العزلة ، التوسع في المختبر ، وتوصيف الخلايا الجذعية الوسيطة من الأنسجة الدهنية في البربخ الفأر

Summary

الأنسجة الدهنية هي مصدر ممتاز للخلايا الجذعية الوسيطة. هنا ، نقدم عملية استخراج وزراعة وتوصيف الخلايا الجذعية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) خطوة بخطوة من الأنسجة الدهنية للبربخ في الفئران السويسرية.

Abstract

تمت دراسة الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) على نطاق واسع كنهج علاجي جديد ، وذلك أساسا لوقف الالتهاب المتفاقم بسبب قدرتها على تعديل الاستجابة المناعية. MSCs هي خلايا ذات امتيازات مناعية قادرة على البقاء على قيد الحياة في متلقي الزرع الخيفي غير المتوافق مناعيا بناء على التعبير المنخفض عن جزيئات معقد التوافق النسيجي الرئيسي من الفئة الأولى (MHC) وفي استخدام العلاج القائم على الخلايا للزراعة الخيفية. يمكن عزل هذه الخلايا من عدة أنسجة ، وأكثرها استخداما هو نخاع العظم والأنسجة الدهنية. نحن نقدم بروتوكولا سهلا لعزل وزراعة وتوصيف MSCs من الأنسجة الدهنية للبربخ للفئران. يتم استئصال الأنسجة الدهنية البربخية جراحيا ، وتجزئتها جسديا ، وهضمها بمحلول كولاجيناز من النوع الثاني بنسبة 0.15٪. بعد ذلك ، يتم استزراع الخلايا الجذعية الأولية المشتقة من الأنسجة الدهنية (ADSCs) وتوسيعها في المختبر ، ويتم إجراء توصيف النمط الظاهري عن طريق قياس التدفق الخلوي. كما نقدم الخطوات اللازمة للتمييز بين كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) إلى خلايا عظمية المنشأ، وخلايا دهنية، وخلايا غضروفية المنشأ، متبوعة بالتوصيف الوظيفي لكل سلالة خلية. يمكن استخدام البروتوكول المقدم هنا للتجارب في الجسم الحي وخارج الجسم الحي ، وكبديل ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية المشتقة من الدهون لتوليد خلايا خالدة تشبه MSCs.

Introduction

الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) هي خلايا بالغة متعددة الإمكانات تتمايز إلى خلايا مثل بانيات العظم والأرومة الغضروفية والخلايا الشحمية ^1,2. توجد هذه الخلايا في العديد من الأعضاء ، ولهذا السبب ، يمكن استخراجها من الأنسجة البالغة مثل نخاع العظام والعضلات والدهون وبصيلات الشعر وجذر الأسنان والمشيمة والأدمة و perichondrium والحبل السري^والرئة والكبد والطحال ^3,4.

تم الإبلاغ عن آثار MSCs على علم وظائف الأعضاء والجهاز المناعي ^5,6. كانت هذه الخلايا واعدة ل....

Protocol

أجريت جميع التجارب على وفقا للمبادئ التوجيهية الدولية لأخلاقيات وتمت الموافقة عليها من قبل اللجان المؤسسية للرعاية والاستخدام من جامعة ولاية سانتا كروز بموجب البروتوكول رقم 021/22. تم الحصول على ذكور الفئران السويسرية (6-8 أسابيع) من مختبر تربية وصيانتها وتجريبها - مرفق البحوث الحيوانية بجامعة ولاية سانتا كروز (LaBIO-UESC) ، والتي يتم الحفاظ عليها في ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض ، وتتلقى الماء والغذاء حسب الطلب مع دورات الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة.

ملاحظة: يمكن استخدام سلالة الفئران الأخرى ؛ نوصي باستخدام الفئران البالغة (6-8 أسابيع) لأنها تحتوي على أنسجة وخلايا دهنية أكثر تطورا ذات نشاط تكاثري عالي.

....

النتائج

أظهرت الخلايا المستخرجة من الأنسجة الدهنية وفقا للبروتوكول المقدم هنا مورفولوجيا مطابقة للحد الأدنى من معايير MSCs التي اقترحها ISCT. نظرة عامة على البروتوكول موضحة في الشكل 1. ومن الناحية الظاهرية، أظهرت كالوريمتر المسح الضوئي التفاضلي (ADSCs) التصاق بالتشكل البلاستيكي والشبي.......

Discussion

يمكن استخراج MSCs من أنسجة مختلفة. على الرغم من أن نخاع العظم يمثل مصدرا شائعا ل MSCs في كل من الفئران والبشر^25,26 ، فقد اخترنا العمل مع الأنسجة الدهنية في هذه الدراسة بسبب ثرائها في MSCs ، وتوزيعها في الجسم ، وسهولة الوصول إليها. كبديل ، يمكن استخدام الخلايا الجذعية .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)