Vitreoretinal Lenfoma Tanı ve İzlemi için Vitreus ve Sulu Mizah Örneklerinin Hücresiz DNA Ekstraksiyonu

Özet

Vitreoretinal lenfoma teşhisi için moleküler çalışmalar yapmak üzere vitreus ve sulu mizahtan hücresiz DNA ekstrakte etmek için bir prosedür burada oluşturulmuştur. Yöntem, numunenin hücresel bileşeninden DNA'yı eşzamanlı olarak çıkarma veya yardımcı test için ayırma yeteneği sunar.

Özet

Vitreoretinal lenfoma (VRL), sıklıkla primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma olarak sınıflandırılan agresif bir lenfomayı temsil eder. VRL'yi teşhis etmek için vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah gibi örnekler toplanır. Bu örneklerde VRL için tanı testleri sitoloji, akış sitometrisi ve moleküler testleri içerir. Bununla birlikte, hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, hücresel DNA kullanılarak yapılan moleküler testlerle birlikte, sağlam bütün hücreler gerektirir. Buradaki zorluk, camsı ve sulu mizahın tipik olarak düşük hücreselliğe sahip olması ve toplama, depolama ve işleme sırasında birçok hücrenin tahrip olması gerçeğinde yatmaktadır. Ayrıca, bu numuneler, vitreus mizahının yüksek viskozitesi ve hem vitreus hem de sulu mizahın düşük hacmi nedeniyle moleküler testler için ek zorluklar ortaya çıkarmaktadır. Bu çalışma, camsı ve sulu örneklerden hücresiz DNA'nın ekstraksiyonu için bir yöntem önermektedir. Bu yaklaşım, hücresel DNA'nın ekstraksiyonunu tamamlar veya bu örneklerin hücresel bileşeninin sitoloji ve akış sitometrisi dahil olmak üzere diğer tanı yöntemleri için kullanılmasına izin verir.

Giriş

Vitreoretinal lenfoma (VRL), primer santral sinir sistemi diffüz büyük B hücreli lenfoma ^1,2,3 ile ilişkili agresif bir lenfomadır. VRL, merkezi sinir sistemine^katılımı nedeniyle tipik olarak ölümcüldür ^1,2. Nadir görülmekle^{birlikte 1,4}, VRL sıklıkla posterior üveit ve diğer vitreoretinal hastalıklara benzer semptomlarla kendini gösterir ^4,5. Sonuç olarak, üveit semptomları sergileyen hastalar, VRL'yi doğrulamak veya ekarte etmek için bir tanıya ihtiyaç duyarlar.

Son zamanlarda, klinik muayene ve laboratuvar bulgularının bir kombinasyonunu içeren VRL tanısı için konsensüs kriterleri yayınlanmıştır⁶. VRL'yi teşhis etmek için yaygın olarak kullanılan örnekler arasında vitreus mizahı ve daha yakın zamanda sulu mizah⁷ bulunur. Vitreus mizahı, pars plana vitrektomi adı verilen ve gözün arka segmentine erişim sağlayan cerrahi bir prosedürle elde edilir⁸.

Sunulan protokolde, hücresel ve cfDNA ekstraksiyonu için hem sulu mizah hem de vitreus mizah örnekleri toplandı. Hastalar uyuşturulduktan ve kornea limbusundan yaklaşık 4 mm uzağa trokarlar yerleştirildikten sonra, kornea limpusuna 1 mL tüberkülin şırıngası kullanılarak yaklaşık 100-200 μL'lik sulu mizah örneği elde edildi. Psödofakik hastalar için, infüzyona steril hava verilerek seyreltilmemiş vitreus elde edildi ve daha fazla miktarda seyreltilmemiş vitreus (3.5 mL'ye kadar) toplandı. Fakik hastalarda, dengeli tuz çözeltisi infüzyonu açılmadan önce yaklaşık 500 ila 1000 μL seyreltilmemiş vitreus çıkarıldı. Bazı durumlarda, infüzyonu sıvıya çevirerek ve bu numuneyi elde etmek için vitrektörü vitreus eteğine yerleştirerek ikincil olarak seyreltilmiş vitreus (500 ila 2.000 μL) toplandı. En seyrek vitreus fraksiyonu ameliyat sonunda kaset torbası korunarak toplandı (Ek Şekil 1). Bu torba patoloji bölümüne ulaştığında, daha sonra DNA ekstraksiyonu için bu torbadan sıvının konik tüplere boşaltılmasından seyreltik vitreus elde edildi.

Vitreus sıvısının sitopatolojisi genellikle altın standart olarak kabul edilir⁹. Bununla birlikte, birkaç çalışma, işleme ve minimum hücresellik nedeniyle sınırlı hassasiyet göstermiştir^10,11,12. Akış sitometrisi, klonal B hücrelerinin tanımlanmasına yardımcı olabilir, ancak aynı zamanda düşük hücresellik ve büyük lenfoma hücrelerinin kırılganlığı ile de sınırlandırılabilir^13,14,15. Hem sitopatoloji hem de akış sitometrisi, sağlam tüm hücreler gerektirir. Bu hücrelerin çoğu toplama, depolama ve işleme sırasında yok edilir. Moleküler test, bozulmamış hücrelerden (hücresel DNA) ekstrakte edilen DNA kullanılarak yapıldığında, aynı sınırlamadan muzdariptir. Ek olarak, tüm bu testler için sınırlı vitreus örneğinin bölünmesi, her test için mevcut malzeme miktarını azaltır.

Hücresiz DNA (cfDNA), bozulmamış hücrelere ihtiyaç duymayan başka bir DNA kaynağını temsil eder. Vitreus örneklerinden alınan cfDNA, VRL ^16,17 ve uveal melanom ^18'in tespiti için kullanılmıştır. Bu protokolde, VRL'yi tespit etmek için vitröz ve sulu sıvıdan hücresel ve hücresiz DNA ekstrakte edilir.

Protokol

Mevcut protokol, insan bakımı yönergelerini ve Michigan Üniversitesi kurumsal inceleme kurulunun (IRB) onayını takip eder. Bunun için IRB'den bilgilendirilmiş onam feragatnamesi alındı. İlgili hastalar için ilgili dahil etme veya dışlama kriterleri yoktur.

1. Hücresel ve hücresiz bileşenlerin ayrılması

NOT: VRL tanı testi için üç tip numune alınabilir: vitreus (seyreltilmemiş; infüzyona başlamadan önce toplanan vitrektomi sıvısı), bir kaset torbası içinde seyreltilmiş vitreus (Şekil 1) ve sulu hümör (gözün ön odasından sıvı).

1. Çok viskoz olan seyreltilmemiş vitreus sıvısı için, pipetlemeyi kolaylaştırmak için 3-5 mL PBS ile seyreltin.
2. Kaset torbası içindeki seyreltik vitreus için (Ek Şekil 1), sıvıyı 50 mL konik tüplere boşaltın (her 45 mL sıvı için bir tane).
3. Sulu mizah hacmi çok düşüktür (<200 μL). Hücrelerin maksimum geri kazanımını sağlamak için, numuneyi 1.5 mL'lik bir tüpe aktarın, numunenin toplandığı orijinal 500 μL mikrosantrifüj tüpünü eşit hacimde PBS ile durulayın ve 1.5 mL'lik tüpe ekleyin.
4. Camsı veya sulu sıvıyı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
5. Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın.

2. Hücresel bileşenden DNA ekstraksiyonu

1. Uygun miktarda hücre lizis çözeltisi ekleyin (küçük pelet için 300 μL, daha büyük pelet için 1 mL veya daha fazla) (bkz. Yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın.
2. Tamamen parçalandığında, protein çökelti çözeltisinin toplam hacminin 1/3'ünü ekleyin (300 μL lizat için 100 μL) (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. 20-30 saniye boyunca kuvvetlice girdap yapın. Oda sıcaklığında 3.000 x g'da 3 dakika döndürün.
4. 300 μL izopropanolü temiz bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Süpernatanı önceki adımdan izopropanol tüpüne dikkatlice pipetleyin.
5. 1.5 μL 20 mg / mL glikojen ekleyin (300 μL lizis için) (Malzeme Tablosuna bakınız).
6. Ters çevirerek iyice karıştırın, ardından DNA çökelmesine yardımcı olmak için numuneyi 1 saat ila gece boyunca -20 ° C'lik bir dondurucuya koyun.
7. 1.5 mL'lik tüpü oda sıcaklığında 3.000 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. İzopropanolü pipetleyin.
8. 0,5 mL %70 etanol ekleyin ve peleti yıkamak için tüpü ters çevirin.
9. Oda sıcaklığında 3.000 x g'da 1 dakika döndürün ve etanolü boşaltın. Etanol yıkamayı bir kez tekrarlayın.
10. Çözeltiyi boşaltmak ve peleti veya dekantı kurutmak için tüpü temiz gazlı bez üzerinde ters çevirin. DNA'yı bir mikrosantrifüjde hızlı bir şekilde döndürün ve kalan etanol damlasını ince uçlu tek kullanımlık bir pipet ucuyla pipetleyin (tüpte artık etanol kalmadığında, DNA 5-10 dakika içinde kuru ve hidratlanmaya hazır olmalıdır).
11. Kurutulmuş DNA peletine 45 μL DNA hidrasyon çözeltisi (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
12. Tüpü 50 °C'de bir ısıtma bloğuna yerleştirin ve 1-2 saat çözünmesine izin verin. Hidrasyon sürecini hızlandırmak için DNA'yı yukarı ve aşağı pipetleyin.
    NOT: Örnek çok viskoz görünüyorsa daha fazla DNA hidrasyon solüsyonu ekleyin.

3. Hücresiz DNA ekstraksiyonu

1. Adım 1.5'teki süpernatan miktarı değişkendir. Süpernatantın her mililitresi için 70 μL şartlandırma tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin.
2. Temizleme boncuklarını girdap yaparak iyice karıştırın. <14 mL hücresiz süpernatan işleniyorsa 10 μL, 14-40 mL işleniyorsa 20 μL temizleme boncukları ekleyin.
3. Numune/boncuk karışımını girdaplayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 3.000 x g'da santrifüjleyin.
4. Peleti bozmadan, 10 μL temizleme boncuğu kullanılıyorsa 100 μL ve 20 μL temizleme boncuğu kullanılıyorsa 200 μL geride bırakarak süpernatanı pipetleyin.
5. Peletlere eşit hacimde İdrar Pelet Sindirim tamponu (Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin ve peleti girdap veya pipetleme yoluyla iyice yeniden süspanse edin.
6. Yeniden süspanse edilmiş pelete Proteinaz K (%5 (h/h)) ekleyin (örneğin, 200 μL karışıma 10 μL Proteinaz K ekleyin) ve hafifçe girdaplama ile iyice karıştırın.
7. Pelet karışımını 55 °C'de 30 dakika inkübe edin.
8. Sindirim karışımına bir hacim Genomik lizis tamponu (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (örneğin, 210 μL Genomik lizis tamponu ila 210 μL sindirim karışımı) ve vorteksleme ile karıştırın.
9. Piyasada bulunan sıkma kolonunu (Malzeme Tablosuna bakın) yeni bir toplama tüpüne aktarın.
10. Döndürme kolonuna 200 μL İdrar DNA Hazırlama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
11. Kolona 700 μL İdrar DNA yıkama tamponu ekleyin, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin ve akışı atın.
12. Adımı 200 μL İdrar DNA yıkama tamponu ile tekrarlayın.
13. Spin kolonunu DNase / RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
14. Uygun hacimde DNA elüsyon tamponunu (yapılacak moleküler testlere göre) doğrudan kolon matrisine ekleyin ve oda sıcaklığında 3-5 dakika bekletin.
    NOT: Örnek durumlarda 30 μL elüsyon tamponu kullanılmıştır. Ek test gerekiyorsa daha fazla elüsyon tamponu kullanılır.
15. Hücresiz DNA'yı elde etmek için oda sıcaklığında 1 dakika boyunca ≥16.000 x g'da santrifüjleyin.

Sonuçlar

Bu ekstraksiyon yöntemleri, vitröz (dört) ve sulu (dört) örneklerden elde edilen hücresel DNA ile karşılaştırıldığında hücresiz DNA'nın yeterli verimini ve amplifiye edilebilirliğini sağlamak için sınırlı sayıda vaka üzerinde gerçekleştirildi. Bu örneklerden, bu sıvıların hücresiz bileşeninden elde edilen DNA verimleri, hücresel bileşeninkine benzer (Tablo 1). Bu örneklerden elde edilen hücresel ve cfDNA, VRL ile ilişkili mutasyon MYD88 L265P gibi moleküler ...

Tartışmalar

Vitreoretinal lenfoma (VRL), semptomları diğer vitreoretinal hastalıkları taklit edebilen agresif büyük bir B hücreli lenfomadır^{1,2,3 4,5}. Vitreusun ve daha yakın zamanda aköz mizahın moleküler testi, VRL tanısı koymak veya ekarte etmek için kritik bir yöntem haline gelmiştir. Bununla birlikte, bu sıvılar hacim olarak çok düşüktür ve genellikle d...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010