استخراج الحمض النووي الخالي من الخلايا لعينات الفكاهة الزجاجية والمائية لتشخيص ومراقبة سرطان الغدد الليمفاوية في الشبكية والجسم الزجاجي

Summary

تم إنشاء إجراء لاستخراج الحمض النووي الخالي من الخلايا من الفكاهة الزجاجية والمائية لإجراء دراسات جزيئية لتشخيص سرطان الغدد الليمفاوية في الشبكية والجسم الزجاجي. توفر الطريقة القدرة على استخراج الحمض النووي بشكل متزامن من المكون الخلوي للعينة أو حجزه للاختبار الإضافي.

Abstract

يمثل سرطان الغدد الليمفاوية الشبكية والجسم الزجاجي (VRL) سرطان الغدد الليمفاوية العدواني ، وغالبا ما يصنف على أنه سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة المنتشرة في الجهاز العصبي المركزي الأساسي. لتشخيص VRL ، يتم جمع عينات مثل الفكاهة الزجاجية ، ومؤخرا ، الفكاهة المائية. يشمل الاختبار التشخيصي ل VRL على هذه العينات علم الخلايا وقياس التدفق الخلوي والاختبار الجزيئي. ومع ذلك ، فإن كل من علم الأمراض الخلوي وقياس التدفق الخلوي ، إلى جانب الاختبار الجزيئي باستخدام الحمض النووي الخلوي ، يستلزم خلايا كاملة سليمة. يكمن التحدي في حقيقة أن الفكاهة الزجاجية والمائية عادة ما يكون لها خلوية منخفضة ، ويتم تدمير العديد من الخلايا أثناء الجمع والتخزين والمعالجة. علاوة على ذلك ، تشكل هذه العينات صعوبات إضافية للاختبار الجزيئي بسبب اللزوجة العالية للفكاهة الزجاجية وانخفاض حجم كل من الفكاهة الزجاجية والمائية. تقترح هذه الدراسة طريقة لاستخراج الحمض النووي الخالي من الخلايا من العينات الزجاجية والمائية. يكمل هذا النهج استخراج الحمض النووي الخلوي أو يسمح باستخدام المكون الخلوي لهذه العينات في طرق التشخيص الأخرى ، بما في ذلك علم الخلايا وقياس التدفق الخلوي.

Introduction

سرطان الغدد الليمفاوية الشبكية والجسم الزجاجي (VRL) هو سرطان الغدد الليمفاوية العدواني المرتبط بسرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة المنتشرة في الجهاز العصبي المركزي^{الأولي 1،2،3}. عادة ما يكون VRL قاتلا بسبب تورطه في الجهاز العصبي المركزي ^1,2. على الرغم من ندرته^1,4 ، إلا أن VRL غالبا ما يظهر بأعراض مشابهة لالتهاب القزحية الخلفي وأمراض الشبكية والجسم الزجاجي الأخرى ^4,5. وبالتالي ، فإن المرضى الذين تظهر عليهم أعراض التهاب القزحية يحتاجون إلى تشخيص إما لتأكيد أو استبعاد VRL.

في الآونة الأخيرة ، تم نشر معايير الإجماع لتشخيص VRL ، والتي تنطوي على مزيج من الفحص السريري والنتائج المختبرية⁶. تشمل العينات المستخدمة عادة لتشخيص VRL الفكاهة الزجاجية ، ومؤخرا ، الفكاهة المائية⁷. يتم الحصول على الفكاهة الزجاجية من خلال إجراء جراحي يسمى pars plana vitrectomy ، والذي يسمح بالوصول إلى الجزء الخلفي من العين⁸.

في البروتوكول المقدم ، تم جمع كل من عينات الفكاهة المائية والخلط الزجاجي لاستخراج الخلايا و cfDNA. بعد تخدير المرضى ووضع المبازل على بعد حوالي 4 مم من ليمبوس القرنية ، تم الحصول على عينة من الخلط المائي من حوالي 100-200 ميكرولتر باستخدام حقنة 1 مل من السل في ليمبوس القرنية. بالنسبة للمرضى الكاذبين ، تم الحصول على الجسم الزجاجي غير المخفف عن طريق إدخال الهواء المعقم في التسريب ، مما يتيح جمع كمية أكبر من الجسم الزجاجي غير المخفف (حتى 3.5 مل). في المرضى الذين يعانون من phakic ، تمت إزالة ما يقرب من 500 إلى 1000 ميكرولتر من الجسم الزجاجي غير المخفف قبل تشغيل ضخ محلول الملح المتوازن. في بعض الحالات ، تم جمع الجسم الزجاجي المخفف بشكل ثانوي (500 إلى 2000 ميكرولتر) عن طريق تحويل التسريب إلى سائل ووضع الزجاجي داخل التنورة الزجاجية للحصول على هذه العينة. تم جمع الجزء الزجاجي الأكثر تخفيفا عن طريق الحفاظ على كيس الكاسيت (الشكل التكميلي 1) في نهاية الجراحة. بمجرد وصول هذه الحقيبة إلى قسم علم الأمراض ، تم الحصول على الجسم الزجاجي المخفف من تصريف السوائل من هذا الكيس إلى أنابيب مخروطية لاستخراج الحمض النووي لاحقا.

