Aislamiento, expansión in vitro y caracterización de células madre mesenquimales a partir de tejido adiposo epididimario de ratón

Resumen

El tejido adiposo es una excelente fuente de células madre mesenquimales. Aquí, traemos el paso a paso de la extracción, el cultivo y la caracterización de células madre derivadas del tejido adiposo (ADSC) del tejido adiposo epididimario de ratones suizos.

Resumen

Las células madre mesenquimales (MSC) han sido ampliamente estudiadas como un nuevo enfoque terapéutico, principalmente para detener la inflamación exacerbada debido a su potencial para modular la respuesta inmune. Las MSC son células inmunoprivilegiadas capaces de sobrevivir en receptores de trasplantes alogénicos inmunológicamente incompatibles basados en la baja expresión de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I y en el uso de terapia basada en células para el trasplante alogénico. Estas células se pueden aislar de varios tejidos, siendo los más utilizados la médula ósea y los tejidos adiposos. Proporcionamos un protocolo sencillo para aislar, cultivar y caracterizar MSC a partir de tejido adiposo epididimario de ratones. El tejido adiposo del epidídimo se extirpa quirúrgicamente, se fragmenta físicamente y se digiere con una solución de colagenasa tipo II al 0,15%. A continuación, se cultivan y expanden in vitro células madre derivadas de tejido adiposo primario (ADSC), y se realiza la caracterización fenotípica mediante citometría de flujo. También proporcionamos los pasos para diferenciar las ADSC en células osteogénicas, adipogénicas y condrogénicas, seguidas de la caracterización funcional de cada linaje celular. El protocolo proporcionado aquí se puede utilizar para experimentos in vivo y ex vivo y, como alternativa, las células madre derivadas del tejido adiposo se pueden utilizar para generar células inmortalizadas similares a las MSC.

Introducción

Las células madre mesenquimales (MSC) son células adultas multipotenciales que se diferencian en células como osteoblasto, condroblasto y adipocito ^1,2. Estas células residen en varios órganos, por lo que pueden extraerse de tejidos adultos como la médula ósea, el músculo, la grasa, el folículo piloso, la raíz del diente, la placenta, la dermis, el pericondrio, el cordón umbilical, el pulmón, el hígado y el bazo ^3,4.

Se han descrito los efectos de las MSCs sobre la fisiología y el sistema inmune

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo a los lineamientos internacionales de ética animal y fueron aprobados por comités institucionales de cuidado y uso de la Universidad Estatal de Santa Cruz bajo el protocolo número 021/22. Se adquirieron ratones machos suizos (6-8 semanas) del Laboratorio de Crianza, Mantenimiento y Experimentación Animal del Centro de Investigación Animal de la Universidad Estatal de Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos, recibiendo agua y alimento ad libitum con ciclos de luz/oscuridad de 12 h.

NOTA: Se puede utilizar otro linaje de ratones; Recomendam....

Resultados

Las células extraídas del tejido adiposo de acuerdo con el protocolo aquí presentado mostraron una morfología que coincidía con los criterios mínimos para las MSC propuestos por el ISCT. En la Figura 1 se muestra una descripción general del protocolo. Fenotípicamente, las ADSC mostraron adherencia a la morfología plástica y similar a la de los fibroblastos en los primeros días de cultivo celular (Figura 2A). Además, crecieron de forma homogénea y fo.......

Discusión

Las MSCs pueden extraerse de diferentes tejidos. A pesar de que la médula ósea representa una fuente común de MSCs tanto en murinos como en humanos^25,26, hemos optado por trabajar con tejido adiposo en este estudio debido a su riqueza en MSCs, su distribución en el organismo y su facilidad de acceso. Como alternativa, las células madre derivadas del tejido adiposo pueden utilizarse para generar células inmortalizadas similares a las MSC^27<.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)