Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

Resumo

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido extensivamente estudadas como uma nova abordagem terapêutica, principalmente para interromper a inflamação exacerbada devido ao seu potencial de modular a resposta imune. As CTMs são células imunoprivilegiadas capazes de sobreviver em receptores de transplante alogênico imunologicamente incompatíveis com base na baixa expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e no uso de terapia baseada em células para transplante alogênico. Essas células podem ser isoladas de vários tecidos, sendo os mais comumente utilizados a medula óssea e os tecidos adiposos. Fornecemos um protocolo fácil para isolar, cultivar e caracterizar MSCs do tecido adiposo epididimal de camundongos. O tecido adiposo epididimal é excisado cirurgicamente, fisicamente fragmentado e digerido com solução de colagenase tipo II a 0,15%. Em seguida, células-tronco derivadas do tecido adiposo primário (ADSCs) são cultivadas e expandidas in vitro, e a caracterização fenotípica é realizada por citometria de fluxo. Também fornecemos as etapas para diferenciar as ADSCs em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas, seguidas pela caracterização funcional de cada linhagem celular. O protocolo fornecido aqui pode ser usado para experimentos in vivo e ex vivo e, como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células adultas multipotenciais que se diferenciam em células como osteoblastos, condroblastos e adipócitos ^1,2. Essas células residem em vários órgãos e, por isso, podem ser extraídas de tecidos adultos, como medula óssea, músculo, gordura, folículo piloso, raiz do dente, placenta, derme, pericôndrio, cordão umbilical, pulmão, fígado e baço ^3,4.

Os efeitos das CTMs na fisiologia e no sistema imunológico têm sido relatados ^5,6<....

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes internacionais de ética animal e foram aprovados pelos comitês institucionais de cuidado e uso da Universidade Estadual de Santa Cruz sob o número de protocolo 021/22. Camundongos machos suíços (6-8 semanas) foram adquiridos do Laboratório de Melhoramento, Manutenção e Experimentação Animal - Centro de Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantidos em condições específicas livres de patógenos, recebendo água e alimento ad libitum com ciclos claro/escuro de 12 h.

NOTA: Outras linhagens de camundongos podem ser usadas; Recomendamos o u....

Resultados

As células extraídas do tecido adiposo de acordo com o protocolo aqui apresentado apresentaram morfologia compatível com os critérios mínimos para CTMs propostos pelo ISCT. Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1. Fenotipicamente, as ADSCs mostraram aderência à morfologia plástica e semelhante a fibroblastos nos primeiros dias de cultura celular (Figura 2A). Além disso, eles cresceram de forma homogênea e formaram colônias. Além disso, .......

Discussão

As CTMs podem ser extraídas de diferentes tecidos. Apesar de a medula óssea representar uma fonte comum de CTMs em murinos e humanos^25,26, optamos por trabalhar com tecido adiposo neste estudo devido à sua riqueza em CTMs, distribuição no corpo e facilidade de acesso. Como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs²⁷.

Alg.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)