Kantitatif Polimeraz Zincir Reaksiyonu (qPCR) Bazlı Helicobacter pylori Enfeksiyonu ve Antibiyotik Direncinin Hızlı Tanısı

Özet

Protokol, Helicobacter pylori mide enfeksiyonlarının ip testi ile hızlı teşhisi için noninvaziv bir yöntem sunar ve klaritromisin ve levofloksasine karşı antibiyotik direncini kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) kullanarak belirler.

Özet

Helicobacter pylori, küresel nüfusun yaklaşık yarısını enfekte eden ve artan antibiyotik direnci nedeniyle ciddi bir sağlık tehdidi haline gelen önemli bir insan patojenidir. Kronik aktif gastrit, peptik ülser hastalığı ve mide kanserinin etken maddesidir ve Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı tarafından Grup I Kanserojen olarak sınıflandırılmıştır. Bu nedenle, H. pylori'nin hızlı ve doğru tanısı ve antibiyotik direncinin belirlenmesi, bu bakteriyel patojenin etkin bir şekilde yok edilmesi için önemlidir. Günümüzde, H. pylori tanı yöntemleri temel olarak üre nefes testi (UBT), antijen testi, serum antikor testi, gastroskopi, hızlı üreaz testi (RUT) ve bakteri kültürünü içerir. Bunlar arasında, ilk üç tespit yöntemi invaziv değildir, yani yapılması kolay testlerdir. Bununla birlikte, bakteriler bu tekniklerle elde edilemez; Bu nedenle ilaç direnci testi yapılamaz. Son üçü invaziv muayenelerdir, ancak maliyetlidirler, yüksek beceri gerektirirler ve hastalara zarar verme potansiyeline sahiptirler. Bu nedenle, H. pylori tespiti ve ilaç direnci testi için noninvaziv, hızlı ve eşzamanlı bir yöntem, klinik pratikte H. pylori'nin etkin bir şekilde ortadan kaldırılması için çok önemlidir. Bu protokol, H. pylori enfeksiyonunun ve antibiyotik direncinin hızlı tespiti için kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) ile kombinasyon halinde sicim testini içeren spesifik bir prosedür sunmayı amaçlamaktadır. Bakteriyel kültürlerin aksine, bu yöntem H. pylori enfeksiyon durumunun ve ilaç direncinin kolay, hızlı, invaziv olmayan teşhisine izin verir. Spesifik olarak, sırasıyla klaritromisin ve levofloksasine karşı direnci kodlayan 23S rRNA ve gyrA genlerindeki H. pylori enfeksiyonu ve mutasyonları için rea'yı tespit etmek için qPCR'yi kullandık. Rutin olarak kullanılan kültürleme teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu protokol H. pylori enfeksiyonunu tespit etmek ve qPCR kullanarak antibiyotik direncini belirlemek için invaziv olmayan, düşük maliyetli ve zaman kazandıran bir teknik sağlar.

Giriş

H. pylori, esas olarak midenin pilor bölgesinde yaşayan spiral şekilli, oldukça hareketli, gram-negatif bir bakteridir¹. Küresel nüfusun yaklaşık% 50'sini enfekte eden yaygın bir patojendir². H. pylori enfeksiyonu olan çoğu insanın klinik belirtileri yoktur ve çoğu kronik gastrit, peptik ülser, mide ülseri ve mide kanseri dahil olmak üzere birkaç yıllık enfeksiyondan sonra farklı hastalıklar geliştirir³. Farklı popülasyonlara dayanan çeşitli çalışmalarda, mide kanseri ve prekanseröz lezyonları önlemede H. pylori'yi elimine etmenin etkinliği gösterilmiştir ^4,5. Bu nedenle, Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Uluslararası Kanser Araştırmaları Ajansı, önleyici bir önlem olarak H. pylori eradikasyonunu tavsiye etmiştir⁶.

