JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Yağ dokusu mükemmel bir mezenkimal kök hücre kaynağıdır. Burada, İsviçre fareleri epididimal yağ dokusundan yağ dokusu türevli kök hücrelerin (ADSC'ler) adım adım ekstraksiyonunu, yetiştirilmesini ve karakterizasyonunu getiriyoruz.

Özet

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), esas olarak bağışıklık tepkisini modüle etme potansiyelleri nedeniyle şiddetlenen inflamasyonu durdurmak için yeni bir terapötik yaklaşım olarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. MSC'ler, sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin düşük ekspresyonuna ve allojenik nakil için hücre bazlı tedavinin kullanımına dayalı olarak immünolojik olarak uyumsuz allojenik nakil alıcılarında hayatta kalabilen bağışıklık ayrıcalıklı hücrelerdir. Bu hücreler, en yaygın olarak kullanılanı kemik iliği ve yağ dokuları olmak üzere birkaç dokudan izole edilebilir. MSC'leri farelerin epididimal yağ dokusundan izole etmek, kültürlemek ve karakterize etmek için kolay bir protokol sunuyoruz. Epididimal yağ dokusu cerrahi olarak eksize edilir, fiziksel olarak parçalanır ve %0.15'lik kollajenaz tip II solüsyon ile sindirilir. Daha sonra, primer yağ dokusu kaynaklı kök (ADSC'ler) hücreler in vitro olarak kültürlenir ve genişletilir ve akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon gerçekleştirilir. Ayrıca, ADSC'leri osteojenik, adipojenik ve kondrojenik hücrelere ayırmak için adımlar ve ardından her hücre soyunun fonksiyonel karakterizasyonunu sağlıyoruz. Burada sağlanan protokol, in vivo ve ex vivo deneyler için kullanılabilir ve alternatif olarak, adipoz türevli kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler oluşturmak için kullanılabilir.

Giriş

Mezenkimal kök hücreler (MSC'ler), osteoblast, kondroblast ve adiposit 1,2 gibi hücrelere farklılaşan yetişkin çok potansiyelli hücrelerdir. Bu hücreler birkaç organda bulunur ve bu nedenle kemik iliği, kas, yağ, kıl folikülü, diş kökü, plasenta, dermis, perikondriyum, göbek kordonu, akciğer, karaciğer ve dalak gibi yetişkin dokulardan çıkarılabilirler 3,4.

MSC'lerin fizyoloji ve bağışıklık sistemi üzerindeki etkileri bildirilmiştir 5,6. Bu hücreler, hem insan hem de veterinerlik tıbbında çeşitli hastalıkların tedavisi için umut verici olmuştur. MSC'ler, hücre-hücre teması, çözünür faktörler ve küçük hücre dışı veziküller 7,8,9,10 gibi farklı mekanizmalar yoluyla iltihabı kontrol edebilir ve anjiyogenez ve doku homeostazını teşvik edebilir. Ayrıca, MSC'ler, immünolojik olarak uyumsuz allojenik nakil alıcılarında hayatta kalabilen bağışıklık ayrıcalıklı hücrelerdir, çünkü bu hücreler sınıf I majör histouyumluluk kompleksi (MHC) moleküllerinin düşük ekspresyonunu gösterir ve allojenik nakil için hücre bazlı tedavide kullanılır11,12. Rejeneratif potansiyel ile birleşen düşük immünojenisite, MSC'leri greft-versus-host hastalığı (GvHD)13, sistemik lupus eritematozus14 ve multipl skleroz 15 gibi hücre tedavisi için ideal adaylar haline getirir16,17.

MSC'lerin birkaç yetişkin dokuda bulunmasına rağmen, yağ dokusu, minimum cerrahi müdahale ile hasat için erişilebilirlik gibi diğer kaynaklara göre avantajlar sunar; yüksek genleşme oranına sahip çok sayıda kullanılabilir hücre; ve özel ekipman ve düşük maliyetli malzemelere ihtiyaç duymadan gerçekleştirmesi kolay bir protokol kullanarak kolay in vitro genişletme 18,19,20. Ekstrakte edildikten sonra, yağ dokusu kaynaklı kök hücreler (ADSC'ler), Uluslararası Hücresel Tedavi Derneği (ISCT)21 tarafından belirlendiği şekilde karakterize edilmelidir. Bu nedenle, MSC'ler morfoloji fibroblast benzeri, plastik kültüre bağlılık, endoglin (CD105), ekto-5'-nükleotidaz (CD73) ve Thy-1 (CD90) gibi mezenkimal belirteçlerin yüksek bir yüzdesini (% ≥95) ve lökosit ortak antijeni (CD45), transmembran fosfoglikoprotein (CD34), glikolipid bağlantılı membran glikoproteini (CD14), integrin alfa M (CD11b), B hücresi antijen reseptörü kompleksi ile ilişkili protein alfa zinciri (CD79α) gibi hematopoietik belirteçlerin düşük yüzdesini (% ≤2) ifade etmelidir. B-lenfosit yüzey antijeni B4 (CD19) ve sınıf II insan lökosit antijeni (HLA-II). Ayrıca, fonksiyonel bir karakterizasyon gereklidir ve hücreler osteoblast, kondroblast veya adipoblast hücrelerine farklılaşabilmelidir21.

Burada, in vitro çalışmalar için mekanik ayrışma ve enzimatik sindirim kullanılarak epididimal yağ dokusundan MSC'lerin nasıl elde edileceğini ve ISCT ile önceden belirlenmiş morfolojik karakterizasyonu gösteriyoruz.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, hayvan etiği için uluslararası yönergelere göre yürütüldü ve Santa Cruz Eyalet Üniversitesi'nden kurumsal bakım ve kullanım komiteleri tarafından 021/22 protokol numarası altında onaylandı. İsviçreli erkek fareler (6-8 hafta), Hayvan Yetiştirme, Bakım ve Deney Laboratuvarı - Santa Cruz Eyalet Üniversitesi (LaBIO-UESC) Hayvan Araştırma Tesisi'nden alındı, belirli patojen içermeyen koşullarda tutuldu, 12 saatlik aydınlık / karanlık döngüleri ile su ve yiyecek ad libitum aldı.

NOT: Diğer fare soyları kullanılabilir; Yetişkin farelerin (6-8 hafta) daha gelişmiş yağ dokusuna ve yüksek proliferatif aktiviteye sahip hücrelere sahip oldukları için kullanılmasını öneriyoruz.

1. Hazırlık

NOT: Devam etmeden önce, aşağıda açıklanan aşağıdaki reaktifleri hazırlayın. Reaktif ve malzeme tedarikçisi bilgileri için Malzeme Tablosuna bakın. Tüm pratik prosedürlerde maskeler, boneler, laboratuvar önlükleri ve eldivenler gibi kişisel koruyucu ekipmanlar giyilmelidir.

  1. Epididimal yağ dokusu ekstraksiyonu
    1. Ameliyat malzemelerini ayırın: üç set steril cımbız ve makas, beş iğne ve 200 mL %70 etanol içeren bir beher.
    2. Ketamin (100 mg / kg) ve ksilazini (10 mg / kg) karıştırarak bir terminal anestezik hazırlayın.
  2. ADSC kültürü
    1. Bazal ortam: %10 fetal sığır serumu (FBS), 50 μg/mL gentamisin, 0.25 μg/mL amfoterisin B, 100 U/mL penisilin ve 100 mg/mL streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) yüksek glikoz ortamını hazırlayın.
    2. Özet çözeltisi: 0.25 μm'lik bir filtrede sterilize edilmiş PBS'de% 0.15 kollajenaz tip II hazırlayın.
      NOT: Bazal besiyerinde tarif edilen dört antibiyotiğin kullanılması gerekli değildir. Bunun gerçekleştirildiği laboratuvarın hücre kültürü koşullarına bağlı olacaktır.
  3. ADSC'lerin fenotipik karakterizasyonu
    1. PBS'de% 1 sığır serum albümini (BSA) hazırlayın.
    2. Anti-fare antikorlarını Tablo 1'de belirtildiği gibi seyreltin.
    3. PBS'de% 2 formaldehit hazırlayın.
  4. ADSC'lerin osteojenik farklılaşması
    1. Osteojenik farklılaşma ortamı: 5.67 M askorbik asit, 10 nM deksametazon, 0.02 M β-gliserofosfat, %10 FBS ve %1 penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş DMEM hazırlayın.
    2. Von Kossa boyama için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: suda %70 etanol, suda %5 gümüş nitrat, damıtılmış su, suda %5 sodyum tiyosülfat ve suda %1 eozin B.
  5. Adipojenik farklılaşma:
    1. Adipojenik farklılaşma ortamı: 0.5 mM 3-İzobutil-1-metilksantin, 200 μM indometasin, 1 μM deksametazon, 10 μM insülin,% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş DMEM hazırlayın.
    2. Yağ kırmızısı boyama için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: deiyonize suda %10 formalin, deiyonize suda %60 izopropanol, %60 izopropanol içinde lizokrom (yağda çözünen boya) diazo boya (Yağ-Kırmızı O çözeltisi) ve deiyonize suda %1 hematoksilin.
  6. Kondrojenik farklılaşma:
    1. Kondrojenik farklılaşma ortamı: %10 FBS ve %1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiş kondrojenik ortam hazırlayın.
    2. PBS'de% 10 formaldehit hazırlayın.
    3. Proteoglikanlar ve glikozaminoglikanların boyanması için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın: Asetik asitte heteroglikan boyası (Alcian Mavisi %1), pH 2.5, parafin, hematoksilen, suda etanol serisi seyreltme (%100, %96, %80 ve %70).

Antikor/FloroforSeyreltmeKlonNihai konsantrasyon (μg/mL)İfade edildiği fonksiyon ve hücre
CD34- PE1:100VERİ DEPOSU342Hücre yapışma faktörü. Hematopoetik kök hücreler.
CD45- APC1:10030-F11 Serisi2Lökositlerin aktivasyonunda yardım. Lökositlerde ifade edilir.
CD71- FITC1:100C2 (İngilizce)5Hücre çoğalması sırasında demir alımını kontrol eder. Çoğalan hücreler, retikülositler ve öncü hücreler.
CD29- FITC1:100Ha2/55Adezyon ve aktivasyon, embriyogenez, Lökositler, dendritik hücreler, trombositler, mast hücreleri, fibroblastlar ve endotel hücreleri.
CD90- CP Başına1:100ÖKÜZ-72Sinyalizasyon, yapışma. T lenfosit, NK, monosit, Hemtopoietik Kök Hücreler, nöron ve fibroblast.

Tablo 1: Akış sitometresi ile ADSC'lerin fenotipik karakterizasyonu için kullanılan antikorlar. İlgili florokromları, seyreltmeleri, klonları ve son konsantrasyonları ile birlikte antikorların listesi ve ayrıca ifade edilen hücredeki işlevleri.

2. Yöntemler

NOT: Yağ dokusu vücudun her yerinde deri altı veya karın içi yerlerde dağılır. Farelerde, deneyler için kullanılan en yaygın yağ dokuları deri altı epididimal, mezenterik ve retroperitoneal22'yi içerir. Burada epididimal yağ dokusu elde etme adımları gösterilmiştir (Şekil 1).

figure-protocol-5801
Şekil 1: İsviçre farelerinden yağ dokusu kaynaklı kök hücreler elde etmek için deneysel tasarım. (A) İğneler kullanarak hayvanı mantar veya strafor levha üzerine yerleştirin; (B) Cildi cımbız kullanarak kaldırın, karın bölgesinin ortasında bir kesi yapın ve cildi peritondan ayırın; (C) epididimin üzerindeki beyaz yağ dokusunu tanımlamak; (D) dokuyu %10 FBS ve %1 antibiyotik ile takviye edilmiş DMEM ortamına aktarın, epididimal yağ dokusunu PBS ile iyice yıkayın ve dokuyu sindirim solüsyonuna aktarın; (E), dokuyu parçalayın ve (F) her 10 dakikada bir kuvvetlice sallayarak 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin; (G) hücreleri saydıktan sonra, 6 oyuklu plakalara yerleştirin ve ters çevrilmiş bir mikroskop altında hücre morfolojisini gözlemleyin. (F) Hücre morfolojisi yuvarlaktan fibroblast benzerine değişecektir. Ölçek çubuğu = 22.22 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Epididimal yağ dokusunun ekstraksiyonu
    NOT: Saf ve kontaminasyonsuz hücre kültürü sağlamak için tüm prosedürlerin bir laminer akış kabininde steril koşullar altında gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmayın.
    1. Hayvanları ketamin ve ksilazin çözeltisi (adım 1.1.2'de tarif edildiği gibi 100 ve 10 mg / kg) kullanarak intraperitoneal yolla ötenazi yapın.
      NOT: Diğer ötenazi yöntemleri kullanılabilir23. Kalp atışı olmadığını onaylayarak hayvanın öldüğünden emin olun.
    2. Hayvanı, ventral tarafı yukarı bakacak şekilde alüminyum folyo ile kaplı bir mantar veya strafor levha üzerine yerleştirin ve steril iğneler kullanarak sabitleyin (Şekil 1A).
      NOT: Kontaminasyonu önlemek için karın bölgesine% 70 alkol püskürtün. Alternatif olarak, saçı bir neşterle tıraş edin.
    3. Karın bölgesinin ortasındaki cımbız kullanarak cildi kaldırın ve steril makasla bir kesim yapın.
      NOT: Kontaminasyonu önlemek için iki set steril cımbız ve makas gereklidir. Birincisi hayvanı açmak, cildi ve periton tabakasını kesmek için kullanılır; İkincisi epididimal yağ dokusunu almak için kullanılır. Ayrıca, adımlar arasında makas ve cımbızı temizlemek için bir beherde 150 mL% 70 alkol ayırın.
    4. Makası hayvanın derisinin altına sokun ve karın zarından ayırmak için açın (Şekil 1B). Cımbız kullanarak periton tabakasını kaldırın ve steril makasla kesin.
    5. Başka bir steril cımbız ve makas seti kullanın ve testislerin üzerindeki epididimi ve epididimin üzerindeki beyaz yağ dokusunu tanımlayın. Steril cımbız kullanarak tüm epididimal yağ dokusunu yaklaşık 2 cm boyutunda çekin ve epididimise çok yakın kesin (Şekil 1C).
    6. Yağı, bazal besiyeri içeren 50 mL steril konik bir tüpe koyun ve buzun üzerine yerleştirin (Şekil 1D). Kaputta, aşağıda açıklandığı gibi sonraki adımlara geçin.
  2. Yağ dokusu kaynaklı kök hücrelerin (ADSC) izolasyonu
    NOT: Numuneleri biyolojik sınıf II laminer akış başlığında işleyin ve personel laboratuvar önlüğü, eldiven ve cerrahi maske takmalıdır.
    1. Epididimal yağ dokusunu PBS ile iyice yıkayın.
      NOT: Bu adım, numuneden kan ve diğer parçacıkları çıkarmak için gereklidir. Kan, kollajenaz tip II enzimini inhibe edebilir ve deneyi tehlikeye atabilir.
    2. Steril bir cımbız kullanarak, epididimal yağ dokusunu, adım 1.2.2 olarak hazırlanan 15-20 mL sindirim solüsyonu içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Steril makas kullanarak dokuyu parçalayın ve dokuyu 37 °C'de 1 saat inkübe edin (Şekil 1E, F).
      NOT: Bu adımda 37 °C'de bir su banyosu veya inkübatör kullanılabilir. Her 10 dakikada bir, sindirimi kolaylaştırmak için süspansiyon kuvvetlice çalkalanmalıdır. 1 saatlik inkübasyon süresini uzatmayın.
    3. Numuneyi bazal ortamda 1: 1 oranında seyrelterek kollajenazı inaktive edin ve stroma'nın vasküler fraksiyonunu elde etmek için süspansiyonu 250 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL bazal ortamda yeniden süspanse edin.
    4. Canlılığı kontrol edin ve 1:10 veya 1:100 seyreltme kullanarak bir Neubauer odasında tripan mavisi boya dışlama yöntemiyle hücreleri sayın.
      NOT: Beklenen verim yaklaşık 0.5-1 milyon hücre/g işlenmiş yağ dokusu ve canlılık %80'dir.
    5. İzole edilmiş hücreleri (0.3-0.5 milyon) 6 oyuklu bir plakanın bir oyuğunda 3 mL bazal ortamda plakalayın. Hücreleri gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
    6. Ertesi gün: Ortamı kuyudan çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. 3 mL bazal ortam ekleyin. Hücreler% 90 birleşene kadar bu işlemi her 2 günde bir tekrarlayın.
