 幽门螺杆菌 治疗的患者也被排除在这项研究之外。那些有严重心脏，肝脏，肾脏问题，严重神经病变或精神疾病的人也不允许参加这项研究。这项研究没有包括孕妇和哺乳期母亲。本研究中使用的用品（试剂、化学品、设备和软件）的详细信息在 材料表中给出。

1.胃液采样的串试验

1. 要求患者在采集样本前禁食过夜。
2. 第二天，打开弦测试套件，取出胶囊，并按住弦末端的环。
3. 将绳子粘在患者的脸颊上，并要求他们将胶囊放在靠近喉咙后部的舌头上，然后喝一口水吞咽。
4. 让胶囊溶解在患者的胃中，从而暴露胶囊内的绳子以吸收胃粘液。
5. 请训练有素的助手在患者吞咽胶囊 1 小时后小心地拉出绳子。
6. 切下浸泡在胃液中的绳子（40厘米）的下端，将其放入TSE（Tris/盐水/ EDTA）样品保存溶液中，然后在室温（RT）下将其送到临床实验室，以便随后检测 幽门螺杆菌 并使用qPCR测定抗生素耐药性谱。
....

讨论

幽门螺杆菌 检测可以使用侵入性和非侵入性方法进行¹³。常用的侵入性技术，如组织病理学、快速尿素酶检测、聚合酶链反应 （PCR） 和细菌培养，需要内镜检查和活检。血清学检测、尿素呼气试验和酶联免疫吸附试验 （ELISA） 被推荐用于非侵入性操作¹⁴。虽然非侵入性方法易于操作、经济且对患者更舒适，但幽 门螺杆 菌的分离和培养以进行额外.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent