In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

توفر هذه الدراسة بيانات تجريبية لعلاج اعتلال الكلية بالغلوبولين المناعي A (IgAN) باستخدام Dioscin (DIO) ، المكون النشط ل Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) ، ونموذجا لدراسة تأثيرات الأدوية العشبية والآليات الأساسية في الجسم الحي وفي المختبر.

Abstract

تحدث الزيادة في IgA1 (Gd-IgA1) الذي يعاني من نقص الجالاكتوز المنتشر بسبب التنشيط المفرط للخلايا الإفرازية الإيجابية IgA في عملية الاستجابات المناعية المخاطية ، وهو رابط مهم في التسبب في اعتلال الكلية IgA (IgAN). رقعة باير، المكان البارز الذي تتحول فيه الخلايا الليمفاوية البائية إلى خلايا بلازمية تفرز IgA، هي المصدر الرئيسي للغلوبولين المناعي A. بالإضافة إلى ذلك ، يرتبط التعبير السفلي للنواة 1β-1،3-galactosyltransferase (C1GalT1) ومرافقه الجزيئي ، المرافق الجزيئي الخاص ب C1GalT1 (Cosmc) ، بالجليكوزيل غير الطبيعي ل IgA1 في مرضى IgAN. تظهر تجربتنا السريرية أن الأدوية العشبية Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) يمكن أن تخفف من البيلة البروتينية والبيلة الدموية وتحسن وظائف الكلى لدى مرضى IgAN. Dioscin (DIO) هو أحد المكونات النشطة الرئيسية ل DNR ، والتي لديها أنشطة دوائية مختلفة. تستكشف هذه الدراسة آلية DIO المحتملة في علاج IgAN.تم إنشاء فأر نموذج IgAN عن طريق الحث المناعي المخاطي. تم تقسيم الفئران إلى مجموعات التحكم والنموذج و DIO. تم الكشف عن ترسب IgA الكبيبي في الفئران ، والتغيرات المرضية الكلوية ، وعلامات الخلايا البائية CD20 و CXCR5 التعبير في رقعة باير عن طريق التألق المناعي والكيمياء المناعية. بعد تحفيز عديد السكاريد الشحمي (LPS) ، تمت دراسة تأثيرات DIO على تكاثر خلايا DAKIKI ، وإفراز IgA و Gd-IgA1 ، و C1GalT1 ، وتعبير Cosmc بواسطة اختبار مجموعة عد الخلايا -8 (CCK-8) ، واختبار مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) ، وتفاعل البوليميراز الكمي المتسلسل في الوقت الفعلي (QRT-PCR) ، والنشاف الغربي (WB). في الدراسات في الجسم الحي ، تم تخفيف ترسب IgA المصحوب بتضخم كبيبي متوسط اللون وزيادة التعبير عن CD20 و CXCR5 في رقعة باير في ماوس نموذج IgAN بواسطة DIO. أظهرت الدراسات في المختبر أن 0.25 ميكروغرام / مل إلى 1.0 ميكروغرام / مل DIO يثبط تكاثر خلايا DAKIKI الناجم عن LPS ، وإفراز IgA و Gd-IgA1 ، وينظم تعبير mRNA والبروتين ل C1GalT1 و Cosmc. توضح هذه الدراسة أن DIO قد يقلل من إنتاج Gd-IgA1 عن طريق تثبيط التنشيط المفرط للخلايا المفرزة ل IgA وتنظيم تعبير C1GALT1 / Cosmc.

Introduction

اعتلال الكلية IgA (IgAN) هو النوع الأكثر شيوعا من التهاب كبيبات الكلى الأولي ، والذي لا يوجد علاج محدد له ، ولا يزال سببا مهما لمرض الكلى في المرحلة النهائية1. على الرغم من أن التسبب في IgAN لا يزال غير مفهوم تماما ، إلا أن "فرضية الضربات المتعددة" مقبولة بشكل عام وتدعمها مجموعة كبيرة من الأدلة البحثية السريرية والتجريبية2. يتضمن التسبب في IgAN تنشيط الخلايا البائية وإنتاج IgA1 (Gd-IgA1) الذي يعاني من نقص الجالاكتوز 3. الزيادة في تعميم Gd-IgA1 بسبب الانتشار المفرط وتنشيط الخلايا التي تفرز IgA أثناء الاستجابة المناعية المخاطية هي رابط حاسم في التسبب في IgAN4،5،6. باعتبارها المكان المركزي لتكاثر وتفعيل تحويل النمط الظاهري للخلايا اللمفاوية B إلى خلايا إفراز IgA ، فإن رقعة باير هي المصدر الرئيسي لإفراز IgA ، وترتبط ارتباطا وثيقا بحدوث وتطور IgAN 7,8. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط تكاثر الخلايا المفرزة ل IgA1 ، وكذلك التعبير عن Core 1β-1،3-galactosyltransferase (C1GalT1) و C1GalT1 المرافقة الجزيئية الخاصة (Cosmc) ، بالجليكوزيل غير الطبيعي ل IgA1 ، والذي يسبب إنتاج GD-IgA1 في مرضى IgAN 6,9.

تقدمت الدراسة السريرية على علاج IgAN بالأدوية العشبية في السنوات الأخيرة. Yiqi Qingjie Formula هي صيغة أساسية لعلاج IgAN من قبل قسم أمراض الكلى في مستشفى Guang'anmen. وجدت الدراسة السابقة لمجموعتنا أن Gd-IgA1 انخفض في مصل مرضى IgAN بعد العلاج بصيغة Yiqi Qingjie. باعتبارها واحدة من أكثر الأعشاب استخداما في صيغة Yiqi Qingjie ، فإن Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) هي جذمور مجفف من Dioscorea Nipponica Makino ، والذي له وظائف مختلفة مثل تنظيم المناعة ، وقمع الالتهاب ، وتخفيف السعال والربو10,11. عالج العديد من العلماء IgAN مع DNR وحققوا نتائج جيدة12،13،14. باعتباره العنصر النشط الرئيسي في DNR15 ، يقلل Dioscin (DIO) من حمض اليوريك ، ويمنع التليف ، ويمنع الاستجابة الالتهابية ، والإجهاد المضاد للأكسدة16,17. لذلك ، قد يكون لدى DIO آلية عمل جديدة لمنع الإفراز الخلوي ل Gd-IgA1 المفرط وممارسة تأثيرات محددة لحماية الكلى. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن أي دراسة حول آلية عمل DIO لعلاج IgAN.

لاستكشاف الآلية العلاجية المحتملة ل DIO على IgAN وتوفير طريقة جديدة لعلاج IgAN ، أجرينا تجارب للتأثيرات العلاجية ل DIO على IgAN في الجسم الحي وفي المختبر.

Protocol

وافقت لجنة الأخلاقيات في مستشفى جوانجانمن على هذه التجربة (رقم الموافقة الأخلاقية للتجربة على: IACUC-GAMH-2023-003).

1. تحضير الفئران للإجراء التجريبي

  1. قم بتربية 22 من ذكور الفئران Balb / c من فئة SPF (6-7 أسابيع ، وزن الجسم 20-25 جم) في منشأة في المستشفى / مركز الأبحاث. قسم إلى مجموعات تحكم (n = 8) ونموذج (n = 14) باستخدام طريقة جدول الأرقام العشوائية.
  2. بعد أسبوع واحد من التربية التكيفية في قفص المختبر ، قم بتغذية المجموعة النموذجية (مجموعة IgAN) بمحلول جلوبيولين غاما البقري (BGG) بنسبة 0.1٪ في ماء محمض يحتوي على 6 مليمول / لتر حمض الهيدروكلوريك لمدة 9 أسابيع وفقا لبروتوكول النمذجة الخاص ب Zou et al.18.
  3. حقن 0.1 مل من محلول BGG 0.1٪ في محلول ملحي في الوريد الخلفي لمدة 3 أيام متتالية مع الاستمرار في شرب محلول BGG لإعداد نموذج الماوس التجريبي IgAN18.
  4. دع المجموعة الضابطة تشرب بحرية 6 مليمول / لتر من الماء المحمض الهيدروكلوريك بدون BGG لمدة 9 أسابيع. حقن الحجم المقابل من المياه المالحة في الوريد الذيل لمدة 3 أيام متتالية.
    ملاحظة: تم تغذية مجموعات التحكم والنموذج بنفس جودة التغذية العادية.
  5. بعد حقن الوريد الذيلي ، حدد 2 من الفئران في المجموعة الضابطة و 2 من الفئران في مجموعة النموذج بشكل عشوائي وفحصها عن طريق البيلة البروتينية والمجهر الضوئي والتألق المناعي لتحديد ما إذا كانت النمذجة ناجحة.
    ملاحظة: لا يتم تقديم أي طعام للحيوانات ، لكنها ليست ممنوعة من الماء ؛ سجل إخراج البول.
  6. جمع البول لمدة 24 ساعة عن طريق أقفاص التمثيل الغذائي والطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق ؛ تجاهل رواسب البول. بعد تخفيف 10 أضعاف من المادة الطافية ، قم بقياس تركيز البيلة البروتينية باستخدام مجموعة فحص بروتين البول ثم اضربها في عامل التخفيف وحجم البول للحصول على 24 ساعة من إجمالي بروتين البول.
    ملاحظة: يتم عرض طرق الفحص المجهري والتألق المناعي في القسمين 3 و 4 على التوالي.
  7. بعد إعداد النموذج بنجاح ، قسم 12 فأرا في مجموعة النموذج إلى 6 فئران ، كل منها في مجموعة النموذج (مجموعة IgAN) ومجموعة DIO gavage (مجموعة DIO) ، وفقا لطريقة جدول الأرقام العشوائية.
  8. دع المجموعة الضابطة تستمر في شرب 6 مليمول / لتر ماء محمض الهيدروكلوريك بدون BGG ، ويتكون محلول BGG من مجموعة النماذج 0.1٪ من ماء محمض يحتوي على 6 مليمول / لتر حمض الهيدروكلوريك. احسب جرعة إعطاء مجموعة DIO وفقا لصيغة تحويل الجرعة للمنهجية التجريبية الدوائية (المحولة وفقا لكتلة جسم الإنسان البالغة 70 كجم)19. أقراص Gavage DIO 0.06 جم / كجم مرة واحدة يوميا لمدة 8 أسابيع.
  9. بعد 8 أسابيع من التزويج ، قم بتخدير الفئران داخل الصفاق باستخدام 0.4٪ من صوديوم بنتوباربيتال (60 مجم / كجم) ، وبعد التأكد من التخدير المناسب عن طريق قرصة إصبع القدم ، قم بعزل الكلى ورقعة باير للفحص المجهري الضوئي اللاحق وتحليلات الكيمياء المناعية.
    ملاحظة: مخطط النموذج في الجسم الحي موجود في الشكل التكميلي 1.

2. التحليل النسيجي

  1. أقسام البارافين للكلى ورقعة باير
    1. إصلاح أنسجة الكلى بسمك 3 مم أو 1 رقعة باير مع 4٪ بارافورمالدهيد لمدة 24 ساعة ، يجفف بالإيثانول المتدرج والزيلين. اغمس في الشمع لمدة 2 ساعة ، ثم أغلقه وتجميده.
    2. قطع أقسام الكلى بسمك 2 ميكرومتر وأقسام رقعة باير بسمك 4 ميكرومتر ونشرها في ماء دافئ. اغرف الشرائح غير المطوية بشريحة زجاجية نظيفة واخبزها في فرن بدرجة حرارة ثابتة على حرارة 40 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. ابدأ التلوين بعد المعالجة المسبقة للعينة.
      ملاحظة: خذ السطح الإكليلي للجزء النقيري من الكلى ، بسمك 3 مم كتلة الأنسجة.
  2. قم بإزالة الشمع وبقع أقسام البارافين في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 10 دقائق بمحلول حمض دوري ، مع تجنب الضوء. شطف بالماء المقطر وامسح الجافة الملطخة بمحلول تلطيخ شيف لمدة 20-30 دقيقة ، وتجنب الضوء. شطف بالماء المقطر حتى تصبح الأقسام حمراء تحت المجهر.
  3. ضع الأقسام في محلول تلطيخ الهيماتوكسيلين ، نوى البقع لمدة 3 دقائق (يمكن تقسيم النوى الملطخة بعمق شديد بواسطة هيدروكلوريد الإيثانول) ، واشطفها بالماء الجاري حتى تصبح الشرائح عديمة اللون.
  4. قم بإجراء الجفاف الروتيني بتركيزات متدرجة من الإيثانول والزيلين ، وأغلق الأقسام بصمغ محايد ، وراقبها تحت المجهر. إيجابية PAS حمراء ، والنواة زرقاء.

3. التحليل الكيميائي المناعي لرقعة باير

  1. قم بإعداد أقسام البارافين من رقعة باير كما هو موضح في الخطوة 2.1.
    ملاحظة: سمك أقسام الكيمياء المناعية والتألق المناعي اللاحق هو 4 ميكرومتر.
  2. إزالة الشمع من أقسام البارافين:
    1. ضع المقاطع في الزيلين I لمدة 5 دقائق ، والزيلين II لمدة 5 دقائق ، والزيلين الثالث لمدة 5 دقائق.
    2. علاوة على ذلك ، شطف الشرائح في الإيثانول اللامائي I لمدة 5 دقائق ، والإيثانول اللامائي II لمدة 5 دقائق ، والكحول بنسبة 85٪ لمدة 5 دقائق ، والكحول بنسبة 75٪ لمدة 5 دقائق. ثم شطف الشرائح في الماء المقطر.
  3. استرجاع المستضد
    1. تحضير محلول مخزون 50x من سترات الصوديوم وتخفيفه بالماء المقطر إلى 1x للاستخدام. تسخينه في الأوتوكلاف لمدة 2 دقيقة ، ثم ضع شرائح في الأوتوكلاف ، والتأكد من أن مستوى السائل يتجاوز مستوى الشرائح.
    2. سخنيها على درجة حرارة عالية لمدة 5 دقائق ، ثم اترك الشرائح لتبرد بشكل طبيعي. اغسل الشرائح ثلاث مرات بمحلول PBS لمدة 5 دقائق لكل منها.
  4. حجب البيروكسيديز الداخلي: ضع علامة على حدود الأنسجة في دائرة باستخدام قلم كيميائي مناعي. احتضن الأقسام في محلول بيروكسيد الهيدروجين 3٪ لمدة 15 دقيقة في RT ، محمية من الضوء ، واغسل الأقسام ثلاث مرات بمحلول PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة.
  5. حجب المصل: قم بسد الأقسام عن طريق إسقاط 10٪ من مصل الماعز على أقسام الأنسجة المحددة لمدة 30 دقيقة في RT. تأكد من تغطية الأقسام بالتساوي مع البقعة.
  6. حضانة الأجسام المضادة الأولية: تخلص برفق من محلول الحجب وأضف نسبة من الجسم المضاد الأولي المحضر (CD20 [1: 800] ؛ CXCR5 [1:800]) إلى القسم. ضع القسم بشكل مسطح في صندوق مبلل واحتضانه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: أضف كمية صغيرة من الماء إلى الصندوق المبلل لمنع تبخر الجسم المضاد.
  7. حضانة الأجسام المضادة الثانوية: اغسل الأقسام ثلاث مرات بمحلول PBS لمدة 5 دقائق في كل مرة. قم بإزالة PBS عن طريق هز الأقسام الجافة ، وقم بتغطية الأنسجة بقطرة من الأجسام المضادة الثانوية (HRP-label) للأنواع ذات الصلة من الجسم المضاد الأساسي ، واحتضانها في RT لمدة 50 دقيقة.
  8. تجانس 3،3'-ديامينوبنزيدين (DAB): اغسل الأقسام بمحلول PBS ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل منها. بعد هز الأقسام الجافة ، قم بإسقاط محلول DAB كروموجينيك المحضر حديثا على الأقسام. مراقبة وقت تطوير اللون تحت المجهر ؛ الإيجابي هو الأصفر البني. شطف بماء الصنبور لإنهاء تطور اللون.
  9. نوى تلطيخ: أعد صبغها بالهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، واغسلها بماء الصنبور ، ثم اشطفها لمدة 10 دقائق بماء الصنبور للعودة إلى اللون الأزرق.
  10. الجفاف والختم:
    1. ضع الأقسام في 75٪ كحول لمدة 5 دقائق و 85٪ كحول لمدة 5 دقائق. ضع الأقسام في الإيثانول اللامائي I لمدة 5 دقائق ، والإيثانول اللامائي II لمدة 5 دقائق ، والإيثانول اللامائي III لمدة 5 دقائق.
    2. اغسل الأقسام في الزيلين الأول لمدة 5 دقائق ، ثم أخرجها حتى تجف قليلا وأغلق الأقسام بصمغ محايد.
  11. الحصول على الصور: جمع الصور عن طريق الفحص المجهري وتحليلها بواسطة برنامج هالة لتحليل الصور البانورامية للأنسجة.
    ملاحظة: النوى الملطخة بالهيماتوكسيلين زرقاء ، ويلاحظ التعبير الإيجابي DAB باللون الأصفر البني.

4. التألق المناعي الكلوي IgA

  1. تحضير أقسام البارافين للكلى كما هو موضح في الخطوة 2.1.
  2. أقسام إزالة الشمع من البارافين:
    1. ضع المقاطع في الزيلين I لمدة 5 دقائق ، والزيلين II لمدة 5 دقائق ، والزيلين الثالث لمدة 5 دقائق. عالج الأقسام في الإيثانول اللامائي الأول ، والإيثانول اللامائي الثاني ، والإيثانول 95٪ ، والإيثانول 90٪ ، والإيثانول 80٪ ، والإيثانول 70٪ ، والإيثانول 50٪ ، كل منها لمدة 5 دقائق ، واغسلها بالماء المقطر.
  3. استرجاع Proteinase K: هز الأقسام الجافة وارسم دائرة حول قسم الأنسجة بقلم نسيجي كيميائي. أضف محلول عمل البروتيناز K (نسبة 1: 9 من محلول المخزون و PBS) بالتنقيط لتغطية الأنسجة واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منها.
  4. اختراق غشاء الخلية: رج الأجزاء حتى تجف قليلا ثم قم بتغطيتها بنسبة 0.1٪ Triton. احتضان لمدة 20 دقيقة في RT ، وغسل الأقسام ثلاث مرات مع PBS لمدة 5 دقائق لكل منهما.
  5. الحجب: أضف 10٪ مصل الماعز بالتنقيط لتغطية الأنسجة بالتساوي للحجب في RT لمدة 30 دقيقة.
  6. حضانة الأجسام المضادة الأولية: أضف كمية مناسبة من الجسم المضاد للفأر AF488-conjugate IgA (1: 500) بالتنقيط لتغطية الأنسجة بشكل موحد واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
  7. نوى تلطيخ: اغسل الشرائح ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لكل منها. بعد إزالة PBS ، أضف بقعة 4 ′ ، 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) بالتنقيط على الأقسام واحتضانها لمدة 15 دقيقة في RT ، محمية من الضوء.
  8. اغسل الأقسام وأغلقها: اغسل الأقسام ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق ، ثم أغلقها بوسط تثبيت مضاد للتلاشي.
  9. الفحص المجهري والتصوير الفوتوغرافي: راقب الأقسام الموجودة تحت مجهر الفلورسنت والتقط الصور.
    ملاحظة: بالنسبة ل DAPI ، فإن الإثارة فوق البنفسجية هي الطول الموجي 330-380 نانومتر ، والطول الموجي للانبعاث هو 420 نانومتر ، الضوء الأزرق. الطول الموجي لإثارة الفلوريسئين إيزوثيوسيانات (FITC) هو 465-495 نانومتر ، والطول الموجي للانبعاث هو 515-555 نانومتر ، الضوء الأخضر.

5. ثقافة الخلية

  1. الحصول على خط الخلايا الليمفاوية B البشرية DAKIKI من ATCC ، الولايات المتحدة الأمريكية. زراعة خلايا داكيكي في وسط RPMI-1640 تستكمل مع 10 ٪ FBS و 1 ٪ البنسلين الستربتومايسين.
  2. استزرع الخلايا في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ CO2 واستزراعها كل 2-3 أيام. استخدم الخلايا في مرحلة النمو اللوغاريتمي لجميع التجارب.
  3. عند التقاء 70٪ -80٪ ، اجمع الخلايا باستخدام ماصة معقمة وأجهزة طرد مركزي الخلايا عند 140 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية ، وأعد تعليقها باستخدام الوسط الخالي من المصل ، وبعد 24 ساعة ، اترك جميع الخلايا في فترة هادئة للعلاج اللاحق.

6. مقايسات السمية الخلوية LDH لفحص التركيزات الآمنة ل DIO على خلايا DAKIKI الطبيعية

  1. قم بزرع خلايا DAKIKI في 96 لوحة بئر بكثافة 4x105 خلايا / بئر وقم بإعداد مجموعة تحكم منخفضة ، ومجموعة تحكم عالية ، وتركيزات مختلفة من DIO (0.25 ، 0.5 ، 1.0 ، 2.0 ، 4.0 ، 8.0 ميكروغرام / مل). احتضان في حاضنة CO2 5٪ ، 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة بعد العلاج المقابل وفقا لطريقة التجميع.
  2. وفقا لتعليمات مجموعة الكشف عن السمية الخلوية ، أضف 5 ميكرولتر من المحللة لكل بئر في مجموعة التحكم العالية ، ثم ضع اللوحة في حاضنة CO5٪ 2 ، 37 °C لمدة 15 دقيقة.
  3. أخرج اللوحة ، وأضف 100 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى كل بئر ، واحتضانها في الظلام لمدة 10 دقائق في RT ، ثم أضف 50 ميكرولتر من محلول التفاعل التوقفي. قم بقياس قيمة OD عند 490 نانومتر على قارئ الصفائح الدقيقة في أسرع وقت ممكن.
  4. احسب معدل إطلاق LDH لتركيزات مختلفة من DIO و ≤10٪ كجرعة قصوى تدار وفقا للصيغة: معدل إطلاق LDH = (بئر تجريبي LDH - LDH منخفض التحكم) / (LDH عالي التحكم - LDH منخفض التحكم) × 100٪.

7. مقايسة CCK-8 للكشف عن تأثير DIO على تكاثر خلايا DAKIKI

  1. بناء على نتائج تجاربنا السابقة20 ، قم بإنشاء نموذج IgAN باستخدام LPS 40 ميكروغرام / مل لتحفيز خلايا DAKIKI.
  2. بعد ذلك ، قم بزرع 4x105 خلايا / بئر في 96 لوحة بئر وتقسيمها إلى مجموعات التحكم والنموذج ومجموعات DIO منخفضة ومتوسطة وعالية التركيز (0.25 ميكروغرام / مل ، 0.5 ميكروغرام / مل ، و 1.0 ميكروغرام / مل). احتضان اللوحات في حاضنة CO 2 بنسبة 5٪ ، 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  3. ثم أضف 20 ميكرولتر من كاشف CCK-8 إلى كل بئر وضع الألواح مرة أخرى في الحاضنة (5٪ CO2 ، 37 °C) لمدة 2 ساعة. بعد الحضانة ، اكتشف OD بطول موجة 450 نانومتر على قارئ الصفيحة الدقيقة في أسرع وقت ممكن.

8. ELISA للكشف عن تأثير DIO على إفراز IgA و Gd-IgA1 بواسطة خلايا DAKIKI

  1. قم بزرع خلايا DAKIKI في ألواح ذات 6 آبار بكثافة 6 × 106 خلايا / بئر ، وقم بتجميع الخلايا ومعالجتها وفقا للخطوة 7.2. استزراع الخلايا لمدة 24 ساعة ، ثم أجهزة الطرد المركزي عند 850 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على المادة الطافية.
  2. اكتشف تركيزات IgA و Gd-IgA1 وفقا لتعليمات المجموعة.

9.qRT-PCR للكشف عن تأثير DIO على مستويات C1GALT1 و Cosmc mRNA في خلايا DAKIKI

  1. قم بزرع خلايا DAKIKI بكثافة 6x106 خلايا / بئر في صفيحة ذات 6 آبار ، وقم بتجميع الخلايا ومعالجتها على أنها CCK8 المذكورة في الخطوة 7.2 ، واحتضانها لمدة 24 ساعة. استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من خلايا DAKIKI وفقا لتعليمات مجموعة استخراج الحمض النووي الريبي الإجمالية.
  2. بعد أخذ 1 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي المستخرج من كل مجموعة من العينات وقياس تركيزه ، قم بنسخ 1 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي من كل عينة إلى cDNA وفقا لتعليمات المجموعة.
  3. بعد ذلك ، قم بإجراء تضخيم RT-PCR للكشف عن تعبير كل جين (95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، و 95 درجة مئوية لمدة 10 ثوان ، و 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية). احسب مستوى التعبير لكل جين باستخدام طريقة 2-ΔΔCT مع β-actin كمرجع داخلي.
    ملاحظة: كانت تسلسلات التمهيدي كما يلي:
    C1GALT1: 5'-AAGGTTGACACCCCCTAA-3', 5'-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3';
    Cosmc: 5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTG-3', 5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3';
    β-أكتين: 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3', 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'.