      NOT: Hücrelerin morfolojisini her zaman ters mikroskop altında, yuvarlaktan fibroblast benzerine doğru değişen şekilde gözlemleyin (Şekil 1H).
  3. Yağ dokusu kaynaklı kök hücrelerin (ADSC'ler) genişlemesi
    NOT: Hücreler ~% 90 birleşerek büyüdüğünde, aşağıda açıklandığı gibi alt kültüre geçin.
    1. Ortamı kuyudan çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın. 0.5 mL / kuyu tripsin / EDTA (% 0.05 tripsin; 200 mg / L EDTA) ekleyin ve hücreleri ayırmak için plakayı 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
      NOT: Tripsin / EDTA'da 5 dakikayı aşmayın. Hücrelerin tamamen ayrılması, ters mikroskop altında doğrulanmalıdır. İşlem, dikkatli bir şekilde yukarı ve aşağı pipetleyerek veya plakanın yan tarafına hafifçe vurarak hızlandırılabilir.
    2. % 10 fetal sığır serumu (FBS) ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiş DMEM'de numuneyi 1: 1 oranında seyrelterek enzimi inaktive edin.
    3. Hücre süspansiyonunu 2 oyuğa bölün ve 3 mL bazal ortam ekleyin (DMEM% 10 FBS ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiştir). Gece boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 ile inkübe edin.
    4. Ertesi gün ortamı değiştirin, ardından %90 birleşene kadar her 2 günde bir değiştirin.
    5. İşlemi üçüncü pasaja kadar tekrarlayın ve fenotip ve fonksiyonel karakterizasyona geçin.
      NOT: Hücrelerin morfolojisini her zaman ters mikroskop altında, yuvarlaktan fibroblast benzerine doğru değişen şekilde gözlemleyin.
  4. Yağ dokusu kaynaklı kök hücrelerin (ADSC) karakterizasyonu
    1. Akış sitometrisi ile fenotipik karakterizasyon
      1. 2.3.1 ila 2.3.2 adımlarında açıklandığı gibi Tripsin/EDTA kullanarak hücreleri ayırın.
      2. Hücreleri konik bir tüpte (50 mL) toplayın ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve peleti 1 mL PBS'de yeniden süspanse edin.
      3. Hücreleri adım 2.2.4'te açıklandığı gibi sayın ve 96 oyuklu bir plakada 100 μL PBS'de 0.5-1 x10 6 hücre tohumlayın.
        NOT: Kuyucuk sayısı, florokrom konjugatının rengine ve sitometrenin filtrelerine/lazerlerine bağlı olacaktır.
      4. PBS'de% 1 BSA ile seyreltilmiş antikorları (Tablo 1) ekleyin.
        NOT: Antikorları seyreltmek için zaten BSA kullandığımız için spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için Fc bloğu kullanmak gerekli değildir. Boyama kontrolü olarak kullanılacak antikorları almadan bir hücre örneği ayırın. Antikorlar, laboratuvarda bulunan florokrom boya ve sitometreye göre aynı kuyuda birleştirilebilir. Tablo 1'de tarif edilen tüm antikorlar, aynı florokrom nedeniyle farklı oyuklarda olması gereken CD71 FITC ve CD29 FITC hariç, aynı kuyucuğa eklenebilir.
      5. Plakayı karanlıkta 4 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
      6. Hücreleri yıkayın, ardından PBS kullanarak hacmi 200 μL'ye tamamlayın, plakayı 252 x g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın.
      7. PBS'de oyuk başına 200 μL %2 formaldehit ekleyerek hücreleri sabitleyin. Akış sitometresinde analiz edilene kadar hücreleri karanlıkta 4 ° C'de saklayın.
        NOT: En iyi sonuçlar için, akış sitometresindeki hücreleri mümkün olan en kısa sürede edinin. İşaretleyicilerin floresansının parlaklığı, çoğu florokrom için 48 saat sonra önemli ölçüde azalır. Bu nedenle, plakayı okumak için 48 saati aşmayın. 30.000 olayın satın alınması önerilir.
      8. ASC popülasyonunu seçmek için Şekil 2B'de sunulan geçit stratejisini kullanın.
    2. Fonksiyonel karakterizasyon: Osteojenik farklılaşma
      1. Tripsin/EDTA kullanarak hücreleri ayırın (2.3.1 ila 2.3.2 adımlarında açıklandığı gibi), hücreleri toplayın ve santrifüjleyin (2.4.1.2 ve 2.4.1.2 adımlarında açıklandığı gibi) ve bunları sayın (2.2.4 adımlarında açıklandığı gibi).
      2. Plaka, üç kopya halinde, bazal medialde 6 oyuklu plakalarda oyuk başına 2 x 105 hücre (% 10 FBS ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiş DMEM); 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin.
        NOT: Her farklılaşma süresi (14 ve 21 gün) için bir tane olmak üzere iki adet 6 oyuklu plakaya ihtiyaç duyulacaktır.
      3. Ertesi gün, besiyerini osteojenik besiyeri olarak değiştirin (adım 1.4.1).
        NOT: Sadece bazal ortam ile kültürlenen 3 kuyuyu rezerve edin, bu da farklılaşma için kontrol olacaktır.
      4. Osteojenik ortamda 14 ve 21 gün boyunca kültür hücreleri ve kontrol hücreleri, her 3 günde bir ortam değiştirir. Her kültür periyodunun sonunda mineralize nodülleri değerlendirmek için Von Kossa boyamaya (adım 1.4.2) geçin.
      5. Ortamı her bir oyuktan aspire edin ve hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri gece boyunca oda sıcaklığında (RT) 2 mL %70 etanol ile sabitleyin. Hücreleri akan suda dikkatlice yıkayın.
      6. 2 mL% 5 gümüş nitrat çözeltisi ekleyin ve plakayı 1 saat ultraviyole ışıkta inkübe edin. Hücreleri damıtılmış suyla yıkayın. 2 mL% 5 sodyum tiyosülfat ekleyin ve 5 dakika inkübe edin. Damıtılmış su ile yıkayın.
      7. 40 saniye boyunca 2 mL eozin ile lekeleyin. Boyama solüsyonu çıkana kadar damıtılmış su ile yıkayın ve lekelenmeyi optik mikroskop kullanarak görselleştirin.
    3. Fonksiyonel karakterizasyon: Adipojenik farklılaşma
      1. Tripsin/EDTA kullanarak hücreleri ayırın (2.3.1 ila 2.3.2 adımlarında açıklandığı gibi), hücreleri toplayın ve santrifüjleyin (2.4.1.2 ve 2.4.1.2 adımlarında açıklandığı gibi) ve bunları sayın (2.2.4 adımlarında açıklandığı gibi).
      2. Bazal medialde 6 oyuklu plakalarda kuyu başına 2 x 105 hücre (DMEM% 10 FBS ve% 1 antibiyotik ile desteklenmiş); 37 ° C'de% 5 CO2 içinde inkübe edin.
        NOT: Her farklılaşma süresi (14 ve 21 gün) için bir tane olmak üzere iki adet 6 oyuklu plakaya ihtiyaç duyulacaktır.
      3. Ertesi gün, ortamı adipojenik ortama değiştirin (adım 2.5.1).
        NOT: Sadece bazal ortam kontrol olarak kültürlenmekte olan 3 kuyuyu rezerve edin.
      4. Adipojenik ortamda 14 ve 21 gün boyunca kültür hücreleri, her 3 günde bir ortam değiştirir. Her kültür periyodunun sonunda, hücre içi lipid birikiminin bir göstergesi olan Yağ Kırmızısı O boyamaya (adım 2.4.3.5-2.4.3.7) geçin.
      5. Medyayı her kuyudan aspire edin. Hücreleri PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 1 saat boyunca 2 mL% 10 formalin içinde sabitleyin. Bir kez PBS ile yıkayın ve ardından bir kez su ile yıkayın.
      6. %60 izopropanol içinde 2 mL Oil-Red O solüsyonu ile 5 dakika boyayın. Damıtılmış su ile bir kez yıkayın.
      7. Damıtılmış suda 1:2 oranında seyreltilmiş 2 mL %1 hematoksilen ile 1 dakika boyunca karşı lekeleyin. Boyama solüsyonu çıkana kadar damıtılmış su ile yıkayın ve lekeli numuneleri optik mikroskop kullanarak görselleştirin.
    4. Fonksiyonel karakterizasyon: Kondrojenik farklılaşma
      1. Tripsin/EDTA kullanarak hücreleri ayırın (2.3.1 ila 2.3.2 adımlarında açıklandığı gibi), hücreleri toplayın ve santrifüjleyin (2.4.1.2 ve 2.4.1.2 adımlarında açıklandığı gibi) ve bunları sayın (2.2.4 adımlarında açıklandığı gibi).
      2. 5 x 105 ADSC'yi dört polipropilen konik tüpe yerleştirin ve bir pelet oluşturmak için 450 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı atın.
      3. Peletleri konik bir tüp içinde kondrojenik bir ortamda (adım 1.6.1) veya sadece bazal ortamda (farklılaşma kontrolü) 14 ve 21 gün boyunca 37 ° C'de% 5 CO2 içinde kültürleyin. Ortamı her 3 günde bir değiştirin ve peletleri çıkarmaktan kaçının.
        NOT: Her hücre peleti, her bir kültür zamanının yanı sıra yalnızca bazal ortamla büyütülen ilgili kontrollerini ifade eder.
      4. Her kültür zaman noktasının sonunda, ince uçlu cımbız kullanarak peletleri toplayın ve bunları 24 oyuklu bir plakaya yerleştirin. Proteoglikanların ve glikozaminoglikanların histolojik kesiti ve boyanması için devam edin (adım 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        NOT: Her pelet ayrı bir kuyuda işlenir.
      5. Peletleri 2 mL %10 tamponlu formaldehit içinde 30 dakika sabitleyin. Formaldehit çözeltisini atın ve 2 mL %70 etanol ekleyin. Bir uç kullanarak peleti konik tüpten çıkarın ve peletleri parafine gömün.
      6. Dönen bir parafin mikrotomu kullanarak 5 μm histolojik kesitler yapın. Bölümleri 60 ° C'de 15 dakika inkübe edin ve iki kez ksilene batırın (5 ve 15 dakika).
      7. Histolojik bölümleri her biri 2 dakika boyunca azalan konsantrasyonlarda (%100, %96, %80 ve %70) alkol banyolarına daldırarak numuneleri yeniden sulandırın, ardından 5 dakika deiyonize su ile durulayın.
      8. Numuneleri 30 dakika boyunca asetik asit, pH 2.5 içinde% 1 Alcian mavisi ile boyamaya devam edin.
      9. Hematoksilen ile 1 dakika boyunca lekeleyin ve damıtılmış su ile yıkayın. DPX (histoloji için montaj antı) veya başka bir montaj solüsyonu ile monte edin ve optik mikroskop kullanarak numuneleri görselleştirin.

Sonuçlar

Burada sunulan protokole göre yağ dokusundan ekstrakte edilen hücreler, ISCT tarafından önerilen MSC'ler için minimum kriterlere uyan morfoloji gösterdi. Protokole genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir. Fenotipik olarak, ADSC'ler hücre kültürünün ilk günlerinde plastik ve fibroblast benzeri morfolojiye bağlılık göstermiştir (Şekil 2A). Ayrıca homojen bir şekilde büyüdüler ve koloniler oluşturdular. Ayrıca, ADSC'ler hematopoiet...

Tartışmalar

MSC'ler farklı dokulardan çıkarılabilir. Kemik iliği hem murinlerde hem de insanlarda ortak bir MSC kaynağını temsil etmesinerağmen 25,26, MSC'lerdeki zenginliği, vücuttaki dağılımı ve ona erişim kolaylığı nedeniyle bu çalışmada yağ dokusu ile çalışmayı seçtik. Alternatif olarak, adipoz kaynaklı kök hücreler, MSC'ler benzeri ölümsüzleştirilmiş hücreler üretmek için kullanılabilir27.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) ve Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11) tarafından sağlanan bir hibe ile desteklenen araştırma. Bu çalışma kısmen PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85) tarafından finanse edilmiştir. MGAG ve URS, sırasıyla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) ve Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) tarafından verilen burs sayesinde.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
140 °C High Heat Sterilization CO2 IncubatorRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acetic acid glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in water
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acidSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNot applicable1 unit
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Cell culture plates (6-well)Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic mediumStem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life TechnologiesA1007101TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type IILife Technologies, California, USA17101015
cork or styrofoam board covered with aluminumNot applicable1 unit
cottonNot applicable50 g
DexamethasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Dissecting scissorNot applicable03 units sterile
DPX Mountant for histologySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldehydeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)Not applicable5 units
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamberSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645540Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)Merck, Darmstadt, GermanyZ717401Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645516Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910.5% in isopropanol
ParaffinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48, in block form
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 units sterile
scalpel (optional)Not applicable1 unit
Silver nitrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Surgical tweezer (15 cm)Not applicable3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
syringe (1 mL)Not applicable1 unit
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)

Referanslar

  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22 (2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306 (2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67 (2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187 (2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234 (2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484 (2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891 (2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206 (2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272 (2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621 (2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635 (2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433 (2021).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Anahtar Kelimeler Mezenkimal K k H crelerMKH lerYa DokusuEpididimal Ya Dokusuzolasyonn Vitro EkspansiyonKarakterizasyonFlow SitometriOsteojenik Farkl la maAdipojenik Farkl la maKondrojenik Farkl la maH cre Bazl TedaviAllojenik Transplant

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır