Diagnostic rapide quantitatif par réaction en chaîne par polymérase (qPCR) de l’infection à Helicobacter pylori et de la résistance aux antibiotiques

Résumé

Le protocole présente une méthode non invasive pour le diagnostic rapide des infections de l’estomac à Helicobacter pylori par le test de corde et détermine sa résistance aux antibiotiques à la clarithromycine et à la lévofloxacine en utilisant la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR).

Résumé

Helicobacter pylori est un agent pathogène humain majeur qui infecte environ la moitié de la population mondiale et devient une menace sérieuse pour la santé en raison de sa résistance croissante aux antibiotiques. C’est l’agent causal de la gastrite chronique active, de l’ulcère gastroduodénal et du cancer gastrique et a été classé comme cancérogène du groupe I par le Centre international de recherche sur le cancer. Par conséquent, le diagnostic rapide et précis de H. pylori et la détermination de sa résistance aux antibiotiques sont importants pour l’éradication efficace de ce pathogène bactérien. Actuellement, les méthodes de diagnostic de H. pylori comprennent principalement le test respiratoire à l’urée (UBT), le test antigénique, le test d’anticorps sériques, la gastroscopie, le test rapide d’uréase (RUT) et la culture bactérienne. Parmi elles, les trois premières méthodes de détection sont non invasives, ce qui signifie qu’elles sont faciles à effectuer. Cependant, les bactéries ne peuvent pas être récupérées par ces techniques; Par conséquent, les tests de résistance aux médicaments ne peuvent pas être effectués. Les trois derniers sont des examens invasifs, mais ils sont coûteux, nécessitent des compétences élevées et ont le potentiel de causer des dommages aux patients. Par conséquent, une méthode non invasive, rapide et simultanée pour la détection de H. pylori et les tests de résistance aux médicaments est très importante pour éradiquer efficacement H. pylori dans la pratique clinique. Ce protocole vise à présenter une procédure spécifique impliquant le test de corde en combinaison avec la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) pour la détection rapide de l’infection à H. pylori et de la résistance aux antibiotiques. Contrairement aux cultures bactériennes, cette méthode permet un diagnostic facile, rapide et non invasif de l’état d’infection à H. pylori et de la résistance aux médicaments. Plus précisément, nous avons utilisé la qPCR pour détecter rea pour l’infection à H. pylori et les mutations dans les gènes de l’ARNr 23S et du gyrA, qui codent respectivement pour la résistance à la clarithromycine et à la lévofloxacine. Comparé aux techniques de culture couramment utilisées, ce protocole fournit une technique non invasive, peu coûteuse et rapide pour détecter l’infection à H. pylori et déterminer sa résistance aux antibiotiques à l’aide de la qPCR.

Introduction

H. pylori est une bactérie à Gram négatif en forme de spirale, très mobile, qui vit principalement dans la région du pylore de l’estomac¹. C’est un agent pathogène commun qui infecte près de 50% de la population mondiale². La plupart des personnes atteintes d’une infection à H. pylori n’ont pas de manifestations cliniques et la plupart développent différentes maladies après plusieurs années d’infection, notamment une gastrite chronique, des ulcères gastroduodénaux, des ulcères gastriques et un cancer gastrique³. Dans plusieurs études basées sur différentes populations, l’efficacité de l’élimination de H. pylori pour prévenir le cancer de l’estomac et les lésions précancéreuses a été démontrée ^4,5. Par conséquent, le Centre international de recherche sur le cancer de l’Organisation mondiale de la Santé (OMS) a conseillé l’éradication de H. pylori à titre préventif⁶.

L’utilisation de méthodes non invasives pour identifier l’infection à H. pylori est un élément clé du traitement pour la plupart des personnes atteintes de dyspepsie asymptomatique. Le test respiratoire à l’urée (UBT), le test d’antigène fécal (SAT) de H. pylori et les tests sérologiques sont des techniques non invasives populaires. Parmi celles-ci, l’UBT est la procédure la moins intrusive et la plus précise disponible. UBT utilise l’uréase, abondamment présente dans H. pylori, pour hydrolyser l’urée marquée isotopiquement en ammoniac et dioxyde de carbone (13C ou 14C). En revanche, le test immunochromatographique (ICA)⁷ est pratique, simple et non invasif pour l’échantillonnage. Cependant, la précision du test est affectée par plusieurs facteurs, tels que la qualité de l’échantillon de selles, la température et l’intervalle entre le prélèvement de l’échantillon et l’analyse. Un autre test basé sur la réponse immunitaire est le test d’anticorps sériques H. pylori , qui détecte les anticorps dans le sérum d’un patient. Cependant, ce test n’est pas adapté à l’analyse post-traitement car les anticorps restent longtemps après que les bactéries ont été éliminées⁸. Un autre inconvénient majeur est que ces méthodes ne diagnostiquent que l’infection à H. pylori et ne permettent pas de tests de résistance aux médicaments pour guider le traitement basé sur la sensibilité.

Pour les méthodes de test invasives, le tissu de biopsie gastrique doit être prélevé par endoscopie, puis soumis à l’histologie, au test rapide de l’uréase et à la culture bactérienne. Ces méthodes de test sont également très limitées en raison de plusieurs facteurs. Actuellement, ces techniques sont limitées aux patients âgés, aux patients à haut risque de maladie précancéreuse ou maligne et aux patients qui ont échoué au traitement de première intention pour le reflux gastro-œsophagien ou l’infection à H. pylori ⁹. Deuxièmement, en raison des caractéristiques de croissance uniques de H. pylori, le taux de réussite de la culture bactérienne n’atteint que 50%¹⁰. Ainsi, les méthodes de détection moléculaire offrent un nouvel espoir pour surmonter les exigences élevées des méthodes de détection invasives et guider le traitement basé sur la sensibilité. Parmi les méthodes de détection moléculaire, la PCR quantitative a énormément évolué ces dernières années. La qPCR, contrairement à la PCR traditionnelle, ne nécessite pas d’électrophorèse sur gel et quantifie avec précision l’ADN / ARN dans les échantillons en ajoutant des amorces et des sondes au stade du recuit. Les kits qPCR pour la détection de l’infection à H. pylori et de la résistance aux médicaments sont maintenant disponibles dans le commerce. Néanmoins, chaque méthode a ses limites; Par conséquent, le diagnostic clinique et le traitement d’un patient doivent être considérés en conjonction avec ses symptômes, ses signes, ses antécédents, d’autres tests de laboratoire et sa réponse au traitement.

Actuellement, la principale méthode de traitement des infections à H. pylori est la prise d’antibiotiques, mais dernièrement, il devient de plus en plus difficile de traiter ces infections en raison de l’augmentation de la résistance aux antibiotiques. Par la suite, une baisse significative de l’efficacité du traitement de H. pylori a été observée à l’échelle mondiale, faisant de l’éradication de H. pylori un problème majeur de santé publique¹¹.

La clarithromycine et la lévofloxacine sont les deux antibiotiques à large spectre utilisés pour traiter les infections causées par H. pylori, mais plusieurs études ont signalé une résistance généralisée contre ces deux médicaments dans les isolats d’H. pylori. A2143G, A2142G et A2142C sont trois des nombreuses mutations ponctuelles trouvées dans le gène de l’ARNr 23S de 2,9 kb qui entraînent une résistance à la clarithromycine en empêchant le macrolide de se lier. Dans le même temps, les loci de mutation du gène de résistance à la lévofloxacine sont principalement situés dans les six sites de mutation (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) du gène gyrA ¹². La découverte de ces mécanismes de résistance basés sur des mutations génétiques a conduit à un changement progressif dans la détection de H. pylori par le biais d’études culturelles vers des tests moléculaires.

