定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)に基づく ヘリコバクターピロリ 感染と抗生物質耐性の迅速診断

要約

このプロトコルは、ストリングテストを通じて ヘリコバクターピロリ 胃感染症を迅速に診断するための非侵襲的な方法を提示し、定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を使用してクラリスロマイシンとレボフロキサシンに対する抗生物質耐性を決定します。

要約

ヘリコバクターピロリは、世界人口の約半分に感染する主要なヒト病原体であり、抗生物質耐性の増加により深刻な健康上の脅威になりつつあります。慢性活動性胃炎、消化性潰瘍疾患、胃がんの原因物質であり、国際がん研究機関によってグループIの発がん性物質に分類されています。したがって、ピロリ菌の迅速かつ正確な診断とその抗生物質耐性の決定は、この細菌性病原体の効率的な根絶にとって重要です。現在、ピロリ菌の診断方法には、主に尿素呼気検査(UBT)、抗原検査、血清抗体検査、胃鏡検査、迅速ウレアーゼ検査(RUT)、および細菌培養が含まれます。その中で、最初の3つの検出方法は非侵襲的であり、実施しやすい検査です。ただし、これらの手法では細菌を回収することはできません。したがって、薬剤耐性試験は実施できない。最後の3つは侵襲的な検査ですが、費用がかかり、高度なスキルが必要であり、患者に損害を与える可能性があります。したがって、ピロリ菌の検出と薬剤耐性試験のための非侵襲的、迅速、同時の方法は、臨床現場で効率的にピロリ菌を根絶するために非常に重要です。このプロトコルは、ピロリ菌感染と抗生物質耐性を迅速に検出するための定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)と組み合わせたストリングテストを含む特定の手順を提示することを目的としています。細菌培養とは異なり、この方法は、ピロリ菌の感染状態と薬剤耐性の容易、迅速、非侵襲的な診断を可能にします。具体的には、qPCRを用いて、ピロリ菌感染のレアと、クラリスロマイシンとレボフロキサシンに対する耐性をそれぞれコードする23S rRNAおよびgyrA遺伝子の変異を検出しました。日常的に使用されている培養技術と比較して、このプロトコルは、ピロリ菌感染を検出し、qPCRを使用して抗生物質耐性を決定するための非侵襲的、低コスト、および時間を節約する技術を提供します。

概要

ピロリ菌は、主に胃の幽門領域に生息するらせん状の運動性の高いグラム陰性菌です¹。これは、世界人口の50%近くが感染する一般的な病原体です²。ピロリ菌感染症のほとんどの人は臨床症状がなく、慢性胃炎、消化性潰瘍、胃潰瘍、胃がんなど、感染から数年後にさまざまな病気を発症します³。異なる集団に基づくいくつかの研究では、胃がんや前がん病変を予防するためのピロリ菌を排除することの有効性が実証されています^4,5。そのため、世界保健機関(WHO)の国際がん研究機関は、^{予防措置として}ピロリ菌の撲滅を勧告しています6。

ピロリ菌感染を特定するための非侵襲的方法の使用は、無症候性消化不良のほとんどの個人にとって治療の重要な要素です。尿素呼気検査(UBT)、ピロリ菌糞便抗原検査(SAT)、および血清学的検査は、一般的な非侵襲的技術です。これらの中で、UBTは利用可能な最も侵入が少なく、最も正確な手順です。UBTは、ピロリ菌に豊富に存在するウレアーゼを使用して、同位体標識された尿素をアンモニアと二酸化炭素(13Cまたは14C)に加水分解します。対照的に、イムノクロマトグラフィーアッセイ(ICA)⁷は、サンプリングに便利でシンプルで非侵襲的です。ただし、テストの精度は、便サンプルの品質、温度、サンプル収集とテストの間隔など、いくつかの要因の影響を受けます。免疫応答に基づく別の検査は、患者の血清中の抗体を検出する血清H.ピロリ抗体検査です。ただし、この検査は、細菌が除去された後も抗体が長く残るため、処理後の分析には適していません⁸。もう一つの大きな欠点は、これらの方法はピロリ菌感染を診断するだけであり、感受性に基づく治療を導く薬剤耐性試験ができないことです。

侵襲的な検査法では、胃生検組織を内視鏡検査で採取し、組織学、ウレアーゼ迅速検査、細菌培養を行う必要があります。これらのテスト方法も、いくつかの要因により非常に制限されています。現在、これらの技術は、高齢患者、前癌性疾患または悪性疾患のリスクが高い患者、および胃食道逆流症または ピロリ菌 感染の一次治療に失敗した患者に限定されています⁹。第二に、 ピロリ菌の独特の増殖特性により、細菌培養の成功率は50%にしか達しません¹⁰。したがって、分子検出法は、侵襲的検出法の高い要求を克服し、感度ベースの治療を導くための新しい希望を提供します。分子検出法の中でも、定量PCRは近年大きく進化しています。qPCRは、従来のPCRとは異なり、ゲル電気泳動を必要とせず、アニーリング段階でプライマーとプローブを添加することにより、サンプル中のDNA/RNAを正確に定量します。 ピロリ菌 感染および薬剤耐性を検出するためのqPCRキットが市販されている。それにもかかわらず、各方法には制限があります。したがって、患者の臨床診断と治療は、症状、徴候、病歴、他の臨床検査、および治療への反応と組み合わせて考慮する必要があります。

現在、 ピロリ菌 感染症の治療方法は抗生物質の服用が主流ですが、最近では抗生物質耐性の上昇により治療が難しくなってきています。その後、ピロリ 菌 の治療効果の大幅な低下が世界的に観察され、 ピロリ菌 の根絶が主要な公衆衛生上の問題となっています¹¹。

クラリスロマイシンとレボフロキサシンは、ピロリ菌によって引き起こされる感染症の治療に使用される2つの広域抗生物質ですが、いくつかの研究では、ピロリ菌分離株におけるこれら2つの薬剤に対する広範な耐性が報告されています。A2143G、A2142G、およびA2142Cは、2.9 kb 23S rRNA遺伝子に見られる多数の点突然変異のうちの3つであり、マクロライドの結合を妨げることによってクラリスロマイシン耐性をもたらします。同時に、レボフロキサシン耐性遺伝子の突然変異遺伝子座は、主にgyrA遺伝子¹²の6つの突然変異部位(A260T、C261A、T261G、G271A、G271T、A272G)に位置する。遺伝子変異に基づくこれらの耐性メカニズムの発見は、文化ベースの研究を通じて、ピロリ菌の検出が分子検査に徐々に移行することにつながりました。

全体として、 ピロリ菌 感染および薬剤耐性を検出するための非侵襲的、効果的、かつ同時診断法の緊急の臨床的必要性がある。ストリングテストとqPCRを組み合わせた方法を採用して、サンプリングの難しさを克服し、異なるプライマープローブを使用して ピロリ菌 感染と薬剤耐性を同時に検出するという目標を達成しました。

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プロトコル

本研究は、中国広州市南方医科大学広東省人民病院の倫理委員会が定めた倫理的配慮(承認番号:KY-Q-2022-384-02)に準拠して実施した。18〜60歳の年齢範囲の患者がこの研究に含まれました。抗生物質、抗菌漢方薬、プロトンポンプ阻害剤(PPI)などの薬を服用している患者、または_H2 受容体拮抗薬など、 テスト前2週間以内に、この研究には含まれていませんでした。過去3ヶ月間に H.ピロリ に対する治療を受けた患者もこの研究から除外されました。深刻な心臓、肝臓、腎臓の問題、重度の神経障害、または精神疾患のある人もこの研究に参加することを許可されていません。この研究には妊婦および授乳中の母親は含まれていなかった。本研究で使用した消耗品(試薬、薬品、機器、ソフトウェア)の詳細は、 材料表に記載されています。

1.胃液サンプリングのためのストリングテスト

1. サンプル収集の前に一晩絶食するように患者に依頼します。
2. 翌日、ストリングテストキットを開き、カプセルを取り、ストリングの端でループを保持します。
3. ひもを患者の頬にテープで留め、カプセルを喉の奥近くの舌の上に置き、一口の水で飲み込むように依頼します。
4. カプセルを患者の胃に溶かし、カプセル内のひもを露出させて胃粘液を吸収します。.
5. 訓練を受けた助手に、患者がカプセルを飲み込んでから1時間後に紐を注意深く引き抜くように依頼します。.
6. 胃液に浸したひも(40 cm)の下端を切り取り、TSE(トリス/生理食塩水/EDTA)サンプル保存液に入れ、室温(RT)で臨床検査室に送り、その後ピロ リ菌 を検出し、qPCRを使用して抗生物質耐性プロファイルを決定します。

2. DNA抽出

1. 検体を運ぶ収集チューブを、適切にラベル付けされた試験管ラックに置き、10秒間ボルテックスします。
2. 32ウェルプレート(核酸抽出または精製キット)を数回逆さまにして、磁気ビーズを再懸濁します。10秒間短い渦を流した後、プレートからアルミホイルシーリングを慎重に取り外します。
3. 各サンプルとポジティブコントロールとしての ピロリ菌 DNAから200μLの胃液を別々のウェルに移します。
4. 32ウェルプレートを核酸抽出機の対応するサンプルスロットに配置し、自動DNA抽出を行います。
5. DNAの抽出と確認後、陽性サンプルのqPCRを介してクラリスロマイシンとレボフロキサシンの抗生物質耐性試験を開始します。
6. 過剰な胃液と抽出したDNAサンプルを-20°Cで置き、長期保存と将来の使用に備えてください。
7. 汚染を避けるために、バイオセーフティキャビネットでこれらすべての手順を実行してください。

3. ピロリ菌 の検出と抗生物質(クラリスロマイシンとレボフロキサシン)に対する耐性のためのqPCR

1. ピロリ菌およびそのゲノム内の抗生物質耐性変異の疑いを検出するためにqPCRを実行します。
   1. qPCR反応液(ピロリ菌 核酸検出キット)を氷上で解凍し、試薬の損失を防ぐためにフリックやスピニングで混合します。
   2. 32ウェルプレート上の各サンプルについて、20 μLのPCR反応混合物(ジェノタイピング反応プレミックス[Taq酵素、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、反応バッファー、塩化マグネシウムを含む]、尿素フォワードプライマーとリバースプライマー、および 尿素 プローブ)と、抽出したDNA5 μLを混合します。
   3. 32 ウェル qPCR プレートを qPCR マシンで実行します。サーマルサイクラーをプログラムする:反応混合物は、最初に42°Cと95°C(両方とも1サイクル)でそれぞれ2分間順次反応します。その後、95°Cで40サイクル、変性を10秒間、アニーリングと伸長を58°Cで45秒間行った。
   4. 蛍光シグナル取得をFAM(H. pylori)に設定し、データ取得を増幅延長期間に設定します。反応が完了したら、将来の結果分析のためにデータを保存します。
   5. qPCR用の特定のソフトウェアを使用してデータを分析します, 機器は自動的にベースラインしきい値を選択します.
   6. ピロリ菌の検査結果が陽性の場合、機械は自動的にサンプルの薬剤耐性試験を開始します。試薬キットを、H.ピロリ菌(qPCR)キットの23S rRNA遺伝子およびgyrA遺伝子変異の検出試薬に置き換えます。
      注:試薬キット(ヘリコバクターピロリの23S rRNA遺伝子およびgyrA遺伝子変異[qPCR]の検出試薬)には、PCR反応混合物(ジェノタイピング反応プレミックス[Taq酵素、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、反応バッファー、塩化マグネシウムを含む])、プライマー、およびプローブ)が含まれています。すべての負の品質管理製品は滅菌精製水です。ピロリ菌核酸検出キットの陽性品質管理製品は、不活化ピロリ菌標準ビーズ(ATCC 43504)です。キット内の強ピロリ菌陽性および弱陽性の品質管理品(ピロリ菌の23S rRNA遺伝子およびgyrA遺伝子変異の検出試薬)は、標的遺伝子と変異遺伝子を含む不活化ピロリ菌株のDNAです。同様に、実際の状況に基づいて、ピロリ菌感染の有無や薬剤耐性を含むすべての診断基準は、CT ≤ 35に設定され、典型的なS字型の曲線を持っています。弱い品質管理の濃度は1.0 x 10³コピー/ mLであり、強い品質管理の濃度は1.0 x 10⁸コピー/ mLです。

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結果

qPCR法による胃液中の ピロリ菌 感染と抗生物質耐性の検出
尿素A遺伝子を増幅してピロリ菌感染を検出するためにqPCRを行い、23S rRNA遺伝子とgyrA遺伝子の点突然変異を標的とすることで抗生物質耐性プロファイルを決定しました(表1)。qPCR実験の3つのグループすべての品質管理CT値は推奨範囲内であり、実験時にサンプルがすべて正常な状?...

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ディスカッション

ピロリ菌 の検出は、侵襲的および非侵襲的方法の両方を用いて行うことができる¹³。組織病理学、迅速ウレアーゼ検査、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、細菌培養などの一般的に使用される侵襲的技術には、内視鏡検査と生検が必要です。血清学的検査、尿素呼気検査、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)は、非侵襲的手順の中で推奨されます¹⁴。非?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent