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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Il tessuto adiposo è un'ottima fonte di cellule staminali mesenchimali. Qui, portiamo l'estrazione, la coltivazione e la caratterizzazione passo dopo passo di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) da topi svizzeri tessuto adiposo epididimale.

Abstract

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono state ampiamente studiate come nuovo approccio terapeutico, principalmente per fermare l'infiammazione esacerbata grazie al loro potenziale di modulare la risposta immunitaria. Le MSC sono cellule immuno-privilegiate in grado di sopravvivere in riceventi di trapianto allogenico immunologicamente incompatibili sulla base di una bassa espressione di molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e nell'uso della terapia cellulare per il trapianto allogenico. Queste cellule possono essere isolate da diversi tessuti, i più comunemente usati sono il midollo osseo e i tessuti adiposi. Forniamo un protocollo semplice per isolare, coltivare e caratterizzare le MSC dal tessuto adiposo epididimo dei topi. Il tessuto adiposo dell'epididimo viene asportato chirurgicamente, frammentato fisicamente e digerito con una soluzione di collagenasi di tipo II allo 0,15%. Quindi, le cellule staminali primarie derivate dal tessuto adiposo (ADSC) vengono coltivate ed espanse in vitro e la caratterizzazione fenotipica viene eseguita mediante citometria a flusso. Forniamo anche i passaggi per differenziare le ADSC in cellule osteogeniche, adipogeniche e condrogeniche, seguite dalla caratterizzazione funzionale di ciascuna linea cellulare. Il protocollo qui fornito può essere utilizzato per esperimenti in vivo ed ex vivo e, in alternativa, le cellule staminali di derivazione adiposa possono essere utilizzate per generare cellule immortalizzate simili alle MSC.

Introduzione

Le cellule staminali mesenchimali (MSC) sono cellule multipotenziali adulte che si differenziano in cellule come osteoblasti, condroblasti e adipociti 1,2. Queste cellule risiedono in diversi organi e, per questo motivo, possono essere estratte da tessuti adulti come midollo osseo, muscoli, grasso, follicolo pilifero, radice dei denti, placenta, derma, pericondrio, cordone ombelicale, polmone, fegato e milza 3,4.

Gli effetti delle MSC sulla fisiologia e sul sistema immunitario sono stati riportati 5,6. Queste cellule sono state promettenti per il trattamento di diverse malattie, sia in medicina umana che veterinaria. Le MSC possono controllare l'infiammazione e promuovere l'angiogenesi e l'omeostasi tissutale attraverso diversi meccanismi, come il contatto cellula-cellula, i fattori solubili e le piccole vescicole extracellulari 7,8,9,10. Inoltre, le MSC sono cellule immuno-privilegiate in grado di sopravvivere in riceventi di trapianto allogenico immunologicamente incompatibili perché queste cellule mostrano una bassa espressione di molecole del complesso maggiore di istocompatibilità (MHC) di classe I e sono utilizzate nella terapia cellulare per il trapianto allogenico11,12. La bassa immunogenicità combinata con il potenziale rigenerativo rende le MSC candidate ideali per la terapia cellulare, come la malattia del trapianto contro l'ospite (GvHD)13, il lupus eritematoso sistemico (LES)14 e la sclerosi multipla15, tra le altre16,17.

Nonostante il fatto che le MSC risiedano in diversi tessuti adulti, il tessuto adiposo offre vantaggi rispetto ad altre fonti, come l'accessibilità per il prelievo, con un intervento chirurgico minimo; gran numero di celle disponibili con alto tasso di espansione; e facile espansione in vitro utilizzando un protocollo facile da eseguire senza la necessità di apparecchiature specifiche e materiali a basso costo 18,19,20. Una volta estratte, le cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC) devono essere caratterizzate come stabilito dalla Società Internazionale per la Terapia Cellulare (ISCT)21. Pertanto, le MSC devono mostrare una morfologia fibroblastica, aderenza alla coltura plastica, esprimendo un'alta percentuale (≥95%) di marcatori mesenchimali come l'endoglina (CD105), l'ecto-5'-nucleotidasi (CD73) e Thy-1 (CD90) e una bassa percentuale (≤2%) di marcatori ematopoietici come l'antigene comune leucocitario (CD45), la fosfoglioglicoproteina transmembrana (CD34), la glicoproteina di membrana ancorata ai glicolipidi (CD14), l'integrina alfa M (CD11b), la catena alfa associata al complesso del recettore dell'antigene delle cellule B (CD79α) o Antigene di superficie dei linfociti B B4 (CD19) e antigene leucocitario umano di classe II (HLA-II). Inoltre, è necessaria una caratterizzazione funzionale e le cellule dovrebbero essere in grado di differenziarsi in cellule di osteoblasti, condroblasti o adipoblasti21.

Qui, mostriamo come ottenere le MSCs dal tessuto adiposo dell'epididimo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica per studi in vitro e la caratterizzazione morfologica preconizzata da ISCT.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo le linee guida internazionali per l'etica animale e sono stati approvati dai comitati istituzionali di cura e uso dell'Università Statale di Santa Cruz con il numero di protocollo 021/22. I topi maschi svizzeri (6-8 settimane) sono stati acquistati presso il Laboratorio di Allevamento Animale, Mantenimento e Sperimentazione - Animal Research Facility dell'Università Statale di Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantenuti in specifiche condizioni prive di agenti patogeni, ricevendo acqua e cibo ad libitum con cicli luce/buio di 12 ore.

NOTA: È possibile utilizzare altri lignaggi di topi; Si consiglia l'uso di topi adulti (6-8 settimane) poiché hanno tessuto adiposo più sviluppato e cellule con elevata attività proliferativa.

1. Preparazione

NOTA: Prima di procedere, preparare i seguenti reagenti descritti di seguito. Vedere la Tabella dei materiali per informazioni sui reagenti e sui fornitori di materiali. I dispositivi di protezione individuale come maschere, berretti, camici da laboratorio e guanti devono essere indossati in tutte le procedure pratiche.

  1. Estrazione del tessuto adiposo epididimo
    1. Riserva il materiale chirurgico: tre set di pinzette e forbici sterili, cinque aghi e un becher contenente 200 ml di etanolo al 70%.
    2. Preparare un anestetico terminale, mescolando ketamina (100 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg).
  2. Cultura ADSC
    1. Terreno basale: Preparare il terreno ad alto contenuto di glucosio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 50 μg/mL di gentamicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B, 100 U/mL di penicillina e 100 mg/mL di streptomicina.
    2. Soluzione digestiva: Preparare lo 0,15% di collagenasi di tipo II in PBS sterilizzato in un filtro da 0,25 μm.
      NOTA: Non è necessario utilizzare i quattro antibiotici descritti nel terreno basale. Dipenderà dalle condizioni di coltura cellulare del laboratorio in cui viene eseguita.
  3. Caratterizzazione fenotipica delle ADSC
    1. Preparare l'albumina sierica bovina (BSA) all'1% in PBS.
    2. Diluire gli anticorpi anti-topo come indicato nella Tabella 1.
    3. Preparare il 2% di formaldeide in PBS.
  4. Differenziazione osteogenica delle ADSC
    1. Terreno di differenziazione osteogenico: Preparare DMEM integrato con acido ascorbico 5,67 M, desametasone 10 nM, β-glicerofosfato 0,02 M, FBS al 10% e penicillina/streptomicina all'1%.
    2. Per la colorazione di Von Kossa, preparare le seguenti soluzioni: 70% di etanolo in acqua, 5% di nitrato d'argento in acqua, acqua distillata, 5% di tiosolfato di sodio in acqua e 1% di eosina B in acqua.
  5. Differenziazione adipogenica:
    1. Terreno di differenziazione adipogenico: Preparare DMEM integrato con 0,5 mM di 3-isobutilil-1-metilxantina, 200 μM di indometacina, 1 μM di desametasone, 10 μM di insulina, 10% di FBS e 1% di penicillina/streptomicina.
    2. Per la colorazione con olio rosso, preparare le seguenti soluzioni: 10% di formalina in acqua deionizzata, 60% di isopropanolo in acqua deionizzata, lisocromo (colorante liposolubile) colorante diazo (soluzione di olio rosso O) in isopropanolo al 60% e ematossilina all'1% in acqua deionizzata.
  6. Differenziazione condrogenica:
    1. Terreno di differenziazione condrogenica: Preparare un terreno condrogenico integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina/streptomicina.
    2. Preparare il 10% di formaldeide in PBS.
    3. Per la colorazione di proteoglicani e glicosaminoglicani, preparare le seguenti soluzioni: colorazione di eteroglicani (Alcian Blue 1%) in acido acetico, pH 2,5, paraffina, ematossilina, diluizione della serie di etanolo in acqua (100%, 96%, 80% e 70%).

