Количественная экспресс-диагностика инфекции Helicobacter pylori и устойчивости к антибиотикам на основе количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР)

Резюме

В протоколе представлен неинвазивный метод экспресс-диагностики инфекций желудка Helicobacter pylori с помощью струнного теста и определения его антибиотикорезистентности к кларитромицину и левофлоксацину с помощью количественной полимеразной цепной реакции (кПЦР).

Аннотация

Helicobacter pylori является основным патогеном человека, который заражает примерно половину населения мира и становится серьезной угрозой для здоровья из-за растущей устойчивости к антибиотикам. Он является возбудителем хронического активного гастрита, язвенной болезни и рака желудка и был классифицирован Международным агентством по изучению рака как канцероген I группы. Поэтому быстрая и точная диагностика H. pylori и определение его устойчивости к антибиотикам важны для эффективной эрадикации этого бактериального патогена. В настоящее время методы диагностики H. pylori в основном включают дыхательный тест на мочевину (UBT), тест на антиген, тест на антитела в сыворотке, гастроскопию, экспресс-тест на уреазу (RUT) и бактериальный посев. Среди них первые три метода обнаружения являются неинвазивными, что означает, что их легко проводить. Однако бактерии не могут быть извлечены с помощью этих методов; Таким образом, тестирование на лекарственную устойчивость не может быть выполнено. Последние три являются инвазивными исследованиями, но они являются дорогостоящими, требуют высоких навыков и могут нанести вред пациентам. Таким образом, неинвазивный, быстрый и одновременный метод обнаружения H. pylori и тестирования лекарственной устойчивости очень важен для эффективной эрадикации H. pylori в клинической практике. Этот протокол направлен на то, чтобы представить конкретную процедуру, включающую струнный тест в сочетании с количественной полимеразной цепной реакцией (кПЦР) для быстрого выявления инфекции H. pylori и устойчивости к антибиотикам. В отличие от бактериальных культур, этот метод позволяет легко, быстро, неинвазивно диагностировать инфекционный статус H. pylori и лекарственную устойчивость. В частности, мы использовали кПЦР для обнаружения инфекции H. pylori и мутаций в генах 23S рРНК и gyrA, которые кодируют резистентность к кларитромицину и левофлоксацину соответственно. По сравнению с обычно используемыми методами культивирования, этот протокол обеспечивает неинвазивный, недорогой и экономящий время метод выявления инфекции H. pylori и определения ее устойчивости к антибиотикам с помощью кПЦР.

Введение

H. pylori представляет собой спиралевидную, высокоподвижную, грамотрицательную бактерию, которая в основном обитает в привратной области желудка¹. Это распространенный патоген, который заражает почти 50% населения мира². Большинство людей с инфекцией H. pylori не имеют клинических проявлений, и у большинства из них после нескольких лет инфекции развиваются различные заболевания, включая хронический гастрит, язвенную болезнь, язву желудка и рак желудка³. В нескольких исследованиях, основанных на различных популяциях, была продемонстрирована эффективность элиминации H. pylori для профилактики рака желудка и предраковых поражений ^4,5. Поэтому Международное агентство по изучению рака Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) рекомендовало ликвидацию H. pylori в качестве профилактической меры⁶.

Использование неинвазивных методов для выявления инфекции H. pylori является ключевым компонентом лечения большинства людей с бессимптомной диспепсией. Дыхательный тест на мочевину (UBT), тест на фекальный антиген H. pylori (SAT) и серологическое тестирование являются популярными неинвазивными методами. Среди них UBT является наименее навязчивой и наиболее точной доступной процедурой. UBT использует уреазу, в изобилии присутствующую в H. pylori, для гидролиза изотопно меченной мочевины в аммиак и углекислый газ (13C или 14C). Напротив, иммунохроматографический анализ (ICA)⁷ удобен, прост и неинвазивен для отбора проб. Однако на точность теста влияет несколько факторов, таких как качество образца стула, температура и интервал между сбором образца и тестированием. Другим тестом, основанным на иммунном ответе, является сывороточный тест на антитела к H. pylori , который обнаруживает антитела в сыворотке крови пациента. Однако этот тест не подходит для анализа после лечения, поскольку антитела остаются еще долго после того, как бактерии были очищены⁸. Другим серьезным недостатком является то, что эти методы только диагностируют инфекцию H. pylori и не позволяют проводить тестирование лекарственной устойчивости для лечения на основе чувствительности.

Для инвазивных методов тестирования биопсия ткани желудка должна быть взята с помощью эндоскопии, а затем подвергнута гистологии, экспресс-тесту на уреазу и бактериальному посеву. Эти методы тестирования также очень ограничены из-за нескольких факторов. В настоящее время эти методы ограничены пожилыми пациентами, пациентами с высоким риском предраковых или злокачественных заболеваний и пациентами, которые не смогли провести терапию первой линии по поводу гастроэзофагеальной рефлюксной болезни или инфекции H. pylori ⁹. Во-вторых, из-за уникальных характеристик роста H. pylori вероятность успеха бактериальной культуры достигает только 50%¹⁰. Таким образом, молекулярные методы обнаружения дают новую надежду на преодоление высоких требований к инвазивным методам обнаружения и руководству лечением, основанным на чувствительности. Среди молекулярных методов обнаружения количественная ПЦР в последние годы претерпела огромные изменения. кПЦР, в отличие от традиционной ПЦР, не требует гель-электрофореза и точно количественно определяет ДНК/РНК в образцах путем добавления праймеров и зондов на стадии отжига. В настоящее время коммерчески доступны наборы для ПЦР для выявления инфекции H. pylori и лекарственной устойчивости. Тем не менее, каждый метод имеет свои ограничения; Поэтому клинический диагноз и лечение пациента следует рассматривать в сочетании с его симптомами, признаками, анамнезом, другими лабораторными тестами и ответом на лечение.

В настоящее время основным методом лечения инфекций H.pylori является прием антибиотиков, но в последнее время становится все труднее лечить эти инфекции из-за роста устойчивости к антибиотикам. Впоследствии во всем мире наблюдалось значительное снижение эффективности лечения H . pylori , что сделало ликвидацию H. pylori одной из основных проблем общественного здравоохранения¹¹.

Кларитромицин и левофлоксацин являются двумя антибиотиками широкого спектра действия, используемыми для лечения инфекций, вызванных H.pylori, но в нескольких исследованиях сообщалось о широко распространенной резистентности к этим двум препаратам в изолятах H.pylori. A2143G, A2142G и A2142C являются тремя из многочисленных точечных мутаций, обнаруженных в гене 2.9 kb 23S рРНК, которые приводят к резистентности к кларитромицину, предотвращая связывание макролида. При этом мутационные локусы гена резистентности к левофлоксацину в основном расположены в шести мутационных сайтах (A260T, C261A, T261G, G271A, G271T, A272G) гена gyrA ¹². Открытие этих механизмов резистентности, основанных на генетических мутациях, привело к постепенному переходу к выявлению H. pylori посредством культуральных исследований к молекулярному тестированию.

В целом, существует острая клиническая потребность в неинвазивном, эффективном и одновременном методе диагностики для выявления инфекций H. pylori и лекарственной устойчивости. Мы приняли комбинированный метод струнного теста и кПЦР, чтобы преодолеть трудности отбора проб и достичь цели одновременного выявления инфекции H. pylori и лекарственной устойчивости с использованием различных праймерных зондов.

протокол

Настоящее исследование было проведено в соответствии с этическими соображениями, установленными этическим комитетом Народной больницы провинции Гуандун, Южный медицинский университет, Гуанчжоу, Китай (номер утверждения: KY-Q-2022-384-02). В исследование были включены пациенты в возрасте от 18 до 60 лет. Пациенты, принимающие антибиотики, антибактериальные китайские препараты, такие препараты, как ингибиторы протонной помпы (ИПП) или антагонисты_{Н2-рецепторов} и т. д., в течение 2 недель до тестирования, не были включены в это исследование. Те пациенты, которые получали лечение против H.pylori в течение последних 3 месяцев, также были исключены из этого исследования. Люди с серьезными проблемами с сердцем, печенью, почками, тяжелой невропатией или психическими заболеваниями также не были допущены к участию в этом исследовании. В это исследование не были включены беременные женщины и кормящие матери. Подробная информация о расходных материалах (реагентах, химикатах, оборудовании и программном обеспечении), используемых в этом исследовании, приведена в таблице материалов.

1. Струнный тест для забора желудочной жидкости

1. Попросите пациента поститься в течение ночи перед взятием образца.
2. На следующий день откройте набор для тестирования струны, возьмите капсулу и удерживайте петлю на конце струны.
3. Привяжите веревку к щеке пациента и попросите его поместить капсулу на язык рядом с задней частью горла и проглотить ее, запивая глотком воды.
4. Позвольте капсуле раствориться в желудке пациента, тем самым подвергая нить внутри капсулы поглощению желудочной слизи.
5. Попросите обученного помощника осторожно вытащить веревочку через 1 ч после того, как пациент проглотил капсулу.
6. Отрежьте нижний конец нити (40 см), пропитанной желудочной жидкостью, поместите ее в раствор для консервации образца TSE (Tris/физиологический раствор/ЭДТА), а затем отправьте в клиническую лабораторию при комнатной температуре (ЛТ) для последующего выявления H. pylori и определения профилей антибиотикорезистентности с помощью кПЦР.

2. Экстракция ДНК

1. Поместите пробирки для сбора образцов на стойку для пробирок с надлежащей маркировкой и вращайте их в течение 10 секунд.
2. Переверните 32-луночную пластину (набор для экстракции или очистки нуклеиновых кислот) несколько раз, чтобы ресуспендировать магнитные шарики. После непродолжительного вихря в течение 10 с осторожно снимите уплотнитель алюминиевой фольги с пластины.
3. Перенесите 200 мкл желудочной жидкости из каждого образца и ДНК H. pylori в качестве положительного контроля в отдельные лунки.
4. Поместите 32-луночную пластину в соответствующий слот для образца машины для извлечения нуклеиновых кислот для автоматической экстракции ДНК.
5. После экстракции и подтверждения ДНК инициируйте тестирование на устойчивость к антибиотикам для кларитромицина и левофлоксацина с помощью кПЦР на положительных образцах.
6. Поместите избыточную желудочную жидкость и извлеченные образцы ДНК при -20 ° C для длительного хранения и использования в будущем.
7. Выполните все эти действия в шкафу биобезопасности, чтобы избежать загрязнения.

3. кПЦР для выявления H. pylori и резистентности к антибиотикам (кларитромицину и левофлоксацину)

1. Проведите кПЦР для обнаружения H. pylori и предполагаемых мутаций устойчивости к антибиотикам в его геноме.
   1. Разморозьте реакционную смесь для кПЦР (набор для обнаружения нуклеиновых кислот H. pylori ) на льду и перемешайте ее, щелкая и вращая, чтобы предотвратить потерю реагента.
   2. Для каждого образца на 32-луночном планшете смешайте 20 мкл реакционной смеси ПЦР (премикс реакции генотипирования [содержащий фермент Taq, дезоксирибонуклеозидтрифосфат, реакционный буфер и хлорид магния] с прямым и обратным праймерами мочевины и зондом мочевины ) и 5 мкл экстрагированной ДНК.
   3. Запустите 32-луночную планшет qPCR на машине qPCR. Запрограммируйте термоциклер: реакционная смесь сначала будет реагировать последовательно при 42 °C и 95 °C (оба в течение одного цикла) в течение 2 мин каждый; затем 40 циклов при 95 °C, денатурация в течение 10 с и отжиг и удлинение при 58 °C в течение 45 с.
   4. Установите сбор флуоресцентного сигнала на FAM (H. pylori), а сбор данных — на период продления амплификации. После того, как реакция будет завершена, сохраните данные для будущего анализа результатов.
   5. Проанализируйте данные с помощью специального программного обеспечения для qPCR, так как прибор автоматически выберет базовые пороговые значения.
   6. Если результат теста на H. pylori положительный, машина автоматически начнет тестирование лекарственной устойчивости образца. Замените набор реагентов реагентами для обнаружения мутаций гена 23S рРНК и гена gyrA в наборе H. Pylori (кПЦР).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Набор реагентов (реагенты для обнаружения мутаций гена 23S рРНК и гена gyrA у Helicobacter pylori [кПЦР]) включает реакционную смесь ПЦР (премикс реакции генотипирования [содержащий фермент Taq, дезоксирибонуклеозидтрифосфат, реакционный буфер, хлорид магния], праймеры и зонды). Все продукты негативного контроля качества – это стерильная, очищенная вода. Положительным продуктом контроля качества в наборе для обнаружения нуклеиновых кислот H. pylori являются инактивированные стандартные шарики H. pylori (ATCC 43504). Сильные H. pylori-положительные и слабоположительные положительные продукты контроля качества в наборе (реагенты для обнаружения мутаций гена 23S рРНК и гена gyrA в H. pylori) представляют собой ДНК инактивированного штамма H. pylori, содержащего ген-мишень и мутантный ген. Точно так же, исходя из реальной ситуации, все диагностические стандарты, включая наличие инфекции H. pylori или лекарственной устойчивости, установлены на КТ ≤ 35 и имеют типичную S-образную кривую. Концентрация при слабом контроле качества составляет 1,0 х 10 3 копий/мл, а концентрация при сильном контроле качества составляет 1,0 х 10,8^копий/мл.

Результаты

Обнаружение инфекции H. pylori и устойчивости к антибиотикам в желудочной жидкости с помощью кПЦР
Мы провели кПЦР для выявления инфекции H. pylori путем амплификации гена ureA и определили его профиль устойчивости к антибиотикам путем нацеливания на точечные мутации в ...

Обсуждение

Обнаружение H. pylori может быть выполнено как инвазивными, так и неинвазивными методами¹³. Обычно используемые инвазивные методы, такие как гистопатология, экспресс-тест на уреазу, полимеразная цепная реакция (ПЦР) и культивирование бактерий, требуют эндоскопии и биопсии...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
23S rRNA and gyrA gene point mutations detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Detection of Helicobacter pylori resistance to clarithromycin and levofloxacin
ABI 7500 fluorescence quantitative PCR machine	Thermo Fisher Scientific	SEDA 20163220767	Fluorescent quantitative PCR amplification
ABI 7500 software	Thermo Fisher Scientific		Data Analysis
BSC-1500IIA2-X	BIOBASE	SEDA 20143222263	Biosafety cabinet
DNA extraction kit	Daan Gene
E-Centrifuge	WEALTEC		Centrifuge the residual liquid off the wall of the tube.
H. Pylori DNA detection kit (PCR-Fluorescence Probing)	Hongmed Infagen		Testing for H. pylori infection
Stream SP96 automated nucleic acid extractor	Daan Gene	SEDA 20140104	For DNA extraction
String test kit	Hongmed Infagen		It contains a capsule attached to a string, scissors, cotton swab, and sample preservation tube
Ultra-low temperature freezers (DW-YL450)	MELING	SEDA 20172220091	-20 °C for storing reagents
Vortex-5	Kylin-bell		For mixing reagent