غالبا ما يعتبر علم الأمراض الخلوي للسائل الزجاجي المعيار الذهبي⁹. ومع ذلك ، فقد أظهرت العديد من الدراسات حساسية محدودة بسبب المعالجة والحد الأدنى من الخلوية¹⁰،^11،12. يمكن أن يساعد قياس التدفق الخلوي في تحديد الخلايا البائية النسيلية ولكن يمكن أيضا أن يكون محدودا بسبب انخفاض الخلوية وهشاشة خلايا سرطان الغدد الليمفاوية الكبيرة¹³،^14،15. يتطلب كل من علم الأمراض الخلوي وقياس التدفق الخلوي خلايا كاملة سليمة. يتم تدمير العديد من هذه الخلايا أثناء الجمع والتخزين والمعالجة. عندما يتم إجراء الاختبار الجزيئي باستخدام الحمض النووي المستخرج من الخلايا السليمة (الحمض النووي الخلوي) ، فإنه يعاني من نفس القيد. بالإضافة إلى ذلك ، فإن تقسيم العينة الزجاجية المحدودة لجميع هذه الاختبارات يقلل من كمية المواد المتاحة لكل اختبار.

يمثل الحمض النووي الخالي من الخلايا (cfDNA) مصدرا آخر للحمض النووي لا يتطلب خلايا سليمة. تم استخدام cfDNA من العينات الزجاجية للكشف عن VRL ^16,17 وكذلك سرطان الجلد العنبي¹⁸. في هذا البروتوكول ، يتم استخراج الحمض النووي الخلوي والخالي من الخلايا من السائل الزجاجي والمائي للكشف عن VRL.

Protocol

يتبع البروتوكول الحالي إرشادات الرعاية البشرية وبموافقة مجلس المراجعة المؤسسية (IRB) بجامعة ميشيغان. تم الحصول على تنازل عن الموافقة المستنيرة لهذا من IRB. لا توجد معايير إدراج أو استبعاد ذات صلة للمرضى المعنيين.

1. فصل المكونات الخلوية والخالية من الخلايا

ملاحظة: يمكن استلام ثلاثة أنواع من العينات للاختبار التشخيصي VRL: الجسم الزجاجي (غير مخفف ؛ سائل من استئصال الزجاجية تم جمعه قبل بدء التسريب) ، الجسم الزجاجي المخفف داخل كيس كاسيت (الشكل 1) ، والخلط المائي (سائل من الغرفة الأمامية للعين).

1. بالنسبة للسائل الزجاجي غير المخفف ، وهو لزج جدا ، قم بتخفيفه باستخدام 3-5 مل من برنامج تلفزيوني لتسهيل عملية سحب الماصة.
2. بالنسبة للزجاج المخفف داخل كيس الكاسيت (الشكل التكميلي 1) ، قم بتصريف السائل في أنابيب مخروطية سعة 50 مل (واحد لكل 45 مل من السوائل).
3. الفكاهة المائية منخفضة جدا في الحجم (<200 ميكرولتر). لضمان أقصى قدر من استعادة الخلايا ، انقل العينة إلى أنبوب سعة 1.5 مل ، واشطف أنبوب الطرد المركزي الأصلي سعة 500 ميكرولتر الذي تم جمع العينة فيه بحجم متساو من PBS ، وأضفه إلى أنبوب 1.5 مل.
4. سائل زجاجي أو مائي بالطرد المركزي عند 3000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
5. قم بإزالة المادة الطافية بعناية باستخدام ماصة ، مع الحرص على عدم إزعاج الخلايا المحببة.

2. استخراج الحمض النووي من المكون الخلوي

1. أضف كمية مناسبة من محلول تحلل الخلايا (300 ميكرولتر للحبيبات الصغيرة ، 1 مل أو أكثر للحبيبات الكبيرة) (انظر جدول المواد). تخلط عن طريق سحب السحب لأعلى ولأسفل.
2. عند التحليل الكامل ، أضف 1/3 الحجم الإجمالي لمحلول راسب البروتين (100 ميكرولتر لكل 300 ميكرولتر محلل) (انظر جدول المواد).
3. دوامة بقوة لمدة 20-30 ثانية. تدور لمدة 3 دقائق عند 3000 × غرام في درجة حرارة الغرفة.
4. ماصة 300 ميكرولتر من الأيزوبروبانول في أنبوب طرد مركزي نظيف. ماصة بعناية طاف من الخطوة السابقة إلى أنبوب الأيزوبروبانول.
5. أضف 1.5 ميكرولتر من 20 مجم / مل من الجليكوجين (لتحلل 300 ميكرولتر) (انظر جدول المواد).
6. تخلط جيدا عن طريق الانقلاب ، ثم ضع العينة في الفريزر -20 درجة مئوية لمدة 1 ساعة إلى ليلة وضحاها للمساعدة في ترسيب الحمض النووي.
7. جهاز طرد مركزي أنبوب 1.5 مل لمدة 5 دقائق عند 3000 × جم في درجة حرارة الغرفة. ماصة قبالة الأيزوبروبانول.
8. أضف 0.5 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ واقلب الأنبوب لغسل الحبيبات.
9. تدور لمدة 1 دقيقة في 3000 × غرام في درجة حرارة الغرفة وصب الإيثانول. كرر غسل الإيثانول مرة واحدة.
10. اقلب الأنبوب على شاش نظيف لتصريف المحلول وتجفيف الحبيبات أو الصب. قم بتدوير الحمض النووي بسرعة في جهاز طرد مركزي دقيق وماصة القطرة المتبقية من الإيثانول بطرف ماصة يمكن التخلص منه (بمجرد عدم ترك أي إيثانول متبقي في الأنبوب ، يجب أن يكون الحمض النووي جافا وجاهزا للترطيب في 5-10 دقائق).
11. أضف 45 ميكرولتر من محلول ترطيب الحمض النووي (انظر جدول المواد) إلى حبيبات الحمض النووي المجففة.
12. ضع الأنبوب في كتلة تسخين عند 50 درجة مئوية واتركه يذوب لمدة 1-2 ساعة. ماصة الحمض النووي لأعلى ولأسفل لتسريع عملية الترطيب.
    ملاحظة: أضف المزيد من محلول ترطيب الحمض النووي إذا بدت العينة شديدة اللزوجة.

3. استخراج الحمض النووي الخالي من الخلايا

1. كمية الطافية من الخطوة 1.5 متغيرة. أضف 70 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتكييف (انظر جدول المواد) لكل ملليلتر من المادة الطافية.
2. امزج حبات المقاصة جيدا عن طريق الدوامة. أضف 10 ميكرولتر من خرز التطهير إذا تمت معالجة <14 مل من المادة الطافية الخالية من الخلايا ، و 20 ميكرولتر في حالة معالجة 14-40 مل.
3. امزج العينة / خليط الخرزة جيدا عن طريق الدوامة. جهاز طرد مركزي عند 3000 × جم لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. دون إزعاج الحبيبات ، ماصة خارج المادة الطافية تاركة وراءها 100 ميكرولتر إذا تم استخدام 10 ميكرولتر من خرز المقاصة ، و 200 ميكرولتر إذا تم استخدام 20 ميكرولتر من خرز الإزالة.
5. أضف حجما متساويا من محلول هضم حبيبات البول (انظر جدول المواد) إلى الحبيبات وأعد تعليق الحبيبات جيدا عن طريق الدوامة أو الماصة.
6. أضف Proteinase K (5٪ (v / v)) إلى الحبيبات المعاد تعليقها (على سبيل المثال ، أضف 10 ميكرولتر من Proteinase K إلى خليط 200 ميكرولتر) واخلطها جيدا عن طريق الدوامة اللطيفة.
7. احتضان خليط الحبيبات على حرارة 55 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
8. أضف حجما واحدا من محلول التحلل الجينومي (انظر جدول المواد) إلى خليط الهضم (على سبيل المثال ، 210 ميكرولتر من محلول التحلل الجينومي إلى 210 ميكرولتر من خليط الهضم) واخلطه بالدوامة.
9. انقل عمود الدوران المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) إلى أنبوب تجميع جديد.
10. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحضير الحمض النووي للبول إلى عمود الدوران ، وأجهزة الطرد المركزي عند ≥16000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتجاهل التدفق.
11. أضف 700 ميكرولتر من محلول غسيل الحمض النووي للبول إلى العمود ، وأجهزة الطرد المركزي عند ≥16000 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتجاهل التدفق.
12. كرر الخطوة مع 200 ميكرولتر من محلول غسيل الحمض النووي للبول.
13. انقل عمود الدوران إلى أنبوب طرد مركزي خال من DNase / RNase.
14. أضف الحجم المناسب من المخزن المؤقت لشطف الحمض النووي (بناء على الاختبارات الجزيئية المراد إجراؤها) مباشرة إلى مصفوفة العمود واتركه يقف لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: تم استخدام 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت للشطف في الحالات النموذجية. يتم استخدام المزيد من المخزن المؤقت للشطف إذا كانت هناك حاجة إلى اختبار إضافي.
15. أجهزة الطرد المركزي عند ≥16000 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة للحصول على الحمض النووي الخالي من الخلايا.

النتائج

تم إجراء طرق الاستخراج هذه على عدد محدود من الحالات لضمان العائد الكافي وقابلية التضخيم للحمض النووي الخالي من الخلايا مقارنة بالحمض النووي الخلوي من العينات الزجاجية (أربعة) والمائية (أربعة). من هذه العينات ، تتشابه إنتاجية الحمض النووي من المكون الخالي من الخلايا لهذه السوائل مع تلك الم...

Discussion

سرطان الغدد الليمفاوية الشبكية والجسم الزجاجي (VRL) هو سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الكبيرة^{العدوانية 1}،^2،3 التي يمكن أن تحاكي أعراضها أمراض الشبكية والجسم الزجاجي الأخرى ^4,5. أصبح الاختبار الجزيئي ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010