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Neste Artigo

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Resumo

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (CTMs) têm sido extensivamente estudadas como uma nova abordagem terapêutica, principalmente para interromper a inflamação exacerbada devido ao seu potencial de modular a resposta imune. As CTMs são células imunoprivilegiadas capazes de sobreviver em receptores de transplante alogênico imunologicamente incompatíveis com base na baixa expressão de moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe I e no uso de terapia baseada em células para transplante alogênico. Essas células podem ser isoladas de vários tecidos, sendo os mais comumente utilizados a medula óssea e os tecidos adiposos. Fornecemos um protocolo fácil para isolar, cultivar e caracterizar MSCs do tecido adiposo epididimal de camundongos. O tecido adiposo epididimal é excisado cirurgicamente, fisicamente fragmentado e digerido com solução de colagenase tipo II a 0,15%. Em seguida, células-tronco derivadas do tecido adiposo primário (ADSCs) são cultivadas e expandidas in vitro, e a caracterização fenotípica é realizada por citometria de fluxo. Também fornecemos as etapas para diferenciar as ADSCs em células osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas, seguidas pela caracterização funcional de cada linhagem celular. O protocolo fornecido aqui pode ser usado para experimentos in vivo e ex vivo e, como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (CTMs) são células adultas multipotenciais que se diferenciam em células como osteoblastos, condroblastos e adipócitos 1,2. Essas células residem em vários órgãos e, por isso, podem ser extraídas de tecidos adultos, como medula óssea, músculo, gordura, folículo piloso, raiz do dente, placenta, derme, pericôndrio, cordão umbilical, pulmão, fígado e baço 3,4.

Os efeitos das CTMs na fisiologia e no sistema imunológico têm sido relatados 5,6<....

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes internacionais de ética animal e foram aprovados pelos comitês institucionais de cuidado e uso da Universidade Estadual de Santa Cruz sob o número de protocolo 021/22. Camundongos machos suíços (6-8 semanas) foram adquiridos do Laboratório de Melhoramento, Manutenção e Experimentação Animal - Centro de Pesquisa Animal da Universidade Estadual de Santa Cruz (LaBIO-UESC), mantidos em condições específicas livres de patógenos, recebendo água e alimento ad libitum com ciclos claro/escuro de 12 h.

NOTA: Outras linhagens de camundongos podem ser usadas; Recomendamos o u....

Resultados

As células extraídas do tecido adiposo de acordo com o protocolo aqui apresentado apresentaram morfologia compatível com os critérios mínimos para CTMs propostos pelo ISCT. Uma visão geral do protocolo é mostrada na Figura 1. Fenotipicamente, as ADSCs mostraram aderência à morfologia plástica e semelhante a fibroblastos nos primeiros dias de cultura celular (Figura 2A). Além disso, eles cresceram de forma homogênea e formaram colônias. Além disso, .......

Discussão

As CTMs podem ser extraídas de diferentes tecidos. Apesar de a medula óssea representar uma fonte comum de CTMs em murinos e humanos25,26, optamos por trabalhar com tecido adiposo neste estudo devido à sua riqueza em CTMs, distribuição no corpo e facilidade de acesso. Como alternativa, as células-tronco derivadas do tecido adiposo podem ser usadas para gerar células imortalizadas semelhantes a MSCs27.

Alg.......

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Pesquisa apoiada por bolsa do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (480807/2011-6) e Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Este estudo foi financiado em parte pelo PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG e URS graças à bolsa concedida pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), respectivamente.

....

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
140 °C High Heat Sterilization CO2 IncubatorRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acetic acid glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in water
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acidSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNot applicable1 unit
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Cell culture plates (6-well)Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic mediumStem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life TechnologiesA1007101TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type IILife Technologies, California, USA17101015
cork or styrofoam board covered with aluminumNot applicable1 unit
cottonNot applicable50 g
DexamethasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Dissecting scissorNot applicable03 units sterile
DPX Mountant for histologySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldehydeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)Not applicable5 units
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamberSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645540Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)Merck, Darmstadt, GermanyZ717401Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645516Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910.5% in isopropanol
ParaffinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48, in block form
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 units sterile
scalpel (optional)Not applicable1 unit
Silver nitrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Surgical tweezer (15 cm)Not applicable3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
syringe (1 mL)Not applicable1 unit
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)

Referências

  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22 (2019).
  3. Lin, W., e....

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Palavras chave C lulas tronco mesenquimaisCTMstecido adiposotecido adiposo epididimalisolamentoexpans o in vitrocaracteriza ocitometria de fluxodiferencia o osteog nicadiferencia o adipog nicadiferencia o condrog nicaterapia celulartransplante alog nico

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