Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

Resumen

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) han sido ampliamente estudiadas como un nuevo enfoque terapéutico, principalmente para detener la inflamación exacerbada debido a su potencial para modular la respuesta inmune. Las MSC son células inmunoprivilegiadas capaces de sobrevivir en receptores de trasplantes alogénicos inmunológicamente incompatibles basados en la baja expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y en el uso de terapia basada en células para el trasplante alogénico. Estas células se pueden aislar de varios tejidos, siendo los más utilizados la médula ósea y los tejidos adiposos. Proporcionamos un protocolo sencillo para aislar, cultivar y caracterizar MSC a partir de tejido adiposo epididimario de ratones. El tejido adiposo del epidídimo se extirpa quirúrgicamente, se fragmenta físicamente y se digiere con una solución de colagenasa tipo II al 0,15%. A continuación, se cultivan y expanden in vitro células madre derivadas de tejido adiposo primario (ADSC), y se realiza la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo. También proporcionamos los pasos para diferenciar las ADSC en células osteogénicas, adipogénicas y condrogénicas, seguidas de la caracterización funcional de cada linaje celular. El protocolo proporcionado aquí se puede utilizar para experimentos in vivo y ex vivo y, como alternativa, las células madre derivadas del tejido adiposo se pueden utilizar para generar células inmortalizadas similares a las MSC.

Introducción

Las células madre mesenquimales (MSC) son células adultas multipotenciales que se diferencian en células como osteoblasto, condroblasto y adipocito ^1,2. Estas células residen en varios órganos, por lo que pueden extraerse de tejidos adultos como la médula ósea, el músculo, la grasa, el folículo piloso, la raíz del diente, la placenta, la dermis, el pericondrio, el cordón umbilical, el pulmón, el hígado y el bazo ^3,4.

Se han descrito los efectos de las MSCs sobre la fisiología y el sistema inmune ^5,6. Estas células han sido prometedoras para el tratamiento de varias enfermedades, tanto en medicina humana como veterinaria. Las MSCs pueden controlar la inflamación y promover la angiogénesis y la homeostasis tisular a través de diferentes mecanismos, como el contacto célula-célula, los factores solubles y las pequeñas vesículas extracelulares 7,8,9,10. Además, las MSCs son células inmunoprivilegiadas capaces de sobrevivir en receptores de trasplantes alogénicos inmunológicamente incompatibles, ya que estas células muestran una baja expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y se utilizan en la terapia celular para el trasplante alogénico^11,12. La baja inmunogenicidad combinada con el potencial regenerativo hace que las MSC sean candidatas ideales para la terapia celular, como la enfermedad de injerto contra huésped (EICH)¹³, el lupus eritematoso sistémico (LES)¹⁴ y la esclerosis múltiple15, entre^otras16,17.

A pesar de que las MSC residen en varios tejidos adultos, el tejido adiposo ofrece ventajas sobre otras fuentes, como la accesibilidad para la recolección, con una intervención quirúrgica mínima; gran número de celdas disponibles con alta tasa de expansión; y fácil expansión in vitro mediante un protocolo fácil de realizar sin necesidad de equipos específicos y materiales de bajo costo 18,19,20. Una vez extraídas, las células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) deben ser caracterizadas según lo establecido por la Sociedad Internacional de Terapia Celular (ISCT)²¹. Así, las MSC deben mostrar una morfología similar a la de los fibroblastos, adherencia al cultivo plástico, expresando un alto porcentaje (≥95%) de marcadores mesenquimales como endoglina (CD105), ecto-5'-nucleotidasa (CD73) y Thy-1 (CD90), y bajo porcentaje (≤2%) de marcadores hematopoyéticos como el antígeno común leucocitario (CD45), la fosfoglicoproteína transmembrana (CD34), la glicoproteína de membrana anclada a glicolípidos (CD14), la integrina alfa M (CD11b), la cadena alfa de la proteína asociada al complejo de antígenos de células B (CD79α) o Antígeno de superficie de linfocitos B B4 (CD19) y antígeno leucocitario humano de clase II (HLA-II). Además, se requiere una caracterización funcional y las células deben ser capaces de diferenciarse en células osteoblásticas, condroblastas o adipoblastas²¹.

