Extracción de ADN libre de células de muestras de humor vítreo y acuoso para el diagnóstico y seguimiento del linfoma vitreorretiniano

Resumen

Aquí se establece un procedimiento para extraer ADN libre de células del humor vítreo y acuoso para realizar estudios moleculares para el diagnóstico del linfoma vitreorretiniano. El método ofrece la capacidad de extraer simultáneamente ADN del componente celular de la muestra o reservarlo para pruebas auxiliares.

Resumen

El linfoma vitreorretiniano (VRL, por sus siglas en inglés) representa un linfoma agresivo, que a menudo se clasifica como linfoma primario difuso de células B grandes del sistema nervioso central. Para diagnosticar el VRL, se recogen especímenes como el humor vítreo y, más recientemente, el humor acuoso. Las pruebas diagnósticas para VRL en estos especímenes incluyen citología, citometría de flujo y pruebas moleculares. Sin embargo, tanto la citopatología como la citometría de flujo, junto con las pruebas moleculares con ADN celular, requieren células enteras intactas. El desafío radica en el hecho de que el humor vítreo y acuoso suelen tener una baja celularidad, y muchas células se destruyen durante la recolección, el almacenamiento y el procesamiento. Además, estos especímenes plantean dificultades adicionales para las pruebas moleculares debido a la alta viscosidad del humor vítreo y al bajo volumen del humor vítreo y acuoso. Este estudio propone un método para extraer ADN libre de células de muestras vítreas y acuosas. Este enfoque complementa la extracción de ADN celular o permite que el componente celular de estas muestras se utilice para otros métodos de diagnóstico, como la citología y la citometría de flujo.

Introducción

El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo asociado al linfoma primario de células B grandes difusa del sistema nervioso central ^1,2,3. La VRL suele ser mortal debido a su implicación en el sistema nervioso central ^1,2. Aunque es poco frecuente^1,4, la VRL a menudo se presenta con síntomas similares a la uveítis posterior y otras enfermedades vitreorretinianas ^4,5. En consecuencia, los pac....

Protocolo

El presente protocolo sigue las pautas de cuidado humano y con la aprobación de la junta de revisión institucional (IRB) de la Universidad de Michigan. Para ello, se obtuvo una renuncia al consentimiento informado del IRB. No existen criterios de inclusión o exclusión relevantes para los pacientes involucrados.

1. Separación de componentes celulares y libres de células

NOTA: Se pueden recibir tres tipos de muestras para las pruebas diagnósticas de VRL: vítreo (sin diluir; líquido de la vitrectomía recolectado antes de comenzar la infusión), vítreo diluido dentro de una bolsa de casete (

Discusión

El linfoma vitreorretiniano (VRL) es un linfoma agresivo de células B grandes ^1,2,3 cuyos síntomas pueden parecerse a los de otras enfermedades vitreorretinianas ^4,5. Las pruebas moleculares del humor vítreo y, más recientemente, acuoso se han convertido en un método crítico para hacer el diagnóstico de VRL o descartarlo. Sin embargo, estos fluidos son de muy bajo.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditioning buffer; also includes clearing beads, Proteinase K and spin columns
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010