Dans l’ensemble, il existe un besoin clinique urgent d’une méthode de diagnostic non invasive, efficace et simultanée pour la détection des infections à H. pylori et de la résistance aux médicaments. Nous avons adopté un test combiné de corde et une méthode qPCR pour surmonter les difficultés d’échantillonnage et atteindre l’objectif de détection simultanée de l’infection à H. pylori et de la résistance aux médicaments à l’aide de différentes sondes d’amorce.

Protocole

La présente étude a été menée conformément aux considérations éthiques établies par le comité d’éthique de l’hôpital populaire provincial de Guangdong, Southern Medical University, Guangzhou, Chine (numéro d’approbation : KY-Q-2022-384-02). Les patients âgés de 18 à 60 ans ont été inclus dans cette étude. Les patients prenant des antibiotiques, des médicaments antibactériens chinois, des médicaments tels que des inhibiteurs de la pompe à protons (IPP) ou des antagonistes des récepteurs H 2, etc., dans les₂ semaines précédant les tests n’ont pas été inclus dans cette étude. Les patients qui avaient reçu un traitement contre H. pylori au cours des 3 derniers mois ont également été exclus de cette étude. Les personnes souffrant de graves problèmes cardiaques, hépatiques et rénaux, de neuropathie grave ou de maladie mentale n’ont pas non plus été autorisées à participer à cette étude. Aucune femme enceinte et mère allaitante n’a été incluse dans cette étude. Les détails des fournitures (réactifs, produits chimiques, équipement et logiciels) utilisés dans cette étude sont donnés dans le tableau des matériaux.

1. Test de corde pour l’échantillonnage du liquide gastrique

1. Demandez au patient de jeûner pendant la nuit avant le prélèvement de l’échantillon.
2. Le lendemain, ouvrez le kit de test de corde, prenez la capsule et maintenez la boucle au bout de la ficelle.
3. Collez la ficelle sur la joue du patient et demandez-lui de placer la capsule sur sa langue, près du fond de la gorge et de l’avaler avec une gorgée d’eau.
4. Laissez la capsule être dissoute dans l’estomac du patient, exposant ainsi la ficelle à l’intérieur de la capsule pour absorber le mucus gastrique.
5. Demandez à un assistant qualifié de retirer soigneusement la ficelle 1 h après que le patient ait avalé la capsule.
6. Couper l’extrémité inférieure de la ficelle (40 cm) imbibée de liquide gastrique, la placer dans la solution de conservation d’échantillons TSE (Tris/saline/EDTA), puis l’envoyer au laboratoire clinique à température ambiante (RT) pour la détection ultérieure de H. pylori et la détermination des profils de résistance aux antibiotiques par qPCR.

2. Extraction de l’ADN

1. Placez les tubes de prélèvement transportant des échantillons sur un support à tube à essai, correctement étiquetés, et tourbillonnez-les pendant 10 s.
2. Retournez plusieurs fois la plaque de 32 puits (kit d’extraction ou de purification d’acide nucléique) pour remettre les billes magnétiques en suspension. Après un vortex court pendant 10 s, retirez soigneusement le joint de feuille d’aluminium de la plaque.
3. Transférer 200 μL de liquide gastrique de chaque échantillon et l’ADN de H. pylori comme témoin positif dans les puits séparés.
4. Placez la plaque de 32 puits dans la fente d’échantillon correspondante de la machine d’extraction d’acide nucléique pour l’extraction automatique de l’ADN.
5. Après l’extraction et la confirmation de l’ADN, initier les tests de résistance aux antibiotiques pour la clarithromycine et la lévofloxacine par qPCR sur les échantillons positifs.
6. Placez l’excès de liquide gastrique et les échantillons d’ADN extraits à -20 °C pour un stockage à long terme et une utilisation future.
7. Effectuez toutes ces étapes dans une enceinte de biosécurité pour éviter toute contamination.

3. qPCR pour la détection de H. pylori et de la résistance aux antibiotiques (clarithromycine et lévofloxacine)

1. Effectuer une qPCR pour la détection de H. pylori et des mutations suspectées de résistance aux antibiotiques dans son génome.
   1. Décongeler le mélange réactionnel qPCR (kit de détection d’acide nucléique H. pylori ) sur de la glace et mélanger en le frappant et en tournant pour éviter toute perte de réactif.
   2. Pour chaque échantillon sur une plaque de 32 puits, mélanger 20 μL de mélange réactionnel PCR (prémélange réactionnel de génotypage [contenant l’enzyme Taq, le désoxyribonucléoside triphosphate, le tampon réactionnel et le chlorure de magnésium], avec des amorces avant et arrière de l’urée A et une sonde d’urée ) et 5 μL de l’ADN extrait.
   3. Exécutez la plaque qPCR 32 puits sur la machine qPCR. Programmer le cycleur thermique : le mélange réactionnel réagira d’abord séquentiellement à 42 °C et 95 °C (les deux pendant un cycle) pendant 2 min chacun ; puis, 40 cycles à 95 °C, dénaturation pendant 10 s, et recuit et extension à 58 °C pendant 45 s.
   4. Réglez l’acquisition du signal de fluorescence sur FAM (H. pylori) et l’acquisition des données sur la période d’extension de l’amplification. Une fois la réaction terminée, enregistrez les données pour une analyse ultérieure des résultats.
   5. Analysez les données à l’aide d’un logiciel spécifique pour la qPCR, car l’instrument sélectionnera automatiquement les seuils de base.
   6. Si le résultat du test pour H. pylori est positif, l’appareil commencera automatiquement le test de résistance aux médicaments sur l’échantillon. Remplacez le kit de réactif par des réactifs de détection pour les mutations du gène de l’ARNr 23S et du gène gyrA dans le kit H. Pylori (qPCR).
      REMARQUE: Le kit de réactif (réactifs de détection pour le gène de l’ARNr 23S et les mutations du gène gyrA chez Helicobacter pylori [qPCR]) comprend le mélange réactionnel PCR (prémélange de réaction de génotypage [contenant l’enzyme Taq, le désoxyribonucléoside triphosphate, tampon réactionnel, chlorure de magnésium], amorces et sondes). Tous les produits de contrôle de qualité négatifs sont de l’eau stérile et purifiée. Le produit de contrôle de la qualité positif dans la trousse de détection des acides nucléiques de H. pylori est constitué de billes standard inactivées de H. pylori (ATCC 43504). Les produits de contrôle de qualité fortement positifs à H. pylori et à faible qualité positifs dans la trousse (réactifs de détection du gène de l’ARNr 23S et mutations du gène gyrA chez H. pylori) sont l’ADN de la souche H. pylori inactivée contenant le gène cible et le gène mutant. De même, en fonction de la situation réelle, toutes les normes diagnostiques, y compris la présence d’une infection à H. pylori ou d’une résistance aux médicaments, sont réglées sur CT ≤ 35 et ont une courbe typique en forme de S. La concentration du contrôle de qualité faible est de 1,0 x 10³ copies/mL, tandis que la concentration du contrôle de qualité fort est de 1,0 x 10⁸ copies/mL.

Résultats

Détection de l’infection à H. pylori et de la résistance aux antibiotiques dans les sécrétions gastriques par qPCR
Nous avons effectué la qPCR pour la détection de l’infection à H. pylori en amplifiant le gène uré A et déterminé son profil de résistance aux antibiotiques en ciblant les mutations ponctuelles du gène de l’ARNr 23S et du gène gyrA (Tableau 1). Les valeurs CT du contrôle de la qualité dans les trois groupes des ex...

Discussion

La détection de H. pylori peut être effectuée à l’aide de méthodes invasives et non invasives¹³. Les techniques invasives couramment utilisées telles que l’histopathologie, le test rapide de l’uréase, la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et la culture bactérienne nécessitent une endoscopie et une biopsie. Les tests sérologiques, les tests respiratoires à l’urée et les tests immuno-enzymatiques (ELISA) sont recommandés parmi les procédures non invasives

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent