JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الأنسجة الدهنية هي مصدر ممتاز للخلايا الجذعية الوسيطة. هنا ، نقدم عملية استخراج وزراعة وتوصيف الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) خطوة بخطوة من الأنسجة الدهنية للبربخ في الفئران السويسرية.

Abstract

تمت دراسة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على نطاق واسع كنهج علاجي جديد ، وذلك أساسا لوقف الالتهاب المتفاقم بسبب قدرتها على تعديل الاستجابة المناعية. MSCs هي خلايا ذات امتيازات مناعية قادرة على البقاء على قيد الحياة في متلقي الزرع الخيفي غير المتوافق مناعيا بناء على التعبير المنخفض عن جزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) وفي استخدام العلاج القائم على الخلايا للزراعة الخيفية. يمكن عزل هذه الخلايا من عدة أنسجة ، وأكثرها استخداما هو نخاع العظم والأنسجة الدهنية. نحن نقدم بروتوكولا سهلا لعزل وزراعة وتوصيف MSCs من الأنسجة الدهنية للبربخ للفئران. يتم استئصال الأنسجة الدهنية البربخية جراحيا ، وتجزئتها جسديا ، وهضمها بمحلول كولاجيناز من النوع الثاني بنسبة 0.15٪. بعد ذلك ، يتم استزراع الخلايا الجذعية الأولية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) وتوسيعها في المختبر ، ويتم إجراء توصيف النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما نقدم الخطوات اللازمة للتمييز بين كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) إلى خلايا عظمية المنشأ، وخلايا دهنية، وخلايا غضروفية المنشأ، متبوعة بالتوصيف الوظيفي لكل سلالة خلية. يمكن استخدام البروتوكول المقدم هنا للتجارب في الجسم الحي وخارج الجسم الحي ، وكبديل ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون لتوليد خلايا خالدة تشبه MSCs.

Introduction

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي خلايا بالغة متعددة الإمكانات تتمايز إلى خلايا مثل بانيات العظم والأرومة الغضروفية والخلايا الشحمية 1,2. توجد هذه الخلايا في العديد من الأعضاء ، ولهذا السبب ، يمكن استخراجها من الأنسجة البالغة مثل نخاع العظام والعضلات والدهون وبصيلات الشعر وجذر الأسنان والمشيمة والأدمة و perichondrium والحبل السريوالرئة والكبد والطحال 3,4.

تم الإبلاغ عن آثار MSCs على علم وظائف الأعضاء والجهاز المناعي 5,6. كانت هذه الخلايا واعدة لعلاج العديد من الأمراض ، سواء في الطب البشري أو البيطري. يمكن ل MSCs التحكم في الالتهاب وتعزيز تكوين الأوعية الدموية وتوازن الأنسجة من خلال آليات مختلفة ، مثل ملامسة الخلايا الخلوية ، والعوامل القابلة للذوبان ، والحويصلات الصغيرة خارج الخلية7،8،9،10. علاوة على ذلك ، فإن MSCs هي خلايا ذات امتيازات مناعية قادرة على البقاء على قيد الحياة في متلقي الزرع الخيفي غير المتوافق مناعيا لأن هذه الخلايا تظهر تعبيرا منخفضا عن جزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) وتستخدم في العلاج القائم على الخلايا للزراعة الخيفية11,12. إن الاستمناع المنخفض جنبا إلى جنب مع إمكانات التجدد يجعل MSCs مرشحين مثاليين للعلاج بالخلايا ، مثل مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GvHD) 13 ، الذئبة الحمامية الجهازية (SLE) 14 ، والتصلب المتعدد15 ، من بين أمور أخرى16,17.

على الرغم من حقيقة أن MSCs موجودة في العديد من الأنسجة البالغة ، فإن الأنسجة الدهنية توفر مزايا على المصادر الأخرى ، مثل إمكانية الوصول للحصاد ، مع الحد الأدنى من التدخل الجراحي. عدد كبير من الخلايا المتاحة مع معدل توسع مرتفع ؛ وتوسيع سهل في المختبر باستخدام بروتوكول سهل الأداء دون الحاجة إلى معدات محددة ومواد منخفضة التكلفة18،19،20. بمجرد استخراجها ، يجب تمييز الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) على النحو الذي حددته الجمعية الدولية للعلاج الخلوي (ISCT)21. وبالتالي ، يجب أن تظهر MSCs مورفولوجيا تشبه الخلايا الليفية ، والالتزام بالثقافة البلاستيكية ، معبرة عن نسبة عالية (≥95٪) من علامات اللحمة المتوسطة مثل endoglin (CD105) ، ecto-5'-nucleotidase (CD73) و Thy-1 (CD90) ، ونسبة منخفضة (≤2٪) من علامات المكونة للدم مثل مستضد الكريات البيض المشترك (CD45) ، البروتين الفوسفوغليكولي عبر الغشاء (CD34) ، البروتين السكري الغشائي المرتبط بالجليكوليبيد (CD14) ، إنتغرين ألفا M (CD11b) ، سلسلة ألفا المرتبطة بالبروتين المرتبط بمستقبلات مستضد الخلايا البائية (CD79α) أو مستضد سطح الخلايا اللمفاوية B B4 (CD19) ومستضد الكريات البيض البشرية من الفئة الثانية (HLA-II). علاوة على ذلك ، يلزم توصيف وظيفي ، ويجب أن تكون الخلايا قادرة على التمايز إلى خلايا بانيات عظمية أو أرومة غضروفية أو خلايا أرومة دهنية21.

هنا ، نوضح كيفية الحصول على MSCs من الأنسجة الدهنية البربخية باستخدام التفكك الميكانيكي والهضم الأنزيمي للدراسات في المختبر والتوصيف المورفولوجي الذي تم تحديده مسبقا بواسطة ISCT.

Protocol

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية لأخلاقيات وتمت الموافقة عليها من قبل اللجان المؤسسية للرعاية والاستخدام من جامعة ولاية سانتا كروز بموجب البروتوكول رقم 021/22. تم الحصول على ذكور الفئران السويسرية (6-8 أسابيع) من مختبر تربية وصيانتها وتجريبها - مرفق البحوث الحيوانية بجامعة ولاية سانتا كروز (LaBIO-UESC) ، والتي يتم الحفاظ عليها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، وتتلقى الماء والغذاء حسب الطلب مع دورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة.

ملاحظة: يمكن استخدام سلالة الفئران الأخرى ؛ نوصي باستخدام الفئران البالغة (6-8 أسابيع) لأنها تحتوي على أنسجة وخلايا دهنية أكثر تطورا ذات نشاط تكاثري عالي.

1. التحضير

ملاحظة: قبل المتابعة ، قم بإعداد الكواشف التالية الموضحة أدناه. انظر جدول المواد للحصول على معلومات حول الكاشف ومورد المواد. يجب ارتداء معدات الحماية الشخصية مثل الأقنعة والقبعات ومعاطف المختبر والقفازات في جميع الإجراءات العملية.

  1. استخراج الأنسجة الدهنية البربخ
    1. احتفظ بمواد الجراحة: ثلاث مجموعات من الملقط والمقصات المعقمة ، وخمس إبر ، وكأس يحتوي على 200 مل من الإيثانول بنسبة 70٪.
    2. تحضير مخدر نهائي ، وخلط الكيتامين (100 ملغ / كغ) والزيلازين (10 ملغ / كغ).
  2. ثقافة ADSCs
    1. الوسط القاعدي: تحضير وسائط الجلوكوز عالية الجلوكوز المعدلة (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) ، 50 ميكروغرام / مل جنتاميسين ، 0.25 ميكروغرام / مل أمفوتريسين ب ، 100 وحدة / مل بنسلين ، و 100 مجم / مل ستربتومايسين.
    2. محلول الهضم: تحضير 0.15٪ من كولاجيناز النوع الثاني في PBS معقم في مرشح 0.25 ميكرومتر.
      ملاحظة: ليس من الضروري استخدام المضادات الحيوية الأربعة الموصوفة في الوسط القاعدي. سيعتمد ذلك على ظروف زراعة الخلايا في المختبر حيث يتم تنفيذ ذلك.
  3. توصيف النمط الظاهري ل ADSCs
    1. تحضير 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) في برنامج تلفزيوني.
    2. تمييع الأجسام المضادة للفأر كما هو مذكور في الجدول 1.
    3. إعداد 2 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
  4. التمايز العظمي ل ADSCs
    1. وسط التمايز العظمي: تحضير DMEM المكمل بحمض الأسكوربيك 5.67 M ، 10 نانومتر ديكساميثازون ، 0.02 M β-glycerophosphate ، 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. بالنسبة لتلطيخ Von Kossa ، قم بإعداد المحاليل التالية: 70٪ إيثانول في الماء ، 5٪ نترات فضة في الماء ، ماء مقطر ، 5٪ ثيوسلفات الصوديوم في الماء ، و 1٪ يوزين ب في الماء.
  5. التمايز الأديبوجيني:
    1. وسط التمايز الأديبوجيني: تحضير DMEM المكمل ب 0.5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthine ، 200 μM إندوميتاسين ، 1 ميكرومتر ديكساميثازون ، 10 ميكرومتر أنسولين ، 10٪ FBS ، و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. بالنسبة للتلطيخ بالزيت الأحمر ، قم بإعداد المحاليل التالية: 10٪ فورمالين في ماء منزوع الأيونات ، 60٪ إيزوبروبانول في ماء منزوع الأيونات ، ليزوكروم (صبغة قابلة للذوبان في الدهون) صبغة ديازو (محلول Oil-Red O) في 60٪ إيزوبروبانول ، و 1٪ هيماتوكسيلين في ماء منزوع الأيونات.
  6. التمايز الغضروفي:
    1. وسط التمايز الغضروفي: تحضير وسط غضروفي مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ بنسلين / ستربتومايسين.
    2. تحضير 10 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
    3. بالنسبة لتلطيخ البروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان ، قم بإعداد الحلول التالية: صبغة Heteroglycan (Alcian Blue 1٪) في حمض الأسيتيك ، درجة الحموضة 2.5 ، البارافين ، الهيماتوكسيلين ، تخفيف سلسلة الإيثانول في الماء (100٪ ، 96٪ ، 80٪ ، و 70٪).

الأجسام المضادة / الفلوروفورالتخفيفاستنساخالتركيز النهائي (ميكروغرام / مل)الوظيفة والخلية التي يتم التعبير عنها
CD34- PE1:100رام342عامل التصاق الخلية. الخلايا الجذعية المكونة للدم.
CD45- APC1:10030-F112المساعدة في تفعيل الكريات البيض. أعرب في الكريات البيض.
CD71- FITC1:100ج25يتحكم في امتصاص الحديد أثناء تكاثر الخلايا. الخلايا المتكاثرة والخلايا الشبكية وخلايا السلائف.
CD29- FITC1:100ها2/55الالتصاق والتنشيط ، التطور الجنيني ، الكريات البيض ، الخلايا المتغصنة ، الصفائح الدموية ، الخلايا البدينة ، الخلايا الليفية ، والخلايا البطانية.
CD90- بيرCP1:100الثور-72الإشارات والالتصاق. الخلايا الليمفاوية التائية ، NK ، وحيدات ، الخلايا الجذعية المكونة للدم ، الخلايا العصبية ، والخلايا الليفية.

الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة في توصيف النمط الظاهري ل ADSCs بواسطة مقياس التدفق الخلوي. قائمة الأجسام المضادة مع الفلوروكرومات الخاصة بها ، والتخفيفات ، والاستنساخ ، والتركيز النهائي وكذلك وظيفتها في الخلية التي يتم التعبير عنها.

2. الأساليب

ملاحظة: يتم توزيع الأنسجة الدهنية في جميع أنحاء الجسم في مواقع تحت الجلد أو داخل البطن. في الفئران ، تشمل الأنسجة الدهنية الأكثر شيوعا المستخدمة في التجارب البربخ تحت الجلد ، والمساريق ، وخلف الصفاق22. هنا ، يتم عرض خطوات الحصول على الأنسجة الدهنية البربخ (الشكل 1).

figure-protocol-5587
الشكل 1: تصميم تجريبي للحصول على الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية من الفئران السويسرية. (أ) باستخدام الإبر ، ضع على لوح الفلين أو الستايروفوم ؛ (ب) رفع الجلد باستخدام ملاقط ، وإجراء قطع في وسط منطقة البطن ، وفصل الجلد عن الصفاق ؛ (ج) تحديد النسيج الدهني الأبيض فوق البربخ؛ (د) نقل الأنسجة إلى وسط DMEM المكمل ب 10٪ FBS و 1٪ من المضادات الحيوية ، وغسل الأنسجة الدهنية في البربخ جيدا باستخدام PBS ، ونقل الأنسجة إلى محلول الهضم ؛ (ه) ، تجزئة الأنسجة و (F) الاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة تهتز بقوة كل 10 دقائق ؛ (ز) بعد عد الخلايا ، ضع صفيحة في 6 آبار ولاحظ مورفولوجيا الخلية تحت المجهر المقلوب. (F) سيتغير مورفولوجيا الخلية من دائرية إلى شبيهة بالخلايا الليفية. شريط المقياس = 22.22 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. استخراج الأنسجة الدهنية البربخ
    ملاحظة: كن على علم بأن جميع الإجراءات يجب أن تتم في ظل ظروف معقمة في خزانة تدفق رقائقي من أجل ضمان زراعة خلايا نقية وخالية من التلوث.
    1. القتل الرحيم للحيوانات باستخدام محلول الكيتامين والزيلازين (100 و10 ملغم/كغ، كما هو موضح في الخطوة 1-1-2) عن طريق الطريق داخل الصفاق.
      ملاحظة: يمكن استخدام طرق القتل الرحيم الأخرى23. تأكد من موت من خلال تأكيد عدم وجود نبضات القلب.
    2. ضع مع توجيه الجانب البطني لأعلى على لوح من الفلين أو الستايروفوم مغطى بورق الألمنيوم وقم بتثبيته باستخدام إبر معقمة (الشكل 1 أ).
      ملاحظة: لتجنب التلوث ، رش 70٪ كحول في منطقة البطن. بدلا من ذلك ، حلق الشعر بمشرط.
    3. ارفع الجلد باستخدام ملاقط في وسط منطقة البطن وقم بعمل قطع بمقص معقم.
      ملاحظة: مجموعتان من الملقط والمقصات المعقمة ضرورية لتجنب التلوث. أول واحد يستخدم لفتح ، وقطع الجلد والطبقة البريتونية. يستخدم الثاني لالتقاط الأنسجة الدهنية البربخية. أيضا ، احتفظ ب 150 مل من الكحول بنسبة 70٪ في دورق لتنظيف المقص والملاقط بين الخطوات.
    4. أدخل المقص تحت جلد وافتحه لفصله عن الصفاق (الشكل 1 ب). ارفع الطبقة البريتونية باستخدام ملاقط وقطعها بمقص معقم.
    5. استخدم مجموعة أخرى من الملقط والمقصات المعقمة وحدد البربخ فوق الخصيتين والأنسجة الدهنية البيضاء فوق البربخ. اسحب الأنسجة الدهنية البربخية بأكملها باستخدام ملاقط معقمة ، بحجم 2 سم تقريبا ، وقطعها بالقرب من البربخ (الشكل 1C).
    6. ضع الدهون في أنبوب مخروطي معقم سعة 50 مل يحتوي على وسط قاعدي وضعه على الثلج (الشكل 1 د). في غطاء المحرك ، انتقل إلى الخطوات التالية كما هو موضح أدناه.
  2. عزل الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
    ملاحظة: قم بمعالجة العينات في غطاء التدفق الصفحي البيولوجي من الفئة الثانية ، ويجب على الموظفين ارتداء معطف المختبر والقفازات والقناع الجراحي.
    1. اغسل الأنسجة الدهنية البربخية جيدا باستخدام برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة الدم والجزيئات الأخرى من العينة. يمكن للدم أن يثبط إنزيم كولاجيناز من النوع الثاني ويضر بالتجربة.
    2. باستخدام ملقط معقم ، انقل الأنسجة الدهنية من البربخ إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 15-20 مل من محلول الهضم ، محضر كخطوة 1.2.2. تجزئة الأنسجة باستخدام مقص معقم واحتضان الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (الشكل 1E ، F).
      ملاحظة: يمكن استخدام حمام مائي أو حاضنة عند 37 درجة مئوية في هذه الخطوة. كل 10 دقائق ، يجب هز التعليق بقوة لتسهيل عملية الهضم. لا تمدد وقت الحضانة 1h.
    3. قم بتعطيل كولاجيناز عن طريق تخفيف العينة 1: 1 في الوسط القاعدي وأجهزة الطرد المركزي المعلق عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية للحصول على الجزء الوعائي من السدى. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من الوسط القاعدي.
    4. تحقق من الصلاحية وعد الخلايا من خلال طريقة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء في غرفة نيوباور باستخدام تخفيف 1:10 أو 1: 100.
      ملاحظة: العائد المتوقع هو حوالي 0.5-1 مليون خلية / غرام من الأنسجة الدهنية المعالجة وصلاحية 80٪.
    5. صفيحة الخلايا المعزولة (0.3-0.5 مليون) في 3 مل من الوسط القاعدي في بئر واحد من صفيحة 6 آبار. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2.
    6. اليوم التالي: أخرج الوسط من البئر واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 3 مل من الوسط القاعدي. كرر هذه العملية كل 2 أيام حتى تصبح الخلايا 90٪ متقاربة.
      ملاحظة: لاحظ دائما مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب ، وتتغير من الجولة إلى الخلايا الليفية (الشكل 1H).
  3. توسع الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
    ملاحظة: بمجرد أن تنمو الخلايا ~ 90٪ متقاربة ، انتقل إلى الثقافة الفرعية كما هو موضح أدناه.
    1. أخرج الوسط من البئر واغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني. أضف 0.5 مل / بئر من التربسين / EDTA (0.05٪ تربسين ؛ 200 مجم / لتر EDTA) واحتضان اللوحة لمدة 3-5 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
      ملاحظة: لا تتجاوز 5 دقائق في التربسين / EDTA. يجب التحقق من الانفصال الكامل للخلايا تحت المجهر المقلوب. يمكن تسريع العملية عن طريق السحب لأعلى ولأسفل بعناية أو النقر على جانب اللوحة.
    2. قم بتعطيل الإنزيم عن طريق تخفيف العينة 1: 1 في DMEM المكملة بمصل بقري جنيني بنسبة 10٪ (FBS) ومضادات حيوية بنسبة 1٪.
    3. قسم معلق الخلية إلى 2 بئر وأضف 3 مل من الوسط القاعدي (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ مضاد حيوي). احتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5 ٪ CO2.
    4. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ، ثم كل 2 أيام حتى التقاء 90 ٪.
    5. كرر العملية حتى المقطع الثالث وانتقل إلى النمط الظاهري والتوصيف الوظيفي.
      ملاحظة: لاحظ دائما مورفولوجيا الخلايا تحت المجهر المقلوب ، وتتغير من الجولة إلى الخلايا الليفية.
  4. توصيف الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs)
    1. توصيف النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي
      1. افصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA، كما هو موضح في الخطوات من 2-3-1 إلى 2-3-2.
      2. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي (50 مل) وأجهزة طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من برنامج تلفزيوني.
      3. عد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.2.4 والبذور 0.5-1 × 106 خلايا في 100 ميكرولتر من PBS في 96 لوحة بئر.
        ملاحظة: يعتمد عدد الآبار على لون مرافق الفلوروكروم والمرشحات / الليزر الخاصة بمقياس الخلايا.
      4. أضف الأجسام المضادة (الجدول 1) المخففة في 1٪ BSA في PBS.
        ملاحظة: ليس من الضروري استخدام كتلة Fc لتجنب الارتباط غير المحدد لأننا نستخدم بالفعل BSA لتخفيف الأجسام المضادة. حجز عينة من الخلايا دون تلقي الأجسام المضادة التي سيتم استخدامها للسيطرة على تلطيخ. يمكن دمج الأجسام المضادة في نفس البئر وفقا لصبغة الفلوروكروم ومقياس الخلايا المتوفر في المختبر. يمكن إضافة جميع الأجسام المضادة الموضحة في الجدول 1 في نفس البئر ، باستثناء CD71 FITC و CD29 FITC ، والتي يجب أن تكون في آبار مختلفة بسبب نفس الفلوروكروم.
      5. احتضن الطبق لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية في الظلام.
      6. اغسل الخلايا ، ثم أكمل الحجم إلى 200 ميكرولتر باستخدام PBS ، وطرد مركزي للوحة عند 252 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية ، وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
      7. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 200 ميكرولتر لكل بئر من 2 ٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. قم بتخزين الخلايا في الظلام عند 4 درجات مئوية حتى يتم تحليلها في مقياس التدفق الخلوي.
        ملاحظة: للحصول على أفضل النتائج ، احصل على الخلايا الموجودة على مقياس التدفق الخلوي في أسرع وقت ممكن. يتحلل سطوع مضان العلامات بشكل ملحوظ بعد 48 ساعة لمعظم الفلوروكرومات. لذلك ، لا تتجاوز 48 ساعة لقراءة اللوحة. يوصى بالاستحواذ على 30000 حدث.
      8. استخدم استراتيجية البوابات الموضحة في الشكل 2B لتحديد مجتمع ASC.
    2. التوصيف الوظيفي: التمايز العظمي
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. صفيحة ، في ثلاث نسخ ، 2 × 105 خلايا لكل بئر في 6 ألواح جيدة في الإنسي القاعدي (DMEM مكمل ب 10٪ FBS و 1٪ مضادات حيوية) ؛ احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
        ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى لوحين من 6 آبار ، واحدة لكل وقت تمايز (14 و 21 يوما).
      3. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسيط إلى الوسط العظمي (الخطوة 1.4.1).
        ملاحظة: احتياطي 3 آبار يتم استزراعها فقط مع الوسط القاعدي ، والذي سيكون التحكم في التمايز.
      4. خلايا المزرعة لمدة 14 و 21 يوما في الوسط العظمي والخلايا الضابطة ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام. انتقل إلى تلطيخ فون كوسا (الخطوة 1.4.2) لتقييم العقيدات المعدنية في نهاية كل فترة استزراع.
      5. نضح الوسط من كل بئر وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. ثبت الخلايا ب 2 مل من الإيثانول بنسبة 70٪ طوال الليل في درجة حرارة الغرفة (RT). اغسل الخلايا بعناية في الماء الجاري.
      6. أضف 2 مل من محلول نترات الفضة بنسبة 5٪ واحتضان اللوحة في ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 1 ساعة. اغسل الخلايا بالماء المقطر. أضف 2 مل من ثيوسلفات الصوديوم 5٪ ، واحتضانها لمدة 5 دقائق. تغسل بالماء المقطر.
      7. كونترتستين مع 2 مل من اليوزين لمدة 40 ثانية. اغسل بالماء المقطر حتى تتم إزالة محلول التلوين ، وتصور التلوين باستخدام المجهر الضوئي.
    3. التوصيف الوظيفي: التمايز الأديبوجيني
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. لوحة 2 × 105 خلايا لكل بئر في 6 ألواح جيدة في الإنسي القاعدي (DMEM تستكمل مع 10 ٪ FBS و 1 ٪ المضادات الحيوية) ؛ احتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.
        ملاحظة: ستكون هناك حاجة إلى لوحين من 6 آبار ، واحدة لكل وقت تمايز (14 و 21 يوما).
      3. في اليوم التالي ، قم بتغيير الوسط إلى الوسط الدهني المنشأ (الخطوة 2.5.1).
        ملاحظة: قم بحجز 3 آبار يتم استزراعها فقط باستخدام الوسط القاعدي كعنصر تحكم.
      4. خلايا الثقافة لمدة 14 و 21 يوما في وسط دهني المنشأ ، وتغيير الوسائط كل 3 أيام. في نهاية كل فترة استزراع ، انتقل إلى تلطيخ Oil-Red O (الخطوات 2.4.3.5-2.4.3.7) ، وهو مؤشر على تراكم الدهون داخل الخلايا.
      5. نضح وسائل الإعلام من كل بئر. اغسل الخلايا مرتين باستخدام برنامج تلفزيوني. إصلاح الخلايا في 2 مل من 10 ٪ الفورمالين لمدة 1 ساعة. اغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني ، ثم مرة واحدة بالماء.
      6. صبغ مع 2 مل من محلول Oil-Red O في 60٪ إيزوبروبانول لمدة 5 دقائق. تغسل مرة واحدة بالماء المقطر.
      7. كونترستاين مع 2 مل من 1٪ هيماتوكسيلين مخفف 1: 2 في الماء المقطر لمدة دقيقة واحدة. اغسل بالماء المقطر حتى تتم إزالة محلول التلوين ، وتصور العينات الملطخة باستخدام المجهر الضوئي.
    4. التوصيف الوظيفي: التمايز الغضروفي
      1. فصل الخلايا باستخدام التربسين/EDTA (كما هو موضح في الخطوات 2-3-1 إلى 2-3-2)، وجمع الخلايا وطردها مركزيا (كما هو موضح في الخطوتين 2-4-1-2 و2-4-1-2)، وعدها (كما هو موضح في الخطوات 2-2-4).
      2. ضع 5 × 105 ADSCs في أربعة أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلين وأجهزة طرد مركزي عند 450 × جم لمدة 5 دقائق لتشكيل حبيبات. تخلص من المادة الطافية.
      3. استزراع الكريات في أنبوب مخروطي في وسط غضروفي (الخطوة 1.6.1) أو وسط قاعدي فقط (التحكم في التمايز) لمدة 14 و 21 يوما عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2. قم بتغيير الوسيط كل 3 أيام وتجنب إزالة الكريات.
        ملاحظة: تشير كل حبيبة خلوية إلى كل وقت استزراع ، بالإضافة إلى عناصر التحكم الخاصة بها التي تزرع فقط باستخدام الوسط القاعدي.
      4. في نهاية كل نقطة زمنية للاستزراع ، اجمع الكريات باستخدام ملاقط ذات أطراف دقيقة وضعها في طبق من 24 بئرا. المضي قدما في التقسيم النسيجي وتلطيخ البروتيوغليكان والجليكوزامينوجليكان (الخطوات 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        ملاحظة: تتم معالجة كل حبيبات في بئر منفصلة.
      5. ثبت الكريات في 2 مل من 10٪ من الفورمالديهايد المخزن لمدة 30 دقيقة. تخلص من محلول الفورمالديهايد ، وأضف 2 مل من الإيثانول بنسبة 70٪. قم بإزالة الحبيبات من الأنبوب المخروطي باستخدام طرف وقم بتضمين الكريات في البارافين.
      6. باستخدام ميكروتوم البارافين الدوار ، قم بعمل أقسام نسيجية 5 ميكرومتر. احتضن الأقسام لمدة 15 دقيقة عند 60 درجة مئوية ، واغمرها مرتين في الزيلين (لمدة 5 و 15 دقيقة).
      7. أعد ترطيب العينات عن طريق غمر الأقسام النسيجية في حمامات الكحول بتركيزات متناقصة (100٪ و 96٪ و 80٪ و 70٪) لمدة 2 دقيقة لكل منها ، ثم اشطفها بالماء منزوع الأيونات لمدة 5 دقائق.
      8. استمر في تلطيخ العينات بالأزرق Alcian 1٪ في حمض الخليك ، درجة الحموضة 2.5 ، لمدة 30 دقيقة.
      9. كونترستيك مع الهيماتوكسيلين لمدة 1 دقيقة ، ويغسل بالماء المقطر. قم بالتركيب باستخدام DPX (أداة تركيب للأنسجة) أو محلول تركيب آخر وتصور العينات باستخدام المجهر الضوئي.

النتائج

أظهرت الخلايا المستخرجة من الأنسجة الدهنية وفقا للبروتوكول المقدم هنا مورفولوجيا مطابقة للحد الأدنى من معايير MSCs التي اقترحها ISCT. نظرة عامة على البروتوكول موضحة في الشكل 1. ومن الناحية الظاهرية، أظهرت كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) التصاق بالتشكل البلاستيكي والشبي...

Discussion

يمكن استخراج MSCs من أنسجة مختلفة. على الرغم من أن نخاع العظم يمثل مصدرا شائعا ل MSCs في كل من الفئران والبشر25,26 ، فقد اخترنا العمل مع الأنسجة الدهنية في هذه الدراسة بسبب ثرائها في MSCs ، وتوزيعها في الجسم ، وسهولة الوصول إليها. كبديل ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

بحث مدعوم بمنحة من المجلس الوطني للتنمية العلمية والتكنولوجيا (480807/2011-6) ومؤسسة أمبارو في بيسكيسا دي ميناس جيرايس (APQ-01237-11). تم تمويل هذه الدراسة جزئيا من قبل PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG و URS بفضل المنحة الدراسية التي تمنحها Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) ، و Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) ، على التوالي.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
140 °C High Heat Sterilization CO2 IncubatorRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acetic acid glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in water
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acidSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNot applicable1 unit
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Cell culture plates (6-well)Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic mediumStem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life TechnologiesA1007101TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type IILife Technologies, California, USA17101015
cork or styrofoam board covered with aluminumNot applicable1 unit
cottonNot applicable50 g
DexamethasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Dissecting scissorNot applicable03 units sterile
DPX Mountant for histologySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldehydeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)Not applicable5 units
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamberSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645540Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)Merck, Darmstadt, GermanyZ717401Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645516Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910.5% in isopropanol
ParaffinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48, in block form
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 units sterile
scalpel (optional)Not applicable1 unit
Silver nitrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Surgical tweezer (15 cm)Not applicable3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
syringe (1 mL)Not applicable1 unit
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)

References

  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22 (2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306 (2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67 (2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187 (2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234 (2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484 (2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891 (2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206 (2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272 (2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621 (2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635 (2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

MSCs

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved