Fare Epididimal Yağ Dokusundan Mezenkimal Kök Hücrelerin İzolasyonu, İn Vitro Genişletme ve Karakterizasyonu

Özet

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), esas olarak bağışıklık tepkisini modüle etme potansiyelleri nedeniyle şiddetlenen inflamasyonu durdurmak için yeni bir terapötik yaklaşım olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. MSC'ler, sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin düşük ekspresyonuna ve allojenik nakil için hücre bazlı tedavinin kullanımına dayalı olarak immünolojik olarak uyumsuz allojenik nakil alıcılarında hayatta kalabilen bağışıklık ayrıcalıklı hücrelerdir. Bu hücreler, en yaygın olarak kullanılanı kemik iliği ve yağ dokuları olmak üzere birkaç dokudan izole edilebilir. MSC'leri farelerin epididimal yağ dokusundan izole etmek, kültürlemek ve karakterize etmek için kolay bir protokol sunuyoruz. Epididimal yağ dokusu cerrahi olarak eksize edilir, fiziksel olarak parçalanır ve %0.15'lik kollajenaz tip II solüsyon ile sindirilir. Daha sonra, primer yağ dokusu kaynaklı kök (ADSC'ler) hücreler in vitro olarak kültürlenir ve genişletilir ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon gerçekleştirilir. Ayrıca, ADSC'leri osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücrelere ayırmak için adımlar ve ardından her hücre soyunun fonksiyonel karakterizasyonunu sağlıyoruz. Burada sağlanan protokol, in vivo ve ex vivo deneyler için kullanılabilir ve alternatif olarak, adipoz türevli kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), osteoblast, kondroblast ve adiposit ^1,2 gibi hücrelere farklılaşan yetişkin çok potansiyelli hücrelerdir. Bu hücreler birkaç organda bulunur ve bu nedenle kemik iliği, kas, yağ, kıl folikülü, diş kökü, plasenta, dermis, perikondriyum, göbek kordonu, akciğer, karaciğer ve dalak gibi yetişkin dokulardan çıkarılabilirler ^3,4.

MSC'lerin fizyoloji ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkileri bildirilmiştir ^5,6. Bu hücr....

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, hayvan etiği için uluslararası yönergelere göre yürütüldü ve Santa Cruz Eyalet Üniversitesi'nden kurumsal bakım ve kullanım komiteleri tarafından 021/22 protokol numarası altında onaylandı. İsviçreli erkek fareler (6-8 hafta), Hayvan Yetiştirme, Bakım ve Deney Laboratuvarı - Santa Cruz Eyalet Üniversitesi (LaBIO-UESC) Hayvan Araştırma Tesisi'nden alındı, belirli patojen içermeyen koşullarda tutuldu, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüleri ile su ve yiyecek ad libitum aldı.

NOT: Diğer fare soyları kullanılabilir; Yetişkin farelerin (6-8 hafta) daha gelişmiş yağ dokusuna ve yüksek proliferatif aktiviteye sahip hücrelere....

Sonuçlar

Burada sunulan protokole göre yağ dokusundan ekstrakte edilen hücreler, ISCT tarafından önerilen MSC'ler için minimum kriterlere uyan morfoloji gösterdi. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Fenotipik olarak, ADSC'ler hücre kültürünün ilk günlerinde plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye bağlılık göstermiştir (Şekil 2A). Ayrıca homojen bir şekilde büyüdüler ve koloniler oluşturdular. Ayrıca, ADSC'ler hematopoiet.......

Tartışmalar

MSC'ler farklı dokulardan çıkarılabilir. Kemik iliği hem murinlerde hem de insanlarda ortak bir MSC kaynağını temsil etmesine^{rağmen 25,26}, MSC'lerdeki zenginliği, vücuttaki dağılımı ve ona erişim kolaylığı nedeniyle bu çalışmada yağ dokusu ile çalışmayı seçtik. Alternatif olarak, adipoz kaynaklı kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler üretmek için kullanılabilir²⁷.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)