En este trabajo se muestra cómo obtener las MSCs a partir de tejido adiposo del epidídimo mediante disociación mecánica y digestión enzimática para estudios in vitro y la caracterización morfológica preconizada por ISCT.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los lineamientos internacionales de ética animal y fueron aprobados por comités institucionales de cuidado y uso de la Universidad Estatal de Santa Cruz bajo el protocolo número 021/22. Se adquirieron ratones machos suizos (6-8 semanas) del Laboratorio de Crianza, Mantenimiento y Experimentación Animal del Centro de Investigación Animal de la Universidad Estatal de Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos, recibiendo agua y alimento ad libitum con ciclos de luz/oscuridad de 12 h.

NOTA: Se puede utilizar otro linaje de ratones; Recomendamos el uso de ratones adultos (6-8 semanas) ya que tienen más desarrollado tejido adiposo y células con alta actividad proliferativa.

1. Preparación

NOTA: Antes de continuar, prepare los siguientes reactivos que se describen a continuación. Consulte la Tabla de materiales para obtener información sobre el proveedor de reactivos y materiales. Se debe usar equipo de protección personal como mascarillas, gorras, batas de laboratorio y guantes en todos los procedimientos prácticos.

1. Extracción de tejido adiposo epididimario
   1. Reserve los materiales quirúrgicos: tres juegos de pinzas y tijeras estériles, cinco agujas y un vaso de precipitados que contenga 200 ml de etanol al 70%.
   2. Prepare un anestésico terminal, mezclando ketamina (100 mg/kg) y xilacina (10 mg/kg).
2. Cultura de los ADSC
   1. Medio basal: Prepare el medio de alta glucosa Modified Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), 50 μg/mL de gentamicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 100 U/mL de penicilina y 100 mg/mL de estreptomicina.
   2. Solución de digestión: Preparar 0,15% de colagenasa tipo II en PBS esterilizado en un filtro de 0,25 μm.
      NOTA: No es necesario utilizar los cuatro antibióticos descritos en el medio basal. Dependerá de las condiciones de cultivo celular del laboratorio donde se realice.
3. Caracterización fenotípica de ADSCs
   1. Preparar albúmina sérica bovina (BSA) al 1% en PBS.
   2. Diluir los anticuerpos anti-ratón como se menciona en la Tabla 1.
   3. Prepare formaldehído al 2% en PBS.
4. Diferenciación osteogénica de ADSCs
   1. Medio de diferenciación osteogénica: Preparar DMEM suplementado con ácido ascórbico 5,67 M, dexametasona 10 nM, β-glicerofosfato 0,02 M, FBS al 10% y penicilina/estreptomicina al 1%.
   2. Para la tinción de Von Kossa, prepare las siguientes soluciones: 70% de etanol en agua, 5% de nitrato de plata en agua, agua destilada, 5% de tiosulfato de sodio en agua y 1% de eosina B en agua.
5. Diferenciación adipogénica:
   1. Medio de diferenciación adipogénico: Preparar DMEM suplementado con 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina, 200 μM de indometacina, 1 μM de dexametasona, 10 μM de insulina, 10% de FBS y 1 % de penicilina/estreptomicina.
   2. Para la tinción de rojo aceite, prepare las siguientes soluciones: 10% de formalina en agua desionizada, 60% de isopropanol en agua desionizada, colorante diazo de lisocromo (colorante soluble en grasa) (solución de aceite rojo O) en 60% de isopropanol y 1% de hematoxilina en agua desionizada.
6. Diferenciación condrogénica:
   1. Medio de diferenciación condrogénico: Prepare medio condrogénico suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina/estreptomicina.
   2. Prepare formaldehído al 10% en PBS.
   3. Para la tinción de proteoglicanos y glicosaminoglicanos, prepare las siguientes soluciones: Tinción de heteroglicanos (azul alcián 1%) en ácido acético, pH 2,5, parafina, hematoxilina, dilución de la serie de etanol en agua (100%, 96%, 80% y 70%).

Anticuerpo/Fluoróforo	Dilución	Clon	Concentración final (μg/mL)	Función y célula en la que se expresa
CD34- PE	1:100	RAM34	2	Factor de adhesión celular. Células madre hematopoyéticas.
CD45- APC	1:100	30-F11	2	Asistencia en la activación de leucocitos. Se expresa en los leucocitos.
CD71- FITC	1:100	C2	5	Controla la absorción de hierro durante la proliferación celular. Células proliferantes, reticulocitos y células precursoras.
CD29- FITC	1:100	Ha2/5	5	Adhesión y activación, embriogénesis, leucocitos, células dendríticas, plaquetas, mastocitos, fibroblastos y células endoteliales.
CD90- PerCP	1:100	OX-7	2	Señalización, adhesión. Linfocito T, NK, monocitos, células madre hemtopoyéticas, neurona y fibroblastos.

Tabla 1: Anticuerpos utilizados para la caracterización fenotípica de ADSCs mediante citómetro de flujo. Lista de anticuerpos con sus respectivos fluorocromos, diluciones, clon y concentración final, así como su función en la célula que se expresa.

2. Métodos

NOTA: El tejido adiposo se distribuye por todo el cuerpo en localizaciones subcutáneas o intraabdominales. En ratones, los tejidos adiposos más comunes utilizados para los experimentos incluyen el epidídimo subcutáneo, el mesentérico y el retroperitoneal²². Aquí se muestran los pasos para la obtención de tejido adiposo epididimario (Figura 1).

Figura 1: Diseño experimental para la obtención de células madre derivadas de tejido adiposo a partir de ratones suizos. (A) Usando agujas, coloque el animal sobre el tablero de corcho o espuma de poliestireno; (B) Levante la piel con pinzas, haga un corte en el centro de la región abdominal y separe la piel del peritoneo; (C) identificar el tejido adiposo blanco por encima del epidídimo; (D) transferir el tejido a un medio DMEM suplementado con un 10% de FBS y un 1% de antibióticos, lavar minuciosamente el tejido adiposo del epidídimo con PBS y transferir el tejido a la solución de digestión; (E), fragmentar el tejido y (F) incubar a 37 °C durante 1 h agitando vigorosamente cada 10 min; (G) después de contar las células, coloque placas de 6 pocillos y observe la morfología celular bajo un microscopio invertido. (F) La morfología de la célula cambiará de redonda a fibroblasta. Barra de escala = 22,22 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

1. Extracción de tejido adiposo del epidídimo
   NOTA: Tenga en cuenta que todos los procedimientos deben llevarse a cabo en condiciones estériles en una cabina de flujo laminar para garantizar un cultivo celular puro y libre de contaminación.
   1. Eutanasiar a los animales utilizando una solución de ketamina y xilacina (100 y 10 mg/kg, como se describe en el paso 1.1.2) por vía intraperitoneal.
      NOTA: Se pueden utilizar otros métodos de eutanasia²³. Asegúrese de que el animal esté muerto confirmando la ausencia de latidos cardíacos.
   2. Coloque al animal con la cara ventral hacia arriba sobre una tabla de corcho o espuma de poliestireno cubierta con papel de aluminio y fíjelo con agujas estériles (Figura 1A).
      NOTA: Para evitar la contaminación, rocíe alcohol al 70% en la región abdominal. También puedes afeitar el vello con un bisturí.
   3. Levante la piel con unas pinzas en el centro de la región abdominal y haga un corte con tijeras estériles.
      NOTA: Son necesarios dos juegos de pinzas y tijeras estériles para evitar la contaminación. El primero se utiliza para abrir al animal, cortando la piel y la capa peritoneal; El segundo se utiliza para recoger el tejido adiposo del epidídimo. Además, reserve 150 ml de alcohol al 70% en un vaso de precipitados para limpiar tijeras y pinzas entre escalones.
   4. Introducir las tijeras bajo la piel del animal y abrirla para desprenderla del peritoneo (Figura 1B). Levante la capa peritoneal con unas pinzas y corte con tijeras estériles.
   5. Use otro juego de pinzas y tijeras estériles e identifique el epidídimo por encima de los testículos y el tejido adiposo blanco por encima del epidídimo. Extraer todo el tejido adiposo del epidídimo con unas pinzas estériles, de aproximadamente 2 cm de tamaño, y cortar muy cerca del epidídimo (Figura 1C).
   6. Coloque la grasa en un tubo cónico estéril de 50 mL que contenga medio basal y colóquelo en hielo (Figura 1D). En el capó, continúe con los siguientes pasos como se describe a continuación.
2. Aislamiento de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC)
   NOTA: Procese las muestras en una campana de flujo laminar de clase biológica II, y el personal debe usar una bata de laboratorio, guantes y mascarilla quirúrgica.
   1. Lave bien el tejido adiposo del epidídimo con PBS.
      NOTA: Este paso es esencial para eliminar la sangre y otras partículas de la muestra. La sangre puede inhibir la enzima colagenasa tipo II y comprometer el experimento.
   2. Con una pinza estéril, transfiera el tejido adiposo del epidídimo a un tubo de 50 ml que contenga 15-20 ml de solución digestiva, preparada en el paso 1.2.2. Fragmentar el tejido con unas tijeras estériles e incubar el tejido a 37 °C durante 1 h (Figura 1E, F).
      NOTA: En este paso se puede utilizar un baño de agua o una incubadora a 37 °C. Cada 10 min, la suspensión debe agitarse vigorosamente para facilitar la digestión. No prolongue el tiempo de incubación de 1 hora.
   3. Inactivar la colagenasa diluyendo la muestra 1:1 en medio basal y centrifugar la suspensión a 250 x g durante 10 min a 4 °C para obtener la fracción vascular del estroma. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio basal.
   4. Comprobar la viabilidad y contar las células mediante el método de exclusión del colorante azul de tripano en una cámara de Neubauer utilizando una dilución de 1:10 o 1:100.
      NOTA: El rendimiento esperado es de alrededor de 0,5-1 millón de células/g de tejido adiposo procesado y una viabilidad del 80%.
   5. Coloque las células aisladas (0,3-0,5 millones) en 3 mL de medio basal en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar las células durante la noche a 37 °C con 5 % de CO₂.
   6. Al día siguiente: Retire el medio del pocillo y lave las celdas con PBS. Añadir 3 mL de medio basal. Repita este proceso cada 2 días hasta que las células se vuelvan 90% confluentes.
      NOTA: Observe siempre la morfología de las células bajo el microscopio invertido, cambiando de redondas a fibroblastos (Figura 1H).
3. Expansión de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC)
   NOTA: Una vez que las células crezcan ~90% confluentes, proceda al subcultivo como se describe a continuación.
   1. Retire el medio del pocillo y lave las celdas con PBS. Añadir 0,5 mL/pocillo de tripsina/EDTA (0,05 % de tripsina; 200 mg/L de EDTA) e incubar la placa durante 3-5 min a 37 °C para separar las células.
      NOTA: No exceda los 5 min en tripsina/EDTA. El desprendimiento completo de las células debe verificarse bajo el microscopio invertido. El proceso se puede acelerar pipeteando hacia arriba y hacia abajo con cuidado o golpeando el costado de la placa.
   2. Inactivar la enzima diluyendo la muestra 1:1 en DMEM suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de antibióticos.
   3. Divida la suspensión celular en 2 pocillos y agregue 3 mL de medio basal (DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de antibióticos). Incubar durante la noche a 37 °C con 5% de CO₂.
   4. Cambie de medio al día siguiente, luego cada 2 días hasta el 90% de confluencia.
   5. Repetir el proceso hasta el tercer paso y proceder a la caracterización fenotípica y funcional.
      NOTA: Observe siempre la morfología de las células bajo el microscopio invertido, cambiando de redondas a fibroblastas.
4. Caracterización de células madre derivadas de tejido adiposo (ADSC)
   1. Caracterización fenotípica por citometría de flujo
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA, como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2.
      2. Recoja las células en un tubo cónico (50 mL) y centrifugue a 250 x g durante 10 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de PBS.
      3. Cuente las células como se describe en el paso 2.2.4 y siembre 0,5-1 x 10⁶ células en 100 μL de PBS en una placa de 96 pocillos.
         NOTA: El número de pocillos dependerá del color del conjugado de fluorocromo y de los filtros/láseres del citómetro.
      4. Añadir anticuerpos (Tabla 1) diluidos en BSA al 1% en PBS.
         NOTA: No es necesario utilizar el bloque Fc para evitar la unión inespecífica porque ya utilizamos BSA para diluir anticuerpos. Reservar una muestra de células sin recibir anticuerpos que se utilizarán como control de la tinción. Los anticuerpos se pueden combinar en el mismo pocillo de acuerdo con el colorante de fluorocromo y el citómetro disponibles en el laboratorio. Todos los anticuerpos descritos en la Tabla 1 se pueden agregar en el mismo pocillo, excepto el CD71 FITC y el CD29 FITC, que deben estar en pocillos diferentes debido al mismo fluorocromo.
      5. Incubar la placa durante 30 minutos a 4 °C en la oscuridad.
      6. Lave las celdas, complete el volumen a 200 μL con PBS, centrifugue la placa a 252 x g durante 10 min a 4 °C y deseche el sobrenadante. Repita este paso una vez más.
      7. Fije las celdas agregando 200 μL por pocillo de formaldehído al 2% en PBS. Almacene las células en la oscuridad a 4 °C hasta el análisis en el citómetro de flujo.
         NOTA: Para obtener los mejores resultados, adquiera las celdas del citómetro de flujo lo antes posible. El brillo de la fluorescencia de los marcadores decae significativamente después de 48 h para la mayoría de los fluorocromos. Por lo tanto, no exceda las 48 h para leer la placa. Se recomienda la adquisición de 30.000 eventos.
      8. Utilice la estrategia de compuerta que se presenta en la Figura 2B para seleccionar la población de ASC.
   2. Caracterización funcional: Diferenciación osteogénica
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA (como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2), recoja y centrifugue las células (como se describe en los pasos 2.4.1.2 y 2.4.1.2) y cuéntelas (como se describe en los pasos 2.2.4).
      2. Placa, por triplicado, 2 x 10⁵ células por pocillo en placas de 6 pocillos en medial basal (DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de antibióticos); incubar a 37 °C en 5% de CO₂.
         NOTA: Se necesitarán dos placas de 6 pocillos, una para cada tiempo de diferenciación (14 y 21 días).
      3. Al día siguiente, cambie el medio a medio osteogénico (paso 1.4.1).
         NOTA: reservar 3 pozos siendo cultivados únicamente con el medio basal, que será el testigo para la diferenciación.
      4. Cultivo de células durante 14 y 21 días en medios osteogénicos y las células control, cambiando de medio cada 3 días. Proceda a la tinción de Von Kossa (paso 1.4.2) para evaluar los nódulos mineralizados al final de cada período de cultivo.
      5. Aspire el medio de cada pocillo y lave las celdas dos veces con PBS. Fije las celdas con 2 mL de etanol al 70% durante la noche a temperatura ambiente (RT). Lave las celdas cuidadosamente con agua corriente.
      6. Agregue 2 mL de solución de nitrato de plata al 5% e incube la placa en luz ultravioleta durante 1 h. Lave las celdas con agua destilada. Añadir 2 mL de tiosulfato de sodio al 5% e incubar durante 5 min. Lavar con agua destilada.
      7. Contratinción con 2 mL de eosina durante 40 s. Lave con agua destilada hasta que se retire la solución de tinción y visualice la tinción con un microscopio óptico.
   3. Caracterización funcional: Diferenciación adipogénica
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA (como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2), recoja y centrifugue las células (como se describe en los pasos 2.4.1.2 y 2.4.1.2) y cuéntelas (como se describe en los pasos 2.2.4).
      2. Placa 2 x 10⁵ células por pocillo en placas de 6 pocillos en medial basal (DMEM suplementado con 10 % de FBS y 1 % de antibióticos); incubar a 37 °C en 5% de CO₂.
         NOTA: Se necesitarán dos placas de 6 pocillos, una para cada tiempo de diferenciación (14 y 21 días).
      3. Al día siguiente, cambie el medio a medio adipogénico (paso 2.5.1).
         NOTA: Reservar 3 pozos siendo cultivados únicamente con el medio basal como testigo.
      4. Cultivo de células durante 14 y 21 días en medio adipogénico, cambiando de medio cada 3 días. Al final de cada período de cultivo, se procede a la tinción con Oil-Red O (pasos 2.4.3.5-2.4.3.7), un indicador de acumulación de lípidos intracelulares.
      5. Aspire los medios de cada pocillo. Lave las celdas dos veces con PBS. Fijar las células en 2 mL de formalina al 10% durante 1 h. Lave una vez con PBS y luego una vez con agua.
      6. Manchar con 2 mL de solución de Oil-Red O en isopropanol al 60% durante 5 min. Lavar una vez con agua destilada.
      7. Contratinción con 2 mL de hematoxilina al 1% diluida 1:2 en agua destilada durante 1 min. Lavar con agua destilada hasta eliminar la solución de tinción y visualizar las muestras teñidas con un microscopio óptico.
   4. Caracterización funcional: Diferenciación condrogénica
      1. Separe las células utilizando tripsina/EDTA (como se describe en los pasos 2.3.1 a 2.3.2), recoja y centrifugue las células (como se describe en los pasos 2.4.1.2 y 2.4.1.2) y cuéntelas (como se describe en los pasos 2.2.4).
      2. Coloque 5 x 10⁵ ADSC en cuatro tubos cónicos de polipropileno y centrifugue a 450 x g durante 5 minutos para formar un pellet. Deseche el sobrenadante.
      3. Cultivar los gránulos en un tubo cónico en un medio condrogénico (paso 1.6.1) o solo en medio basal (control de la diferenciación) durante 14 y 21 días a 37 °C con 5% de CO₂. Cambie el medio cada 3 días y evite eliminar los pellets.
         NOTA: Cada pellet celular se refiere a cada tiempo de cultivo, así como a sus respectivos controles cultivados únicamente con medio basal.
      4. Al final de cada punto de tiempo de cultivo, recoja los gránulos con pinzas de punta fina y colóquelos en una placa de 24 pocillos. Proceda a la sección histológica y tinción de proteoglicanos y glicosaminoglicanos (pasos 2.4.4.5.-2.4.4.9).
         NOTA: Cada pellet se procesa en un pozo separado.
      5. Fije los pellets en 2 mL de formaldehído tamponado al 10% durante 30 min. Deseche la solución de formaldehído y agregue 2 ml de etanol al 70%. Retire el pellet del tubo cónico con una punta e incruste los pellets en parafina.
      6. Con un micrótomo de parafina giratorio, realice cortes histológicos de 5 μm. Incubar las secciones durante 15 min a 60 °C y sumergirlas dos veces en xileno (durante 5 y 15 min).
      7. Rehidrate las muestras sumergiendo las secciones histológicas en baños de alcohol a concentraciones decrecientes (100%, 96%, 80% y 70%) durante 2 minutos cada una, luego enjuague con agua desionizada durante 5 minutos.
      8. Proceder a teñir las muestras con azul alcián 1% en ácido acético, pH 2,5, durante 30 min.
      9. Contramanchar con hematoxilina durante 1 min y lavar con agua destilada. Móntelo con DPX (montante para histología) u otra solución de montaje y visualice las muestras utilizando un microscopio óptico.

Resultados

Las células extraídas del tejido adiposo de acuerdo con el protocolo aquí presentado mostraron una morfología que coincidía con los criterios mínimos para las MSC propuestos por el ISCT. En la Figura 1 se muestra una descripción general del protocolo. Fenotípicamente, las ADSC mostraron adherencia a la morfología plástica y similar a la de los fibroblastos en los primeros días de cultivo celular (Figura 2A). Además, crecieron de forma homogénea y fo...

Discusión

Las MSCs pueden extraerse de diferentes tejidos. A pesar de que la médula ósea representa una fuente común de MSCs tanto en murinos como en humanos^25,26, hemos optado por trabajar con tejido adiposo en este estudio debido a su riqueza en MSCs, su distribución en el organismo y su facilidad de acceso. Como alternativa, las células madre derivadas del tejido adiposo pueden utilizarse para generar células inmortalizadas similares a las MSC^27<...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)