Estrazione di DNA senza cellule di campioni di vitreo e umor acqueo per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma vitreoretinico

Riepilogo

Qui viene stabilita una procedura per estrarre il DNA privo di cellule dall'umor vitreo e acqueo per eseguire studi molecolari per la diagnosi di linfoma vitreoretinico. Il metodo offre la possibilità di estrarre contemporaneamente il DNA dalla componente cellulare del campione o di riservarlo per test ausiliari.

Abstract

Il linfoma vitreoretinico (VRL) rappresenta un linfoma aggressivo, spesso classificato come linfoma primario diffuso a grandi cellule B del sistema nervoso centrale. Per diagnosticare il VRL, vengono raccolti campioni come l'umor vitreo e, più recentemente, l'umor acqueo. I test diagnostici per VRL su questi campioni includono citologia, citometria a flusso e test molecolari. Tuttavia, sia la citopatologia che la citometria a flusso, insieme ai test molecolari che utilizzano il DNA cellulare, richiedono cellule intere intatte. La sfida risiede nel fatto che l'umor vitreo e acqueo hanno in genere una bassa cellularità e molte cellule vengono distrutte durante la raccolta, la conservazione e l'elaborazione. Inoltre, questi campioni pongono ulteriori difficoltà per i test molecolari a causa dell'elevata viscosità dell'umor vitreo e del basso volume sia dell'umor vitreo che dell'umor acqueo. Questo studio propone un metodo per estrarre DNA privo di cellule da campioni vitrei e acquosi. Questo approccio integra l'estrazione del DNA cellulare o consente di utilizzare la componente cellulare di questi campioni per altri metodi diagnostici, tra cui la citologia e la citometria a flusso.

Introduzione

Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo associato al linfoma primario a grandi cellule B diffuso del sistema nervoso centrale ^1,2,3. Il VRL è tipicamente fatale a causa del suo coinvolgimento nel sistema nervoso centrale ^1,2. Sebbene rara^1,4, la VRL si presenta spesso con sintomi simili all'uveite posteriore e ad altre malattie vitreoretiniche ^4,5. Di conseguenza, i pazienti che present....

Protocollo

Il presente protocollo segue le linee guida per l'assistenza umana e con l'approvazione del comitato di revisione istituzionale (IRB) dell'Università del Michigan. Per questo è stata ottenuta una rinuncia al consenso informato da parte dell'IRB. Non ci sono criteri di inclusione o esclusione rilevanti per i pazienti coinvolti.

1. Separazione dei componenti cellulari e cell-free

NOTA: Per il test diagnostico VRL è possibile ricevere tre tipi di campioni: vitreo (non diluito; liquido da vitrectomia raccolto prima dell'inizio dell'infusione), vitreo diluito all'interno di una sacca a cassetta (

Discussione

Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo a grandi cellule B ^1,2,3 i cui sintomi possono imitare altre malattie vitreoretiniche ^4,5. I test molecolari dell'umor vitreo e, più recentemente, dell'umor acqueo sono diventati un metodo fondamentale per fare la diagnosi di VRL o escluderlo. Tuttavia, questi fluidi hanno un volume molto basso e spesso hanno una .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010