Anticorpo/fluoroforoDiluizioneCloneConcentrazione finale (μg/mL)Funzione e cellula in cui è espresso
CD34- PE1:100RAM342Fattore di adesione cellulare. Cellule staminali ematopoietiche.
CD45- APC1:10030-F112Assistenza nell'attivazione dei leucociti. Espresso nei leucociti.
CD71- FITC1:100C25Controlla l'assorbimento del ferro durante la proliferazione cellulare. Cellule proliferanti, reticolociti e cellule precursori.
CD29- FITC1:100Ha2/55Adesione e attivazione, embriogenesi, leucociti, cellule dendritiche, piastrine, mastociti, fibroblasti e cellule endoteliali.
CD90- PerCP1:100OX-72Segnalazione, adesione. Linfociti T, NK, monociti, cellule staminali ematopoietiche, neurone e fibroblasti.

Tabella 1: Anticorpi utilizzati per la caratterizzazione fenotipica delle ADSC mediante citometro a flusso. Elenco degli anticorpi con i rispettivi fluorocromi, diluizioni, clone e concentrazione finale, nonché la loro funzione nella cellula che viene espressa.

2. Metodi

NOTA: Il tessuto adiposo è distribuito in tutto il corpo in sedi sottocutanee o intra-addominali. Nei topi, i tessuti adiposi più comuni utilizzati per gli esperimenti includono l'epididimo sottocutaneo, il mesenterico e il retroperitoneale22. Qui vengono mostrati i passaggi per ottenere il tessuto adiposo epididimo (Figura 1).

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Figura 1: Disegno sperimentale per ottenere cellule staminali derivate dal tessuto adiposo da topi svizzeri. (A) Utilizzando aghi, posizionare l'animale sul pannello di sughero o polistirolo; (B) Sollevare la pelle usando una pinzetta, fare un taglio al centro della regione addominale e staccare la pelle dal peritoneo; (C) identificare il tessuto adiposo bianco sopra l'epididimo; (D) trasferire il tessuto in un terreno DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici, lavare accuratamente il tessuto adiposo dell'epididimo con PBS e trasferire il tessuto nella soluzione digestiva; (E), frammentare il tessuto e (F) incubare a 37 °C per 1 ora agitando energicamente ogni 10 minuti; (G) dopo aver contato le cellule, impiattare in piastre a 6 pozzetti e osservare la morfologia cellulare al microscopio invertito. (F) La morfologia cellulare cambierà da rotonda a fibroblastica. Barra della scala = 22,22 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

  1. Estrazione del tessuto adiposo epididimo
    NOTA: Tenere presente che tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa a flusso laminare per garantire una coltura cellulare pura e priva di contaminazioni.
    1. Eutanasia degli animali utilizzando una soluzione di ketamina e xilazina (100 e 10 mg/kg, come descritto al punto 1.1.2) per via intraperitoneale.
      NOTA: È possibile utilizzare altri metodi di eutanasia23. Assicurati che l'animale sia morto confermando l'assenza di battito cardiaco.
    2. Posizionare l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto su una tavola di sughero o polistirolo ricoperta di un foglio di alluminio e fissarlo con aghi sterili (Figura 1A).
      NOTA: Per evitare contaminazioni, spruzzare alcol al 70% nella regione addominale. In alternativa, radere i capelli con un bisturi.
    3. Sollevare la pelle usando una pinzetta al centro della regione addominale e fare un taglio con le forbici sterili.
      NOTA: Sono necessari due set di pinzette e forbici sterili per evitare la contaminazione. Il primo serve per aprire l'animale, tagliando la pelle e lo strato peritoneale; il secondo serve a prelevare il tessuto adiposo dell'epididimo . Inoltre, riserva 150 ml di alcol al 70% in un becher per pulire forbici e pinzette tra un passaggio e l'altro.
    4. Introdurre le forbici sotto la pelle dell'animale e aprirle per staccarle dal peritoneo (Figura 1B). Sollevare lo strato peritoneale con una pinzetta e tagliare con le forbici sterili.
    5. Usa un altro set di pinzette e forbici sterili e identifica l'epididimo sopra i testicoli e il tessuto adiposo bianco sopra l'epididimo. Estrarre l'intero tessuto adiposo dell'epididimo utilizzando una pinzetta sterile, di circa 2 cm di dimensione, e tagliare molto vicino all'epididimo (Figura 1C).
    6. Mettere il grasso in una provetta conica sterile da 50 mL contenente terreno basale e metterlo sul ghiaccio (Figura 1D). Nel cofano, procedere con i passaggi successivi come descritto di seguito.
  2. Isolamento di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)
    NOTA: Processare i campioni in una cappa a flusso laminare di classe biologica II e il personale deve indossare un camice da laboratorio, guanti e maschera chirurgica.
    1. Lavare accuratamente il tessuto adiposo epididimo con PBS.
      NOTA: Questo passaggio è essenziale per rimuovere il sangue e altre particelle dal campione. Il sangue può inibire l'enzima collagenasi di tipo II e compromettere l'esperimento.
    2. Utilizzando una pinzetta sterile, trasferire il tessuto adiposo dell'epididimo in una provetta da 50 mL contenente 15-20 mL di soluzione digestiva, preparata come al punto 1.2.2. Frammentare il tessuto con forbici sterili e incubare il tessuto a 37 °C per 1 ora (Figura 1E, F).
      NOTA: In questa fase è possibile utilizzare un bagno d'acqua o un'incubatrice a 37 °C. Ogni 10 minuti, la sospensione deve essere agitata energicamente per facilitare la digestione. Non prolungare il tempo di incubazione di 1 ora.
    3. Inattivare la collagenasi diluendo il campione 1:1 in terreno basale e centrifugare la sospensione a 250 x g per 10 min a 4 °C per ottenere la frazione vascolare dello stroma. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di terreno basale.
    4. Verificare la vitalità e contare le cellule attraverso il metodo di esclusione del colorante blu di tripano in una camera Neubauer utilizzando una diluizione di 1:10 o 1:100.
      NOTA: La resa attesa è di circa 0,5-1 milione di cellule/g di tessuto adiposo lavorato e la vitalità è dell'80%.
    5. Piastra le cellule isolate (0,3-0,5 milioni) in 3 mL di terreno basale in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare le cellule per una notte a 37 °C con CO2 al 5 %.
    6. Giorno successivo: Togliere il terreno dal pozzetto e lavare le celle con PBS. Aggiungere 3 mL di terreno basale. Ripeti questo processo ogni 2 giorni fino a quando le cellule diventano confluenti al 90%.
      NOTA: Osservare sempre la morfologia delle cellule al microscopio invertito, passando da rotonda a fibroblastica (Figura 1H).
  3. Espansione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)
    NOTA: Una volta che le cellule crescono ~90% confluenti, procedere alla sottocoltura come descritto di seguito.
    1. Rimuovere il terreno dal pozzetto e lavare le celle con PBS. Aggiungere 0,5 mL/pozzetto di tripsina/EDTA (0,05 % tripsina; 200 mg/L EDTA) e incubare la piastra per 3-5 minuti a 37 °C per staccare le cellule.
      NOTA: Non superare i 5 minuti in tripsina/EDTA. Il completo distacco delle cellule deve essere verificato al microscopio invertito. Il processo può essere accelerato pipettando con attenzione su e giù o picchiettando il lato della piastra.
    2. Inattivare l'enzima diluendo il campione 1:1 in DMEM integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotici.
    3. Dividere la sospensione cellulare in 2 pozzetti e aggiungere 3 mL di terreno basale (DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di antibiotici). Incubare per una notte a 37 °C con CO2 al 5%.
    4. Cambiare il fluido il giorno successivo, poi ogni 2 giorni fino alla confluenza del 90%.
    5. Ripetere il processo fino al terzo passaggio e procedere alla caratterizzazione fenotipica e funzionale.
      NOTA: Osservare sempre la morfologia delle cellule al microscopio invertito, passando da rotonda a fibroblastica.
  4. Caratterizzazione delle cellule staminali derivate dal tessuto adiposo (ADSC)
    1. Caratterizzazione fenotipica mediante citometria a flusso
      1. Staccare le celle utilizzando tripsina/EDTA, come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2.
      2. Raccogliere le cellule in una provetta conica (50 mL) e centrifugare a 250 x g per 10 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS.
      3. Contare le cellule come descritto al punto 2.2.4 e seminare 0,5-1 x 106 cellule in 100 μL di PBS in una piastra a 96 pozzetti.
        NOTA: Il numero di pozzetti dipenderà dal colore del coniugato di fluorocromo e dai filtri/laser del citometro.
      4. Aggiungere gli anticorpi (Tabella 1) diluiti in BSA all'1% in PBS.
        NOTA: Non è necessario utilizzare il blocco Fc per evitare il legame aspecifico perché già utilizziamo BSA per diluire gli anticorpi. Riservare un campione di cellule senza ricevere anticorpi che verranno utilizzati come controllo della colorazione. Gli anticorpi possono essere combinati nello stesso pozzetto in base al colorante fluorocromo e al citometro disponibili in laboratorio. Tutti gli anticorpi descritti nella Tabella 1 possono essere aggiunti nello stesso pozzetto, ad eccezione del CD71 FITC e del CD29 FITC, che devono trovarsi in pozzetti diversi a causa dello stesso fluorocromo.
      5. Incubare la piastra per 30 minuti a 4 °C al buio.
      6. Lavare le celle, quindi completare il volume a 200 μl utilizzando PBS, centrifugare la piastra a 252 x g per 10 minuti a 4 °C ed eliminare il surnatante. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
      7. Fissare le cellule aggiungendo 200 μL per pozzetto di formaldeide al 2% in PBS. Conservare le cellule al buio a 4 °C fino all'analisi nel citometro a flusso.
        NOTA: Per ottenere i migliori risultati, acquisire le cellule sul citometro a flusso il prima possibile. La luminosità della fluorescenza dei marcatori diminuisce significativamente dopo 48 ore per la maggior parte dei fluorocromi. Quindi, non superare le 48 ore per leggere la targa. Si consiglia l'acquisizione di 30.000 eventi.
      8. Utilizzare la strategia di gating presentata nella Figura 2B per selezionare la popolazione ASC.
    2. Caratterizzazione funzionale: Differenziamento osteogenico
      1. Staccare le cellule utilizzando tripsina/EDTA (come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2), raccogliere e centrifugare le cellule (come descritto nei passaggi 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contarle (come descritto nei passaggi 2.2.4).
      2. Piastra, in triplice copia, 2 x 105 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti in basale mediale (DMEM integrato con il 10 % di FBS e l'1 % di antibiotici); incubare a 37 °C in CO2 al 5%.
        NOTA: Saranno necessarie due piastre a 6 pozzetti, una per ogni tempo di differenziazione (14 e 21 giorni).
      3. Il giorno successivo, cambiare il terreno con un terreno osteogenico (passaggio 1.4.1).
        NOTA: riservare 3 pozzetti in coltura solo con il terreno basale, che sarà il controllo per la differenziazione.
      4. Colture di cellule per 14 e 21 giorni in terreni osteogenici e cellule di controllo, cambiando terreno ogni 3 giorni. Procedere alla colorazione di Von Kossa (passaggio 1.4.2) per valutare i noduli mineralizzati alla fine di ogni periodo di coltura.
      5. Aspirare il terreno da ogni pozzetto e lavare le cellule due volte con PBS. Fissare le celle con 2 ml di etanolo al 70% per una notte a temperatura ambiente (RT). Lavare accuratamente le celle in acqua corrente.
      6. Aggiungere 2 mL di soluzione di nitrato d'argento al 5% e incubare la piastra in luce ultravioletta per 1 ora. Lavare le celle con acqua distillata. Aggiungere 2 mL di tiosolfato di sodio al 5% e incubare per 5 minuti. Lavare con acqua distillata.
      7. Controcolorante con 2 mL di eosina per 40 s. Lavare con acqua distillata fino a rimuovere la soluzione colorante e visualizzare la colorazione utilizzando un microscopio ottico.
    3. Caratterizzazione funzionale: Differenziamento adipogenico
      1. Staccare le cellule utilizzando tripsina/EDTA (come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2), raccogliere e centrifugare le cellule (come descritto nei passaggi 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contarle (come descritto nei passaggi 2.2.4).
      2. Piastra 2 x 105 cellule per pozzetto in piastre a 6 pozzetti in basale mediale (DMEM integrato con il 10 % di FBS e l'1 % di antibiotici); incubare a 37 °C in CO2 al 5%.
        NOTA: Saranno necessarie due piastre a 6 pozzetti, una per ogni tempo di differenziazione (14 e 21 giorni).
      3. Il giorno successivo, cambiare il terreno in terreno adipogenico (passaggio 2.5.1).
        NOTA: Riservare 3 pozzetti in coltura solo con il terreno basale come controllo.
      4. Coltura di cellule per 14 e 21 giorni in terreno adipogenico, cambiando terreno ogni 3 giorni. Al termine di ogni periodo di coltura, procedere alla colorazione Oil-Red O (passaggi 2.4.3.5-2.4.3.7), un indicatore dell'accumulo di lipidi intracellulari.
      5. Aspirare il terreno da ogni pozzetto. Lavare le celle due volte con PBS. Fissare le cellule in 2 mL di formalina al 10% per 1 ora. Lavare una volta con PBS e poi una volta con acqua.
      6. Colorare con 2 mL di soluzione di Olio-Rosso O in isopropanolo al 60% per 5 minuti. Lavare una volta con acqua distillata.
      7. Controcolorante con 2 mL di ematossilina all'1% diluita 1:2 in acqua distillata per 1 min. Lavare con acqua distillata fino a rimuovere la soluzione colorante e visualizzare i campioni colorati utilizzando un microscopio ottico.
    4. Caratterizzazione funzionale: Differenziazione condrogenica
      1. Staccare le cellule utilizzando tripsina/EDTA (come descritto nei passaggi da 2.3.1 a 2.3.2), raccogliere e centrifugare le cellule (come descritto nei passaggi 2.4.1.2 e 2.4.1.2) e contarle (come descritto nei passaggi 2.2.4).
      2. Mettere 5 x 105 ADSC in quattro provette coniche in polipropilene e centrifugare a 450 x g per 5 minuti per formare un pellet. Scartare il surnatante.
      3. Coltura dei pellet in una provetta conica in un mezzo condrogenico (fase 1.6.1) o solo terreno basale (controllo della differenziazione) per 14 e 21 giorni a 37 °C in CO2 al 5%. Cambiare il fluido ogni 3 giorni ed evitare di rimuovere i pellet.
        NOTA: Ogni pellet cellulare si riferisce a ciascun periodo di coltura, nonché ai rispettivi controlli coltivati solo con terreno basale.
      4. Alla fine di ogni punto di coltura, raccogli i pellet usando una pinzetta a punta fine e mettili in una piastra a 24 pozzetti. Procedere con il sezionamento istologico e la colorazione dei proteoglicani e dei glicosaminoglicani (passaggi 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        NOTA: Ogni pellet viene lavorato in un pozzetto separato.
      5. Fissare i pellet in 2 mL di formaldeide tamponata al 10% per 30 min. Scartare la soluzione di formaldeide e aggiungere 2 ml di etanolo al 70%. Rimuovere il pellet dal tubo conico utilizzando una punta e incorporare i pellet nella paraffina.
      6. Utilizzando un microtomo di paraffina rotante, eseguire sezioni istologiche di 5 μm. Incubare le sezioni per 15 minuti a 60 °C e immergerle due volte in xilene (per 5 e 15 minuti).
      7. Reidratare i campioni immergendo le sezioni istologiche in bagni di alcol a concentrazioni decrescenti (100%, 96%, 80% e 70%) per 2 minuti ciascuno, quindi risciacquare con acqua deionizzata per 5 minuti.
      8. Procedere alla colorazione dei campioni con blu di Alcian 1% in acido acetico, pH 2,5, per 30 minuti.
      9. Controcolorare con ematossilina per 1 minuto e lavare con acqua distillata. Monta con DPX (montante per istologia) o un'altra soluzione di montaggio e visualizza i campioni utilizzando un microscopio ottico.

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Risultati

Le cellule estratte dal tessuto adiposo secondo il protocollo qui presentato hanno mostrato una morfologia che corrisponde ai criteri minimi per le MSC proposti dall'ISCT. Una panoramica del protocollo è mostrata nella Figura 1. Fenotipicamente, le ADSC hanno mostrato aderenza alla morfologia plastica e fibroblastica nei primi giorni di coltura cellulare (Figura 2A). Inoltre, sono cresciuti in modo omogeneo e hanno formato colonie. Inoltre, le ADSC hanno mostra...

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Discussione

Le MSC possono essere estratte da diversi tessuti. Nonostante il midollo osseo rappresenti una fonte comune di MSC sia nei murini che nell'uomo25,26, abbiamo scelto di lavorare con il tessuto adiposo in questo studio per la sua ricchezza di MSC, la distribuzione nel corpo e la facilità di accesso. In alternativa, le cellule staminali di derivazione adiposa possono essere utilizzate per generare cellule immortalizzate simili alle MSC27.

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Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Ricerca sostenuta da una sovvenzione del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) e della Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Questo studio è stato finanziato in parte dal PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG e URS grazie alla borsa di studio concessa rispettivamente dalla Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e dalla Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).

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Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
140 °C High Heat Sterilization CO2 IncubatorRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acetic acid glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in water
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acidSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNot applicable1 unit
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Cell culture plates (6-well)Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic mediumStem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life TechnologiesA1007101TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type IILife Technologies, California, USA17101015
cork or styrofoam board covered with aluminumNot applicable1 unit
cottonNot applicable50 g
DexamethasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Dissecting scissorNot applicable03 units sterile
DPX Mountant for histologySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldehydeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)Not applicable5 units
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamberSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645540Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)Merck, Darmstadt, GermanyZ717401Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645516Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910.5% in isopropanol
ParaffinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48, in block form
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 units sterile
scalpel (optional)Not applicable1 unit
Silver nitrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Surgical tweezer (15 cm)Not applicable3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
syringe (1 mL)Not applicable1 unit
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)

Riferimenti

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