유리체 망막 림프종의 진단 및 모니터링을 위한 유리체 및 수성 체액 검체의 Cell-Free DNA 추출

요약

유리체 및 수액에서 cell-free DNA를 추출하여 유리체 망막 림프종 진단을 위한 분자 연구를 수행하는 절차가 여기에 확립되어 있습니다. 이 방법은 샘플의 세포 구성 요소에서 DNA를 동시에 추출하거나 보조 테스트를 위해 비축할 수 있는 기능을 제공합니다.

초록

유리체 망막 림프종(VRL)은 종종 원발성 중추신경계 미만성 거대 B세포 림프종으로 분류되는 공격성 림프종을 나타냅니다. VRL을 진단하기 위해 유리체액과 최근에는 수액과 같은 표본을 수집합니다. 이러한 검체에 대한 VRL 진단 테스트에는 세포학, 유세포 분석 및 분자 테스트가 포함됩니다. 그러나 세포 병리학 및 유세포 분석은 세포 DNA를 사용한 분자 검사와 함께 온전한 전체 세포를 필요로 합니다. 문제는 유리체와 수액이 일반적으로 세포성이 낮고 많은 세포가 수집, 저장 및 처리 중에 파괴된다는 사실에 있습니다. 더욱이, 이러한 시편은 유리체액의 높은 점도와 유리체 및 수액의 부피가 적기 때문에 분자 테스트에 추가적인 어려움을 초래합니다. 본 연구는 유리체 및 수성 검체에서 cell-free DNA를 추출하는 방법을 제안한다. 이 접근법은 세포 DNA 추출을 보완하거나 이러한 검체의 세포 구성 요소를 세포학 및 유세포 분석을 포함한 다른 진단 방법에 활용할 수 있도록 합니다.

서문

유리체 망막 림프종(VRL)은 원발성 중추신경계 미만성 거대 B세포 림프종 ^1,2,3과 관련된 공격적인 림프종입니다. VRL은 일반적으로 중추 신경계에 관여하기 때문에 치명적이다 ^1,2. ^드물기는 하지만1,4, VRL은 종종 후포도막염 및 기타 유리체 망막 질환과 유사한 증상을 나타낸다 ^4,5. 따라서 포도막염 증상을 보이는 환자는 VRL을 확인하거나 배제하기 위한 진단이 필요합니다.

최근에는 VRL 진단에 대한 합의된 기준이 발표되었는데, 여기에는 임상 검사와 실험실 결과의 조합이 포함된다⁶. VRL을 진단하는 데 일반적으로 사용되는 검체에는 유리체액(vitreous humor)이 있으며, 최근에는 수액(aqueous hu....

프로토콜

본 프로토콜은 휴먼 케어 가이드라인을 따르며 미시간 대학교 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. IRB로부터 이에 대한 사전 동의를 받았습니다. 관련된 환자에 대한 관련 포함 또는 제외 기준은 없습니다.

1. 세포 성분과 cell-free 성분의 분리

참고: VRL 진단 테스트를 위해 유리체(희석되지 않은, 주입을 시작하기 전에 채취한 유리체 절제술의 액체), 카세트 백 내의 희석된 유리체(그림 1) 및 수액(눈의 전방에서 나온 액체)의 세 가지 유형의 샘플을 받을 수 있습니다.

1. 점성이 매우 높은 희석되지 않은 유리액의 경우 피펫팅을 용이하게 하기 위해 3-5mL PBS로 희석하십시오.
2. 카세트 백(보충 그림 1) 내에 희석된 유리체의 경우 50mL 코니컬 튜브(유체 45mL당 1개)로 유체를 배출합니다.
3. 수액은 부피가 매우 적습니다(<200μL). 세포의 최대 회수율을 보장하기 위해 샘플을 1.5mL 튜브로 옮기고 샘플이 수집된 원래 500μL 미세 원심분리 튜브를 동일한 부피의 PBS로....

토론

유리체 망막 림프종(VRL)은 공격적인 거대 B 세포 림프종(^large B-cell lymphoma)^1,2,3으로, 증상은 다른 유리체 망막 질환과 유사할 수 있다 ^4,5. 유리체의 분자 검사, 그리고 최근에는 수액의 분자 검사가 VRL의 진단을 내리거나 배제하는 중요한 방법이 되었습니다. 그러나 이러한 유체는 부피.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010