10. النشاف الغربي لفحص تأثير DIO على التعبير عن بروتينات C1GALT1 و Cosmc في خلايا DAKIKI

  1. قم بزرع خلايا DAKIKI بكثافة 6x106 خلايا / بئر في لوحة 6 آبار. قم بتجميعها وعاملها كما هو مذكور في الخطوة 7.2. بعد 24 ساعة من الحضانة ، اجمع كل مجموعة من الخلايا.
  2. أضف كمية مناسبة من محلول تحلل الخلايا (PMSF: مثبط الفوسفاتاز: محلول تحلل RIPA = 1: 1: 100) واحتضانه على الثلج لمدة 30 دقيقة. ثم أجهزة الطرد المركزي عند 13500 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية وجمع المادة الطافية.
  3. حدد تركيز البروتين باستخدام مجموعة مقايسة تركيز البروتين BCA.
  4. امزج عينات البروتين مع مخزن مؤقت لتحميل 5x SDS-PAGE عند 4: 1 عن طريق الدوامة ، وقم بتسخين العينات المختلطة عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشويه البروتين.
  5. للكشف عن البروتينات ذات الأوزان الجزيئية المختلفة ، أضف علامة البروتين (5 ميكرولتر / بئر) وعينات (20 ميكروغرام / بئر) في ممرات مختلفة من هلام SDS-PAGE بنسبة 12٪ ، وقم بتشغيل الرحلان الكهربائي SDS-PAGE ، وانقل الجل إلى أغشية PVDF.
  6. سد الأغشية مع 5 ٪ حليب خالي الدسم لمدة 2 ساعة في RT واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية المقابلة (C1GALT1 [1: 1000] ، Cosmc [1: 2000]) لمدة 24 ساعة. استخدم β-actin antibody (1: 100000) كعنصر تحكم داخلي.
  7. اغسل غشاء فلوريد البولي فينيليدين (PVDF) بمحلول ملحي ثلاثي التخزين ، 0.1٪ Tween 20 منظف (TBST) ثلاث مرات (10 دقائق / وقت) ، ثم احتضانه بالجسم المضاد IgG الثانوي المضاد للأرانب (1: 10000) في RT لمدة 2 ساعة.
  8. اغسل الغشاء باستخدام TBST مرة أخرى (ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها) ، وعالجه بكمية مناسبة من محلول عمل التلألؤ الكيميائي المحسن (ECL) (وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) للكشف عن شريط البروتين.
  9. التقط الصور باستخدام نظام التصوير الكيميائي وقم بإجراء تحليل شبه كمي للقيم الرمادية للبروتينات باستخدام نظام تحليل الصور Image J.

11. التحليل الإحصائي

  1. استخدم تطبيقا برمجيا مناسبا لتحليل البيانات. التعبير عن جميع البيانات كوسيلة ± SD (الانحراف المعياري) وتقييم عينات متعددة عن طريق اختبار ANOVA أحادي الاتجاه للمقارنة بين المجموعات.
    ملاحظة: تم استخدام البرنامج الإحصائي SPSS 26.0 للتحليل الإحصائي. تم استخدام طريقة LSD للمقارنات ثنائية الاتجاه بين المجموعات عندما كانت الفروق متساوية ، وتم استخدام طريقة Dunnett T3 للمقارنات ثنائية الاتجاه بين المجموعات عندما كانت الفروق غير متساوية. واعتبر أن P<0.05 يشير إلى وجود فرق ذي دلالة إحصائية.

النتائج

تأثير DIO على أنسجة الكلى في نموذج الفئران IgAN

بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، كان لدى نموذج الفئران IgAN الناجم عن المناعة المخاطية (مجموعة النموذج) زيادة كبيرة في البيلة البروتينية (الشكل التكميلي 2) ، وكان ترسب IgA مرئيا في المنطقة المتوسطة ، وتم توزيع التألق بشكل موحد في مجموعات في جميع أنحاء المنطقة المتوسطة بأكملها (الشكل 1 أ) ، وأظهر تلطيخ PAS للأنسجة الكلوية تكاثر الخلايا المتوسطة وتضخم اللحمة (الشكل 1 ب)، والتي تم تخفيضها في مجموعة DIO gavage (مجموعة DIO).

تأثير DIO على الخلايا الليمفاوية B في رقعة باير

رقعة باير هي الموقع الرئيسي لتحويل الخلايا الليمفاوية البائية إلى خلايا تفرز IgA. أخذنا رقعة باير ككائن بحثي لمراقبة تأثير DIO على الخلايا الليمفاوية البائية من خلال الكشف عن تعبير علامات الخلايا البائية CD20 و CXCR5. أظهرت نتائج الكيمياء الهيستولوجية المناعية أن التعبير عن CD20 و CXCR5 كان أعلى بكثير في مجموعة النموذج مقارنة بالمجموعة الضابطة. يمكن أن يمنع DIO التعبير عن العلامات الجزيئية المذكورة أعلاه (الشكل 2A ، B).

نطاق التركيز الآمن ل DIO على خلايا DAKIKI

LDH هو علامة على سلامة غشاء البلازما ومؤشر على موت الخلايا ، مع ارتفاع معدلات إطلاق LDH مما يشير إلى تلف الخلايا الأكثر حدة. تم استخدام مقايسة إطلاق LDH لتحديد نطاق التركيز الآمن ل DIO. تم تحديد الحد الأقصى للتركيز الآمن ل DIO من خلال معدل إطلاق LDH أقل من 10٪. أظهرت النتائج (الشكل 3) عدم وجود سمية خلوية كبيرة ناتجة عن DIO بتركيزات من 0.25 إلى 1.0 ميكروغرام / مل. لذلك ، استخدمت الدراسة التالية 0.25 و 0.5 و 1.0 ميكروغرام / مل DIO كمستوى الجرعات.

آثار DIO على تكاثر خلايا داكيكي

أظهرت النتائج التجريبية (الشكل 4) أنه بالمقارنة مع مجموعة النموذج (المجموعة المحفزة LPS) ، قام DIO بتثبيط تكاثر خلايا DAKIKI التي يسببها LPS بطريقة تعتمد على التركيز. أدى DIO بتركيزات 0.5 و 1.0 ميكروغرام / مل إلى تثبيط تكاثر خلايا داكيكي التي يسببها LPS بشكل كبير (P < 0.01).

آثار DIO على الوظيفة الإفرازية لخلايا DAKIKI

ترتبط مستويات Gd-IgA1 ارتباطا وثيقا بالعملية المرضية ل IgAN، ويتم اختبار إجمالي IgA معا كمؤشر لوظيفة الإفراز الخلوي. تم استخدام اختبار ELISA للكشف عن محتوى IgA و Gd-IgA1 في المادة الطافية لمزرعة خلية DAKIKI. أظهرت النتائج (الشكل 5A ، B) أن خلايا DAKIKI التي حفزها LPS تفرز المزيد من IgA مقارنة بالمجموعة الضابطة (P < 0.01). وبالمقارنة ، قام DIO بتثبيط خلايا DAKIKI بشكل كبير من إفراز IgA (P < 0.01) بطريقة تعتمد على التركيز. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، فإن خلايا DAKIKI التي تم تحفيزها بواسطة LPS تفرز المزيد من Gd-IgA1 مع ميل إحصائي (P < 0.10) ، ويثبط DIO إفراز Gd-IgA1 من خلايا DAKIKI المحفزة ب LPS بطريقة تعتمد على التركيز (P < 0.05 و P < 0.01) ، من بينها DIO عند 1.0 ميكروغرام / مل يثبط بشكل كبير إفراز Gd-IgA1 بمعدل تثبيط 25٪.

آلية DIO تمنع إفراز Gd-IgA1 بواسطة خلايا DAKIKI

لمزيد من التحقيق في الآلية المحتملة لتثبيط DIO إفراز Gd-IgA1 المفرط بواسطة خلايا DAKIKI ، تم الكشف عن مستويات C1GALT1 الترانسفيراز الغليكوزيلاتي وبروتين chaperone Cosmc mRNA في خلايا DAKIKI بواسطة qRT-PCR ، وأظهرت النتائج (الشكل 6A ، B) أن تعبير mRNA النسبي ل C1GALT1 و Cosmc تم تنظيمه في خلايا DAKIKI في مجموعة النموذج مقارنة بمجموعة التحكم (P < 0.01). قام DIO بتنظيم تعبير mRNA النسبي ل C1GALT1 و Cosmc بدرجات مختلفة مقارنة بمجموعة النماذج ، حيث قام DIO 1.0 μg / mL بتنظيم تعبير mRNA النسبي ل C1GALT1 و Cosmc (P < 0.05).

في الوقت نفسه ، تم استخدام طريقة WB للكشف عن تأثير DIO على التعبير البروتيني ل C1GALT1 و Cosmc في خلايا DAKIKI. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، انخفض تعبير البروتين ل C1GALT1 و Cosmc في خلايا DAKIKI في المجموعة النموذجية بشكل واضح (P < 0.05). بالمقارنة مع مجموعة النماذج ، تم تنظيم التعبير البروتيني ل C1GALT1 و Cosmc بعد تدخل DIO. تم تنظيم التعبير البروتيني ل C1GALT1 و Cosmc بشكل كبير بواسطة DIO بتركيز 1.0 ميكروغرام / مل (P < 0.05) (الشكل 7A-C).

figure-results-5043
الشكل 1: التشريح المرضي للكلى. أ: مجهر التألق المناعي. تم تلطيخ أقسام الكلى من الفئران في كل مجموعة مع مكافحة IgA (الأخضر) و DAPI (الأزرق). شريط مقياس الصورة أعلاه = 200 ميكرومتر. شريط مقياس الصورة أدناه = 50 ميكرومتر. ن = 6 لكل مجموعة. (ب) صور تمثيلية لتلطيخ PAS لأنسجة الكلى من الفئران في مجموعات التحكم والنموذج و DIO. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. يوضح السهم المتجه لأسفل الخلايا الوسيطة، ويوضح السهم المتجه لأعلى الستروما. شريط المقياس = 30 ميكرومتر. ن = 6 لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5878
الشكل 2: تأثير DIO على علامات الخلايا الليمفاوية B. أ: التعبير عن CD20 في رقعة باير. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. ن = 6 لكل مجموعة. (ب) تعبير CXCR5 في رقعة باير. توجد أشرطة المقياس في الزاوية اليمنى السفلية من الصورة. شريط المقياس = 200 ميكرومتر. ن = 6 لكل مجموعة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6506
الشكل 3. فحص التركيز الآمن ل DIO على خلايا DAKIKI. يتم التعبير عن القيم الإحصائية كمتوسط ± SD من ثلاث تجارب مستقلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6951
الشكل 4. تركيزات مختلفة من DIO تؤثر على تكاثر خلايا DAKIKI. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ±SD. مقارنة مع المجموعة الضابطة ، ** P < 0.01 ؛ مقارنة بمجموعة النماذج ، #P < 0.05' ##P < 0.01 ؛ تكررت نتائج جميع التجارب ثلاث مرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7552
الشكل 5. يمنع DIO إفراز IgA و Gd-IgA1 بواسطة خلايا DAKIKI. (أ) اكتشفت طريقة ELISA تعبير IgA في كل مجموعة. (ب) اكتشفت طريقة ELISA تعبير Gd-IgA1 في كل مجموعة. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD. مقارنة مع المجموعة الضابطة ، ** P < 0.01 ؛ مقارنة بمجموعة النماذج ، #P < 0.05 ، ##P < 0.01 ؛ تم تكرار جميع النتائج التجريبية ثلاث مرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-8293
الشكل 6. تمنع آلية DIO إفراز Gd-IgA1 المفرط بواسطة خلايا DAKIKI. (A) اكتشف QRT-PCR تعبير mRNA ل C1GALT1. (B) اكتشف QRT-PCR تعبير mRNA ل Cosmc. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD. مقارنة بالمجموعة الضابطة ، ** P<0.01 ؛ مقارنة بمجموعة النماذج ، #P < 0.05 ، ##P < 0.01 ؛ تم تكرار جميع النتائج التجريبية ثلاث مرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-9016
الشكل 7. يؤثر DIO على تعبير البروتين في C1GALT1 و Cosmc في خلايا DAKIKI. (أ) تحقق البنك الدولي من التنظيم الأعلى لتعبير البروتين في C1GALT1 و Cosmc بواسطة DIO. (ب) أجري تحليل شبه كمي لتعبير C1GALT1 باستخدام الصورة J. (ج) التحليل شبه الكمي لتعبير Cosmc باستخدام الصورة J. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ±SD. مقارنة مع المجموعة الضابطة ، * P < 0.05 ؛ بالمقارنة مع مجموعة النماذج ، #P < 0.05 ، ##P < 0.01 ، تم تكرار جميع النتائج التجريبية ثلاث مرات. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل التكميلي 1. مخطط النموذج في الجسم الحي. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الرقم.

الشكل التكميلي 2. التغييرات في بروتينية. تم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD. ن = 6 لكل مجموعة. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الرقم.

Discussion

السمة المرضية المميزة ل IgAN هي ترسب المجمعات المناعية المحتوية على IgA1 و GD-IgA1 في المنطقة المتوسطة من الكبيبة21,22. الحد من تكوين المجمعات المناعية يمكن أن يقلل من إصابة الكلى ويخفف من الأعراض السريرية ل IgAN. في تجربة في الجسم الحي ، درسنا الآثار العلاجية ل DIO على IgAN، ووجدنا أن DIO يمكن أن يقلل من ترسب IgA في كلية الفئران النموذجية IgAN. ثبت أن تراكم الخلايا التي تفرز IgA في الكلى يرتبط بالتسبب في IgAN23. كموقع مهم لتكاثر وتنشيط الخلايا الليمفاوية B ، تعد رقعة باير مصدرا مهما للخلايا التي تفرز IgA ، لذلك قمنا بفحص التعبير عن علامات الخلايا الليمفاوية B (CD20 ، CXCR5) في رقعة باير ووجدنا أن DIO يمكن أن يمنع التعبير عن الخلايا الليمفاوية B في رقعة باير لنموذج الفئران IgAN. يمكن أن توفر هذه النتائج التجريبية أساسا لتطبيق DIO في علاج IgAN.

أجرينا التجارب التالية في المختبر لمزيد من التحقيق في آلية عمل DIO على IgAN. أولا ، لقد ثبت سابقا أن DAKIKI ، وهو خط خلايا بائية مخلد EBV يفرز IgA1 ، جزء منه هو GD-IgA124 ، مثالي للبحث في المختبر عن آلية عمل الدواء على IgAN. اخترنا خلايا DAKIKI للتحقيق في الآلية الجزيئية ل DIO في علاج IgAN. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب الاستجابة المناعية الالتهابية المخاطية دورا أساسيا في التسبب في IgAN. كما ذكرنا أعلاه ، نستخدم LPS لتحفيز خلايا DAKIKI ، والتي يمكن أن تطلق عوامل مؤيدة للالتهابات وتتوسط الاستجابات الالتهابية ، والتي يمكن أن تحاكي بشكل أفضل آلية الاستجابات المناعية المخاطية في IgAN. قد يساعد النموذج الخلوي في المختبر في التحقيق في إمكانية وآلية الأدوية الأخرى لعلاج IgAN. أظهرت النتائج أن DIO يثبط تكاثر خلايا DAKIKI التي يحفزها LPS بطريقة تعتمد على التركيز. يمكن أن يمنع DIO إفراز IgA و Gd-IgA1 في خلايا DAKIKI الناتجة عن تحفيز LPS وتنظيم التعبير عن mRNA وبروتين C1GalT1 ومرافقه Cosmc في خلايا DAKIKI ، مما يشير إلى أن DIO يمكن أن يقلل من إفراز Gd-IgA1 عن طريق تنظيم تعبير C1GALT1 / Cosmc وبالتالي يمنع التنشيط المفرط لخلايا DAKIKI.

يجب ملاحظة الخطوات الرئيسية أثناء الإجراءات التجريبية. تركيز Gd-IgA1 في طافية خلية DAKIKI ليس ضمن نطاق الكشف عن مجموعة ELISA (1.56 ~ 100 نانوغرام / مل) ، ويجب طرد المادة الطافية المجمعة بواسطة أنبوب ترشيح فائق للحصول على Gd-IgA1 المركز. تأكد أيضا من أن حجم المادة الطافية التي تبدأ من كل مجموعة هو نفسه وأن الحجم النهائي للتركيز الذي تم الحصول عليه بعد الترشيح الفائق هو نفسه.

في هذه الدراسة ، استخدمنا طرقا في المختبر وفي الجسم الحي في وقت واحد ، والتي يمكن أن تدعم بعضها البعض في التأثيرات الدوائية وتقدم مثالا لدراسة تأثيرات وآلياتها في طب الأعشاب. يمكن تحسين بعض الأشياء في هذا البروتوكول. أولا ، لم نكتشف تركيزات الدم في مجموعة DIO gavage للفئران. لذلك ، لا يتم استخدام تركيز DIO المكافئ لتركيزات الدم في التجارب المختبرية . ثانيا ، تم التحقيق فقط في مونومر DIO ، المكون النشط ل DNR ؛ لا تزال تأثيرات المكونات الأخرى ل DNR على IgAN بحاجة إلى مزيد من الدراسة.

في الختام ، توفر هذه الدراسة أساسا تجريبيا لعلاج IgAN باستخدام DIO ، المكون النشط ل DNR. أنشأت هذه الدراسة نموذجا مرضيا خلويا ل IgAN من خلال محاكاة الاستجابة المناعية المخاطية ل IgAN في المختبر وفي الجسم الحي. يعطي فكرة جديدة لدراسة الطب الصيني التقليدي لمنع وعلاج IgAN.

Disclosures

ويعلن صاحبا البلاغ أنه ليس لهما مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (81973675).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-CD20/MS4A1 AntibodyBoster Biotechnology CompanyA03780-3
Antifade mounting mediumBeyotime, Shanghai, ChinaP0128S
Balb/c miceBeijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.110322220101424000
blocking serumSolarbio, Beijing, ChinaSL038
Bovine gamma globulinShangHai YuanYe Biotechnology CompanyS12031
C1GALT1 polyclonal antibodyProteintech Group, Inc,USA27569-1-AP
Citrate antigen retrieval solution(50×)Phygene Biotechnology CompanyPH0422
COSMC polyclonal antibodyProteintech Group, Inc,USA19254-1-AP
Cytotoxiciy detection kitRoche Company4744926001
Dako REAL EnVision detection system, Peroxidase/DAB+DakoK5007
DAPIInvitrogenD1306
DioscinNational Institute For Food and Drug Control111707-201703
DIO tabletsChengdu No 1 Pharmaceutical Co. Ltd.H51023866
ECL working solutionMerck Biotechnology, IncWBKLS0100 
Enhanced cell counting kit-8Beyotime, Shanghai, ChinaC0043
Fasking one-step removal of gene cDNA first-strand synthesis premixTIANGEN,Beijing, ChinaKR118-02
Glycogen Periodic acid Schiff (PAS) stain kit BaSO Biotechnology CompanyBA4080A
Goat anti-mouse IgA-AF488SouthernBiotech1040-30
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L), HRP conjugatedBeiJing Bioss Biotechnology CompanyBS-0295G-HRP
Human Gd-IgA1 ELISA kitIBL27600
Human IgA ELISA kitMultiSciences (LiankeBio)70-EK174-96
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23227
PMSF solutionBeyotime, Shanghai, ChinaST507
Proteinase K Phygene Biotechnology CompanyPH1521
Rabbit anti-CXCR5 polyclonal antibody BeiJing Bioss Biotechnology Companybs-23570R
RIPA lysis bufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013B
RNAsimple total RNA extraction kitTIANGEN,Beijing, ChinaDP419
RPMI Medium 1640Solarbio, Beijing, China31800
Super-Bradford protein assay kitCWBIO, Beijing, ChinaCW0013
Triton X-100Beyotime, Shanghai, ChinaST795
β-Actin Rabbit mAbAbclonal, Wuhan, ChinaAC026

References

  1. Knoppova, B., et al. The origin and activities of IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy. Frontiers in Immunology. 7, 117 (2016).
  2. Suzuki, H., et al. The pathophysiology of IgA nephropathy. Journal of The American Society of Nephrology. 22 (10), 1795-1803 (2011).
  3. He, L., et al. Synthetic double-stranded RNA poly(I:C) aggravates IgA nephropathy by triggering IgA class switching recombination through the TLR3-BAFF axis. American Journal of Nephrology. 42 (3), 185-197 (2015).
  4. Zhao, N., et al. The level of galactose-deficient IgA1 in the sera of patients with IgA nephropathy is associated with disease progression. Kidney International. 82 (7), 790-796 (2012).
  5. Xing, Y., et al. C1GALT1 expression is associated with galactosylation of IgA1 in peripheral B lymphocyte in immunoglobulin a nephropathy. BMC Nephrology. 21 (1), 18 (2020).
  6. Qin, W., et al. External suppression causes the low expression of the Cosmc gene in IgA nephropathy. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (5), 1608-1614 (2008).
  7. Sakai, F., et al. Lactobacillus gasseri SBT2055 induces TGF-β expression in dendritic cells and activates TLR2 signal to produce IgA in the small intestine. PLoS One. 9 (8), 105370 (2014).
  8. Gutzeit, C., Magri, G., Cerutti, A. Intestinal IgA production and its role in host-microbe interaction. Immunological Reviews. 260 (1), 76-85 (2014).
  9. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  10. Lu, F., et al. Therapeutic effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae on gouty arthritis based on the SDF-1/CXCR 4 and p38 MAPK pathway: an in vivo and in vitro study. Phytotherapy research: PTR. 28 (2), 280-288 (2014).
  11. Wang, W., Xu, L., Zhou, L., Wan, S., Jiang, L. A Network pharmacology approach to reveal the underlying mechanisms of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae in the treatment of asthma. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2022, 4749613 (2022).
  12. Tian, W. W., Wei, Y. Professor TONG Xiaolin used the experience of Dioscoreae Nipponicae. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (05), 589-592 (2020).
  13. Rao, X. R., Bai, Y. W. Das Xiwen's experience in treating IgA nephropathy. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. 9, 691-693 (2008).
  14. Si, Y., Zhang, Y. A data mining study on the pattern of medication use in the treatment of IgA nephropathy by Professor Zhang Yu. Journal of Chinese Physician. 20 (01), 109-111 (2018).
  15. Jiang, H., et al. Optimization of the enzymatic extraction technology of Diosgenin from Dioscorea nipponica. Chinese Traditional Patent Medicine. 39 (03), 621-624 (2017).
  16. Qi, M., et al. Dioscin alleviates lipopolysaccharide-induced inflammatory kidney injury via the microRNA let-7i/TLR4/MyD88 signaling pathway. Pharmacological Research. 111, 509-522 (2016).
  17. Yang, L., et al. Recent advances in the pharmacological activities of Dioscin. BioMed Research International. 2019, 5763602 (2019).
  18. Nal Zou, J., et al. Toll-like receptor 4 signaling pathway in the protective effect of Pioglitazone on experimental immunoglobulin A nephropathy. Chinese Medical Journal. 130 (8), 906-913 (2017).
  19. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experiments methodology. Chinese Pharmacological Bulletin. 1, 19 (1992).
  20. Shen, J. C., Ren, Y., Rao, X. R., You, Y., Li, S. Network pharmacology, molecular docking, and in vitro experiments to explore the molecular mechanism of Dioscorea Nipponica Makion in the treatment of IgA nephropathy. World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 16 (12), 2246-2254 (2021).
  21. Mestecky, J., et al. IgA nephropathy: molecular mechanisms of the disease. Annual Review of Pathology. 8, 217-240 (2013).
  22. Novak, J., et al. IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells. Kidney International. 67 (2), 504-513 (2005).
  23. Nihei, Y., et al. Identification of IgA autoantibodies targeting mesangial cells redefines the pathogenesis of IgA nephropathy. Science Advances. 9 (12), (2023).
  24. Raska, M., et al. Identification and characterization of CMP-NeuAc: GalNAc-IgA1 alpha2,6-sialyltransferase in IgA1-producing cells. Journal of Molecular Biology. 369 (1), 69-78 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

IgA Dioscin Gd IgA1 C1GalT1 Cosmc IgA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved