Экстракция внеклеточной ДНК образцов стекловидного тела и водянистой влаги для диагностики и мониторинга витреоретинальной лимфомы

Резюме

Здесь налажена процедура извлечения внеклеточной ДНК из стекловидного тела и водянистой влаги для проведения молекулярных исследований для диагностики витреоретинальной лимфомы. Метод позволяет одновременно извлекать ДНК из клеточного компонента образца или резервировать ее для вспомогательного тестирования.

Аннотация

Витреоретинальная лимфома (VRL) представляет собой агрессивную лимфому, часто классифицируемую как первичная диффузная В-крупноклеточная лимфома центральной нервной системы. Для диагностики VRL собираются такие образцы, как стекловидное тело и, в последнее время, водянистая влага. Диагностическое тестирование этих образцов на VRL включает цитологию, проточную цитометрию и молекулярное тестирование. Тем не менее, как цитопатология, так и проточная цитометрия, наряду с молекулярным тестированием с использованием клеточной ДНК, требуют неповрежденных цельных клеток. Проблема заключается в том, что стекловидное тело и водянистая влага, как правило, имеют низкую клеточность, и многие клетки разрушаются во время сбора, хранения и обработки. Кроме того, эти образцы представляют дополнительные трудности для молекулярного тестирования из-за высокой вязкости стекловидного тела и малого объема как стекловидного, так и водянистого влаги. В данном исследовании предложен метод извлечения внеклеточной ДНК из стекловидных и водных образцов. Этот подход дополняет выделение клеточной ДНК или позволяет использовать клеточный компонент этих образцов для других методов диагностики, включая цитологию и проточную цитометрию.

Введение

Витреоретинальная лимфома (VRL) – агрессивная лимфома, ассоциированная с первичной диффузной В-крупноклеточной лимфомой ^1,2,3 в центральной нервной системе. VRL обычно приводит к летальному исходу из-за поражения центральной нервной системы ^1,2. Несмотря на редкость^1,4, VRL часто проявляется симптомами, сходными с задним увеитом и другими витреоретинальными заболеваниями ^4,5. Следовательно, пациентам с....

протокол

Настоящий протокол соответствует руководящим принципам по уходу за людьми и одобрен институциональным наблюдательным советом (IRB) Мичиганского университета. На это было получено разрешение IRB об отказе от информированного согласия. Не существует соответствующих критериев включения или исключения пациентов, участвующих в исследовании.

1. Разделение клеточных и бесклеточных компонентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для диагностического исследования VRL можно получить три типа образцов: стекловидное тело (неразбавленное; жидкость от витрэктомии, собранная до начала инфузии), разбавленное стекловидное тело в кассетном....

Результаты

Эти методы экстракции были выполнены в ограниченном числе случаев для обеспечения адекватного выхода и амплифицируемости внеклеточной ДНК по сравнению с клеточной ДНК из стекловидного (четыре) и водного (четыре) образцов. Из этих образцов выход ДНК из бесклеточного компонента этих жи?.......

Обсуждение

Витреоретинальная лимфома (VRL) представляет собой агрессивную крупноклеточную В-клеточную лимфому ^1,2,3, симптомы которой могут имитировать другие витреоретинальные заболевания ^4,5. Молекулярное тестиров.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010