小鼠附睾脂肪组织中间充质干细胞的分离、体外扩增和表征

摘要

脂肪组织是间充质干细胞的极好来源。在这里，我们带来了从瑞士小鼠附睾脂肪组织中逐步提取、培养和表征脂肪组织衍生干细胞 （ADSC） 的过程。

摘要

间充质干细胞 （MSCs） 作为一种新的治疗方法已被广泛研究，主要用于阻止炎症加剧，因为它们具有调节免疫反应的潜力。间充质干细胞是一种免疫特权细胞，能够在免疫互容的同种异体移植受者中存活，这些受体基于 I 类主要组织相容性复合物 （MHC） 分子的低表达以及使用基于细胞的疗法进行同种异体移植。这些细胞可以从多种组织中分离出来，最常用的是骨髓和脂肪组织。我们提供了一种简单的方案来分离、培养和表征小鼠附睾脂肪组织中的 MSC。附睾脂肪组织通过手术切除，物理破碎，并用 0.15% II 型胶原酶溶液消化。然后，在 体外培养和扩增原代脂肪组织来源的干细胞（ADSC）细胞，并通过流式细胞术进行表型表征。我们还提供了将ADSC分化为成骨细胞、产脂细胞和软骨生成细胞的步骤，然后对每个细胞谱系进行功能表征。此处提供的方案可用于 体内 和 离体 实验，作为替代方案，脂肪来源的干细胞可用于产生MSCs样永生化细胞。

引言

间充质干细胞 （MSC） 是分化成成骨细胞、软骨母细胞和脂肪细胞等细胞的成体多潜能细胞 ^1,2。这些细胞存在于多个器官中，因此，它们可以从骨髓、肌肉、脂肪、毛囊、牙根、胎盘、真皮、软骨膜、脐带、肺、肝脏和脾脏等成人组织中提取 ^3,4。

间充质干细胞对生理学和免疫系统的影响已有报道 ^5,6。这些细胞在人类和兽医学中都有望治疗多种疾病。间充质干细胞可以通过不同的机制控制炎症并促进血管生成和组织稳态，例如细胞间接触、可溶性因子和小细胞外囊泡 7,8,9,10。此外，间充质干细胞是免疫特权细胞，能够在免疫不相容的同种异体移植受体中存活，因为这些细胞显示出 I 类主要组织相容性复合体 （MHC） 分子的低表达，并且用于基于细胞的同种异体移植疗....

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研究方案

所有动物实验均根据国际动物伦理准则进行，并由圣克鲁斯州立大学护理和使用机构委员会根据协议编号021/22批准。瑞士雄性小鼠（6-8周）购自动物育种，维护和实验实验室 - 圣克鲁斯州立大学（LaBIO-UESC）动物研究设施，维持在特定的无病原体条件下，自由接受水和食物，12小时光/暗循环。

注意:可以使用其他小鼠谱系;我们建议使用成年小鼠（6-8周），因为它们具有更发达的脂肪组织和具有高增殖活性的细胞。

1. 准备工作

注意:在继续之前，请准备以下所述的试剂。有关试剂和材料供应商信息，请参阅 材料表 。在所有实际程序中都必须佩戴个人防护设备，例如口罩、帽子、实验室外套和手套。

1. 附睾脂肪组织摘除术
   1. 预留手术材料:三套无菌镊子和剪刀、五根针头和一个装有 200 mL 70% 乙醇的烧杯。
   2. 准备终末麻醉剂，混合氯胺酮（100mg / kg）和甲苯噻嗪（10mg / kg）。
2. ADSCs文化
   1. 基础培养基:制备补充有 10% 胎牛血清 （FBS）、50 μg/mL 庆大霉素、0.25 μg/mL 两性霉素 B、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 Dulbecco 改良 Eag....

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结果

根据此处介绍的方案从脂肪组织中提取的细胞显示出符合ISCT提出的MSCs最低标准的形态。该协议的概述如图 1 所示。从表型上看，ADSCs在细胞培养的第一天表现出对塑料和成纤维细胞样形态的粘附（图2A）。此外，它们均匀生长并形成殖民地。此外，ADSCs的造血标志物CD34（2.12%）和CD45（1.81%）表达低，CD71（42.6%）、CD29（74.2%）和CD90（55.1%）均为间充质细?.......

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讨论

间充质干细胞可以从不同的组织中提取。尽管骨髓在小鼠和人类中都是间充质干细胞的常见来源^25,26，^但我们选择在这项研究中使用脂肪组织，因为它富含间充质干细胞、在体内的分布以及易于获取。作为一种替代方案，脂肪来源的干细胞可用于产生MSCs样永生化细胞²⁷。

对于此处共享的协议的成功，提取的一些要?.......

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)