H. pylori enfeksiyonunu tanımlamak için noninvaziv yöntemlerin kullanılması, asemptomatik dispepsisi olan çoğu birey için tedavinin önemli bir bileşenidir. Üre nefes testi (UBT), H. pylori fekal antijen testi (SAT) ve serolojik testler popüler noninvaziv tekniklerdir. Bunlar arasında, UBT mevcut en az müdahaleci ve en doğru prosedürdür. UBT, izotopik olarak etiketlenmiş üreyi amonyak ve karbondioksite (13C veya 14C) hidrolize etmek için H. pylori'de bol miktarda bulunan üreaz kullanır. Buna karşılık, immünokromatografik tahlil (ICA)⁷ örnekleme için uygun, basit ve noninvazivdir. Bununla birlikte, testin doğruluğu, dışkı numunesinin kalitesi, sıcaklık ve numune toplama ile test arasındaki aralık gibi çeşitli faktörlerden etkilenir. İmmün cevaba dayanan bir başka test, hastanın serumundaki antikorları tespit eden serum H. pylori antikor testidir. Bununla birlikte, bu test tedavi sonrası analiz için uygun değildir, çünkü antikorlar bakteriler temizlendikten sonra uzun süre kalır⁸. Bir diğer önemli dezavantaj, bu yöntemlerin sadece H. pylori enfeksiyonunu teşhis etmesi ve duyarlılığa dayalı tedaviyi yönlendirmek için ilaç direnci testine izin vermemesidir.

İnvaziv test yöntemleri için, mide biyopsi dokusunun endoskopi ile alınması ve daha sonra histolojiye, üreaz hızlı testine ve bakteri kültürüne tabi tutulması gerekir. Bu test yöntemleri de çeşitli faktörler nedeniyle çok sınırlıdır. Günümüzde bu teknikler yaşlı hastalar, prekanseröz veya malign hastalık için yüksek risk altındaki hastalar ve gastroözofageal reflü hastalığı veya H. pylori enfeksiyonu⁹ için birinci basamak tedavide başarısız olan hastalar ile sınırlıdır. İkincisi, H. pylori'nin benzersiz büyüme özellikleri nedeniyle, bakteri kültürünün başarı oranı sadece% 50'ye ^ulaşır10. Bu nedenle, moleküler tespit yöntemleri, invaziv tespit yöntemlerinin yüksek taleplerinin üstesinden gelmek ve duyarlılığa dayalı tedaviye rehberlik etmek için yeni umutlar sunmaktadır. Moleküler tespit yöntemleri arasında, kantitatif PCR son yıllarda muazzam bir şekilde gelişmiştir. qPCR, geleneksel PCR'den farklı olarak, jel elektroforezi gerektirmez ve tavlama aşamasında primerler ve problar ekleyerek numunelerdeki DNA / RNA'yı doğru bir şekilde ölçer. H. pylori enfeksiyonunun ve ilaç direncinin tespiti için qPCR kitleri artık ticari olarak temin edilebilir. Bununla birlikte, her yöntemin kendi sınırlamaları vardır; Bu nedenle, bir hastanın klinik tanı ve tedavisi, semptomları, bulguları, öyküsü, diğer laboratuvar testleri ve tedaviye yanıtı ile birlikte düşünülmelidir.

Şu anda, H.pylori enfeksiyonlarını tedavi etmenin birincil yöntemi antibiyotik almaktır, ancak son zamanlarda, antibiyotik direncindeki artış nedeniyle bu enfeksiyonları tedavi etmek giderek zorlaşmaktadır. Daha sonra, H. pylori tedavisinin etkinliğinde küresel olarak önemli bir düşüş gözlenmiştir ve bu da H. pylori eradikasyonunu önemli bir halk sağlığı sorunu haline getirmiştir¹¹.

Klaritromisin ve levofloksasin, H.pylori'nin neden olduğu enfeksiyonları tedavi etmek için kullanılan iki geniş spektrumlu antibiyotiktir, ancak birkaç çalışma H.pylori izolatlarında bu iki ilaca karşı yaygın direnç bildirmiştir. A2143G, A2142G ve A2142C, makrolidin bağlanmasını önleyerek klaritromisin direnci ile sonuçlanan 2.9 kb 23S rRNA geninde bulunan çok sayıda nokta mutasyonundan üçüdür. Aynı zamanda, levofloksasin direnç geninin mutasyon lokusları esas olarak gyrA geni^12'nin altı mutasyon bölgesinde (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) bulunur. Genetik mutasyonlara dayanan bu direnç mekanizmalarının keşfi, kültürel temelli çalışmalarla H. pylori'nin tespitinde moleküler testlere kademeli bir kaymaya yol açmıştır.

Genel olarak, H. pylori enfeksiyonlarının ve ilaç direncinin saptanması için noninvaziv, etkili ve eşzamanlı bir tanı yöntemine acil bir klinik ihtiyaç vardır. Örneklemenin zorluklarının üstesinden gelmek ve farklı primer problar kullanarak H. pylori enfeksiyonunun ve ilaç direncinin eşzamanlı tespiti hedefine ulaşmak için kombine bir sicim testi ve qPCR yöntemini benimsedik.

Protokol

Bu çalışma, Guangdong İl Halk Hastanesi, Güney Tıp Üniversitesi, Guangzhou, Çin etik komitesi tarafından oluşturulan etik hususlara uygun olarak yürütülmüştür (Onay Numarası: KY-Q-2022-384-02). 18-60 yaş aralığındaki hastalar bu çalışmaya dahil edildi. Testten önceki 2 hafta içinde antibiyotikler, antibakteriyel Çin ilaçları, proton pompa inhibitörleri (PPI) veya_H2 reseptör antagonistleri gibi ilaçlar vb. Alan hastalar bu çalışmaya dahil edilmemiştir. Son 3 ay içinde H.pylori'ye karşı tedavi gören hastalar da bu çalışmanın dışında bırakıldı. Ciddi kalp, karaciğer, böbrek problemleri, ciddi nöropati veya akıl hastalığı olanların da bu çalışmaya katılmasına izin verilmedi. Bu çalışmaya dahil edilen gebe kadın ve emziren anne yoktu. Bu çalışmada kullanılan malzemelerin (reaktifler, kimyasallar, ekipman ve yazılımlar) detayları Malzeme Tablosunda verilmiştir.

1. Gastrik sıvı örneklemesi için sicim testi

1. Hastadan numune toplamadan önce gece boyunca oruç tutmasını isteyin.
2. Ertesi gün, dize test kitini açın, kapsülü alın ve döngüyü dizenin sonunda tutun.
3. İpi hastanın yanağına bantlayın ve kapsülü boğazın arkasına yakın bir yerde dillerine yerleştirmelerini ve bir yudum su ile yutmalarını isteyin.
4. Kapsülün hastanın midesinde çözünmesine izin verin, böylece mide mukusunu emmek için kapsül içindeki ipi açığa çıkarın.
5. Eğitimli bir asistandan, hasta kapsülü yuttuktan 1 saat sonra ipi dikkatlice çekmesini isteyin.
6. Mide sıvısına batırılmış ipin alt ucunu (40 cm) kesin, TSE (Tris/salin/EDTA) numune koruma solüsyonuna yerleştirin ve daha sonra H. pylori'nin tespiti ve qPCR kullanılarak antibiyotik direnç profillerinin belirlenmesi için oda sıcaklığında (RT) klinik laboratuvara gönderin.

2. DNA ekstraksiyonu

1. Numune taşıyan toplama tüplerini, uygun şekilde etiketlenmiş bir test tüpü rafına yerleştirin ve 10 saniye boyunca vorteks yapın.
2. Manyetik boncukları yeniden askıya almak için 32 delikli plakayı (nükleik asit ekstraksiyonu veya saflaştırma kiti) birkaç kez baş aşağı çevirin. 10 s boyunca kısa bir vorteksten sonra, alüminyum folyo sızdırmazlığını plakadan dikkatlice çıkarın.
3. Her bir numuneden 200 μL mide sıvısı ve H. pylori DNA'sını pozitif bir kontrol olarak ayrı kuyucuklara aktarın.
4. Otomatik DNA ekstraksiyonu için 32 delikli plakayı nükleik asit ekstraksiyon makinesinin ilgili numune yuvasına yerleştirin.
5. DNA ekstraksiyonu ve doğrulanmasından sonra, pozitif örnekler üzerinde qPCR yoluyla klaritromisin ve levofloksasin için antibiyotik direnç testini başlatın.
6. Aşırı mide sıvısını ve ekstrakte edilmiş DNA örneklerini uzun süreli depolama ve gelecekteki kullanım için -20 ° C'ye yerleştirin.
7. Herhangi bir kontaminasyonu önlemek için tüm bu adımları bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.

3. H. pylori ve antibiyotiklere direnç (klaritromisin ve levofloksasin) tespiti için qPCR

1. H. pylori ve genomundaki şüpheli antibiyotik direnci mutasyonlarının tespiti için qPCR uygulayın.
   1. qPCR reaksiyon karışımını (H. pylori nükleik asit algılama kiti) buz üzerinde çözün ve herhangi bir reaktif kaybını önlemek için hafifçe vurarak ve döndürerek karıştırın.
   2. 32 delikli bir plaka üzerindeki her numune için, 20 μL PCR reaksiyon karışımını (genotipleme reaksiyonu ön karışımı [Taq enzimi, deoksiribonükleozid trifosfat, reaksiyon tamponu ve magnezyum klorür içeren], ürA ileri ve geri primerler ve bir üre probu ile) ve ekstrakte edilen DNA'nın 5 μL'sini karıştırın.
   3. 32 delikli qPCR plakasını qPCR makinesinde çalıştırın. Termal döngüleyiciyi programlayın: reaksiyon karışımı ilk önce her biri 2 dakika boyunca 42 ° C ve 95 ° C'de (her ikisi de bir döngü için) sırayla reaksiyona sokulacaktır; daha sonra, 95 ° C'de 40 döngü, 10 s için denatürasyon ve 45 s için 58 ° C'de tavlama ve uzatma.
   4. Floresan sinyal alımını FAM (H. pylori) olarak ve veri alımını amplifikasyon uzatma periyoduna ayarlayın. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, verileri gelecekteki sonuç analizi için kaydedin.
   5. Cihaz otomatik olarak taban çizgisi eşiklerini seçeceğinden, qPCR için belirli bir yazılım kullanarak verileri analiz edin.
   6. H. pylori için test sonucu pozitifse, makine numune üzerinde ilaç direnci testini otomatik olarak başlatacaktır. Reaktif kitini, H. Pylori (qPCR) kitindeki 23S rRNA geni ve gyrA gen mutasyonları için algılama reaktifleri ile değiştirin.
      NOT: Reaktif kiti (Helicobacter pylori [qPCR]'deki 23S rRNA geni ve gyrA gen mutasyonları için tespit reaktifleri) PCR reaksiyon karışımını (genotipleme reaksiyonu ön karışımı [Taq enzimi, deoksiribonükleozid trifosfat, reaksiyon tamponu, magnezyum klorür], primerler ve problar içeren) içerir. Tüm negatif kalite kontrol ürünleri steril, arıtılmış sudur. H. pylori nükleik asit algılama kitindeki pozitif kalite kontrol ürünü, inaktive edilmiş H. pylori standart boncuklarıdır (ATCC 43504). Kitteki güçlü H. pylori-pozitif ve zayıf pozitif kalite kontrol ürünleri (23S rRNA geni için tespit reaktifleri ve H. pylori'deki gyrA gen mutasyonları), hedef geni ve mutant geni içeren inaktive edilmiş H. pylori suşunun DNA'sıdır. Benzer şekilde, gerçek duruma dayanarak, H. pylori enfeksiyonu veya ilaç direncinin varlığı da dahil olmak üzere tüm tanı standartları CT ≤ 35'e ayarlanır ve tipik bir S şeklinde eğriye sahiptir. Zayıf kalite kontrolünün konsantrasyonu 1.0 x 10³ kopya / mL, güçlü kalite kontrolünün konsantrasyonu ise 1.0 x 10⁸ kopya / mL'dir.

Sonuçlar

Mide sıvısında H. pylori enfeksiyonu ve antibiyotik direncinin qPCR ile saptanması
UreA genini yükselterek H. pylori enfeksiyonunun saptanması için qPCR uyguladık ve 23S rRNA geni ve gyrA genindeki nokta mutasyonlarını hedefleyerek antibiyotik direnç profilini belirledik (Tablo 1). qPCR deneylerinin her üç grubundaki kalite kontrol BT değerleri önerilen aralıktaydı, bu da numunelerin hepsinin deney sırasında normal bir durumda old...

Tartışmalar

H. pylori tespiti hem invaziv hem de noninvaziv yöntemler kullanılarak yapılabilir¹³. Histopatoloji, hızlı üreaz testi, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve bakteriyel kültürleme gibi yaygın olarak kullanılan invaziv teknikler endoskopi ve biyopsi gerektirir. Serolojik testler, üre nefes testleri ve enzime bağlı immünosorbent testleri (ELISA) noninvaziv prosedürler arasında önerilmektedir¹⁴. Noninvaziv yöntemlerin uygulanması kolay, ekonomik ve h...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent