マウス精巣上体脂肪組織からの間葉系幹細胞の単離、In vitro拡大、および特性評価

要約

脂肪組織は、間葉系幹細胞の優れた供給源です。ここでは、スイスのマウス精巣上体脂肪組織からの脂肪組織由来幹細胞(ADSC)の段階的な抽出、培養、および特性評価をもたらします。

要約

間葉系幹細胞(MSC)は、免疫応答を調節する可能性があるため、主に炎症の悪化を止めるための新しい治療アプローチとして広く研究されてきました。MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子の低発現に基づく免疫学的に不適合な同種移植レシピエントで生存し、同種移植のための細胞ベースの治療の使用において生存できる免疫特権細胞です。これらの細胞はいくつかの組織から単離することができ、最も一般的に使用されるのは骨髄および脂肪組織です。私たちは、マウスの精巣上体脂肪組織からMSCを分離、培養、および特性評価するための簡単なプロトコルを提供します。精巣上体脂肪組織を外科的に切除し、物理的に断片化し、0.15%コラゲナーゼII型溶液で消化します。次に、初代脂肪組織由来幹(ADSC)細胞を in vitroで培養および増殖させ、フローサイトメトリーによって表現型の特性評価を行います。また、ADSCを骨形成細胞、脂肪形成細胞、軟骨形成細胞に分化するための手順と、それに続く各細胞系統の機能的特性評価についても説明します。ここで提供されるプロトコルは、 in vivo および ex vivo 実験に使用でき、代替として、脂肪由来幹細胞を使用してMSC様不死化細胞を生成することができます。

概要

間葉系幹細胞(MSC)は、骨芽細胞、軟骨芽細胞、脂肪細胞^1,2などの細胞に分化する成体の多電位細胞です。これらの細胞はいくつかの臓器に存在し、そのため、骨髄、筋肉、脂肪、毛包、歯根、胎盤、真皮、軟骨膜、臍帯、肺、肝臓、脾臓などの成体組織から抽出することができます^3,4。

MSCが生理機能と免疫系に及ぼす影響が報告されています^5,6。これらの細胞は、ヒト医学と獣医学の両方で、いくつかの疾患の治療に有望です。MSCは、細胞間接触、可溶性因子、および小さな細胞外小胞7,8,9,10などのさまざまなメカニズムを通じて、炎症を制御し、血管新生および組織の恒常性を促進することができる。さらに、MSCは、クラスI主要組織適合遺伝子複合体(MHC)....

プロトコル

すべての動物実験は、動物倫理に関する国際的なガイドラインに従って実施され、サンタクルーズ州立大学の機関のケアおよび使用委員会によってプロトコル番号021/22で承認されました。スイスの雄マウス(6〜8週間)は、サンタクルス州立大学動物研究施設(LaBIO-UESC)の動物研究施設から入手し、特定の病原体のない条件で維持され、12時間の明暗サイクルで水と食物を自由に受け取りました。

注:他のマウス系統を使用できます。成体マウス(6-8週)は、脂肪組織や細胞が発達し、増殖活性が高いため、使用をお勧めします。

1. 事前準備

注:先に進む前に、以下に説明する以下の試薬を準備してください。試薬および材料供給業者の情報については、 材料表 を参照してください。マスク、キャップ、白衣、手袋などの個人用保護具は、すべての実用的な手順で着用する必要があります。

1. 精巣上体脂肪組織抽出
   1. 手術材料を予約します:滅菌ピンセットとハサミ3セット、針5本、70%エタノール200mLを含むビーカー。
   2. ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を混合して、終末麻酔薬を準備します。
2. ADSCの文化
   <....

結果

ここに提示されたプロトコルに従って脂肪組織から抽出された細胞は、ISCTによって提案されたMSCの最小基準に一致する形態を示しました。プロトコルの概要を 図 1 に示します。表現型的には、ADSCは細胞培養の最初の数日間に可塑性および線維芽細胞様形態への付着を示しました(図2A)。さらに、それらは均質に成長し、コロニーを形成しました。.......

ディスカッション

MSCは、さまざまな組織から抽出できます。骨髄はマウスとヒトの両方でMSCの一般的な供給源であるにもかかわらず^25,26、この研究では、MSCが豊富であること、体内での分布、およびアクセスの容易さから、脂肪組織を扱うことを選択しました。代替として、脂肪由来幹細胞を使用して、MSC様の不死化細胞²⁷を生成することができる?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
140 °C High Heat Sterilization CO2 Incubator	RADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, China	C180
3-Isobutyl-1-methylxanthine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I7018
Acetic acid glacial	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1748
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A9186	BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	65350-M	70% in water
Amphotericin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	555005	Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	551387	Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	559864	Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	553266	Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)	BD Biosciences, San Diego, CA, USA	557266	Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR1008
Automatic pipettes	Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	4700850N	Finnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
Beaker	Not applicable		1 unit
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	A7906
Cell culture plates (6-well)	Merck, Darmstadt, Germany	Z707759	07 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)	Merck, Darmstadt, Germany	CLS353077	01 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic medium	Stem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life Technologies	A1007101	TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type II	Life Technologies, California, USA	17101015
cork or styrofoam board covered with aluminum	Not applicable		1 unit
cotton	Not applicable		50 g
Dexamethasone	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D4902
Dissecting scissor	Not applicable		03 units sterile
DPX Mountant for histology	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	D5523	With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin B	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	861006
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	F4135
Formaldehyde	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	47608
Formalin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	HT501128
Gentamicin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G1397
Hematoxylin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	H3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)	Not applicable		5 units
Indomethacin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I0200000
Insulin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	I3536
Isopropanol	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	563935	70% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	K-006	1.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	BR718620	BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645540	Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z717401	Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)	Merck, Darmstadt, Germany	Z645516	Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solution	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	O1391	0.5% in isopropanol
Paraffin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	107.151	46–48, in block form
Penicillin/Streptomycin	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P4333	Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	P3813	Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-959-53A	Sterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)	Falcon, Fisher Scientific	14-432-22	2 units sterile
scalpel (optional)	Not applicable		1 unit
Silver nitrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	85228
Sodium thiosulfate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	72049
Surgical tweezer (15 cm)	Not applicable		3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)	Bioterium, Santa Cruz State University	021/22
syringe (1 mL)	Not applicable		1 unit
Trypan Blue Dye	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T8154	0.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	T3924
Xylazine	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	PHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA	G9422	BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)