Isolation, In Vitro Expansion, and Characterization of Mesenchymal Stem Cells from Mouse Epididymal Adipose Tissue(마우스 부고환 지방 조직에서 중간엽 줄기 세포의 분리, 체외 확장 및 특성 분석)

요약

지방 조직은 중간엽 줄기 세포의 훌륭한 공급원입니다. 여기에서는 스위스 생쥐 부고환 지방 조직에서 지방 조직 유래 줄기 세포(ADSC)의 단계별 추출, 배양 및 특성 분석을 제공합니다.

초록

중간엽 줄기 세포(MSC)는 주로 면역 반응을 조절할 수 있는 잠재력으로 인해 악화된 염증을 막기 위한 새로운 치료 접근법으로 광범위하게 연구되었습니다. MSC는 class I major histocompatibility complex(MHC) 분자의 낮은 발현과 동종 이식을 위한 세포 기반 요법의 사용을 기반으로 면역학적으로 호환되지 않는 동종 이식 수혜자에서 생존할 수 있는 면역 특권 세포입니다. 이 세포는 여러 조직에서 분리할 수 있으며, 가장 일반적으로 사용되는 것은 골수와 지방 조직입니다. 당사는 마우스의 부고환 지방 조직에서 MSC를 분리, 배양 및 특성화할 수 있는 간편한 프로토콜을 제공합니다. 부고환 지방 조직은 외과적으로 절제하고 물리적으로 단편화한 후 0.15% 콜라겐분해효소 II형 용액으로 분해합니다. 그런 다음 1차 지방 조직 유래 줄기세포(ADSC)를 시험관에서 배양 및 증식하고 유세포 분석을 통해 표현형 특성 분석을 수행합니다. 또한 ADSC를 골형성(osteogenic), 지방형성(adipogenic) 및 연골형성(chondrogenic) 세포로 분화하는 단계를 제공하고 각 세포 계통의 기능적 특성을 규명합니다. 여기에 제공된 프로토콜은 in vivo 및 ex vivo 실험에 사용할 수 있으며, 대안으로 지방 유래 줄기 세포를 사용하여 MSC와 같은 불멸 세포를 생성할 수 있습니다.

서문

중간엽 줄기 세포(MSC)는 조골세포, 연골아세포, 지방세포 ^1,2와 같은 세포로 분화하는 성체 다전위 세포입니다. 이 세포는 여러 장기에 존재하기 때문에 골수, 근육, 지방, 모낭, 치아 뿌리, 태반, 진피, 주위, 탯줄, 폐, 간 및 비장과 같은 성인 조직에서 추출할 수 있습니다 ^3,4.

MSC가 생리학 및 면역 체계에 미치는 영향은 ^5,6으로 보고되었습니다. 이 세포는 인간 및 수의학 모두에서 여러 질병을 치료하는 데 유망했습니다. MSC는 세포-세포 접촉, 용해성 인자 및 작은 세포외 소포체와 같은 다양한 메커니즘을 통해 염증을 제어하고 혈관 신생 및 조직 항상성을 촉진할 수 있습니다 7,8,9,10.....

프로토콜

모든 동물 실험은 동물 윤리에 대한 국제 지침에 따라 수행되었으며, 프로토콜 번호 021/22에 따라 산타 크루즈 주립 대학의 관리 및 사용 기관 위원회의 승인을 받았습니다. 스위스 수컷 마우스(6-8주)는 동물 사육, 유지 관리 및 실험 실험실 - 산타 크루즈 주립 대학(LaBIO-UESC) 동물 연구 시설에서 획득했으며, 특정 병원체가 없는 조건에서 유지되고 12시간 밝음/어두운 주기로 물과 음식을 즉시 받았습니다.

참고: 다른 마우스 계통을 사용할 수 있습니다. 성체 마우스(6-8주)는 증식 활성이 높은 지방 조직과 세포가 더 발달되어 있기 때문에 사용을 권장합니다.

1. 준비

알림: 계속하기 전에 아래에 설명된 다음 시약을 준비하십시오. 시약 및 재료 공급업체 정보는 재료 표를 참조하십시오. 마스크, 모자, 실험복, 장갑과 같은 개인 보호 장비는 모든 실제 절차에서 착용해야 합니다.

1. 부고환 지방 조직 추출
   1. 수술 재료를 예약하십시오: 멸균 핀셋 및 가위 3세트, 바늘 5개, 70% 에탄올 200mL가 들어 있는 비커.
   2. 케타민(10....

결과

여기에 제시된 프로토콜에 따라 지방 조직에서 추출한 세포는 ISCT에서 제안한 MSC에 대한 최소 기준과 일치하는 형태를 보여주었습니다. 프로토콜의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 표현형적으로, ADSC는 세포 배양 초기에 플라스틱 및 섬유아세포와 유사한 형태에 대한 부착을 보여주었습니다(그림 2A). 게다가, 그들은 균질하게 성장하여 식민지를 형성?.......

토론

MSC는 다양한 조직에서 추출할 수 있습니다. 골수가 쥐와 인간 모두에서 MSCs의 공통 공급원을 나타내고 있음에도 불구하고^25,26, 우리는 MSC가 풍부하고 신체에 분포하며 접근이 용이하기 때문에 이 연구에서 지방 조직과 함께 작업하기로 결정했습니다. 대안으로, 지방 유래 줄기 세포를 사용하여 MSC와 같은 불멸화 세포를 생성할 수^{있다 27}

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)