JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Жировая ткань является отличным источником мезенхимальных стволовых клеток. В этой статье мы рассмотрим пошаговую экстракцию, культивирование и характеристику стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC), полученных из придатков яичка швейцарских мышей.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) широко изучаются в качестве нового терапевтического подхода, в основном для остановки обострения воспаления из-за их способности модулировать иммунный ответ. МСК являются иммунопривилегированными клетками, способными выживать у иммунологически несовместимых аллогенных реципиентов трансплантата на основе низкой экспрессии молекул главного комплекса гистосовместимости (МНС) класса I и при использовании клеточной терапии для аллогенной трансплантации. Эти клетки могут быть выделены из нескольких тканей, наиболее часто используемыми являются костный мозг и жировые ткани. Мы предоставляем простой протокол для выделения, культивирования и характеристики МСК из придатковой жировой ткани мышей. Жировая ткань придатка яичка хирургическим путем иссекается, физически фрагментируется и переваривается 0,15% раствором коллагеназы II типа. Затем первичные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSCs), культивируют и размножают in vitro, а фенотипическую характеристику выполняют с помощью проточной цитометрии. Мы также предлагаем шаги по дифференцировке ADSC на остеогенные, адипогенные и хондрогенные клетки с последующей функциональной характеристикой каждой клеточной линии. Представленный здесь протокол может быть использован для экспериментов in vivo и ex vivo , а в качестве альтернативы стволовые клетки, полученные из жировой ткани, могут быть использованы для создания МСК-подобных иммортализованных клеток.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) представляют собой взрослые мультипотенциальные клетки, дифференцирующие в такие клетки, как остеобласт, хондробласт и адипоцит 1,2. Эти клетки находятся в нескольких органах, и благодаря этому они могут быть извлечены из тканей взрослого человека, таких как костный мозг, мышцы, жир, волосяной фолликул, корень зуба, плацента, дерма, надхрящница, пуповина, легкие, печень и селезенка 3,4.

Сообщалось о влиянии МСК на физиологию и иммунную систему 5,6. Эти клетки оказались перспективными для лечения ряда заболеваний, как в медицине человека, так и в ветеринарии. МСК могут контролировать воспаление и способствовать ангиогенезу и тканевому гомеостазу с помощью различных механизмов, таких как межклеточный контакт, растворимые факторы и небольшие внеклеточные везикулы 7,8,9,10. Кроме того, МСК являются иммунопривилегированными клетками, способными выживать у иммунологически несовместимых аллогенных реципиентов трансплантатов, поскольку эти клетки демонстрируют низкую экспрессию молекул главного комплекса гистосовместимости (MHC) класса I и используются в клеточной терапии для аллогенной трансплантации11,12. Низкая иммуногенность в сочетании с регенеративным потенциалом делает МСК идеальными кандидатами для клеточной терапии, такой как реакция «трансплантат против хозяина» (РТПХ)13, системная красная волчанка (СКВ)14 и рассеянный склероз15, средипрочих 16,17.

Несмотря на то, что МСК находятся в нескольких тканях взрослого человека, жировая ткань имеет преимущества перед другими источниками, такие как доступность для забора, при минимальном хирургическом вмешательстве; большое количество доступных ячеек с высокой скоростью расширения; и простое расширение in vitro с использованием простого в исполнении протокола без необходимости использования специального оборудования и недорогих материалов 18,19,20. После извлечения стволовые клетки, полученные из жировой ткани (ADSC), должны быть охарактеризованы как установленные Международным обществом клеточной терапии (ISCT)21. Таким образом, МСК должны демонстрировать морфологическую фибробластоподобность, адгезию к пластической культуре, экспрессию высокого процента (≥95%) мезенхимальных маркеров, таких как эндоглин (CD105), экто-5'-нуклеотидаза (CD73) и Thy-1 (CD90), и низкий процент (≤2%) гемопоэтических маркеров, таких как общий антиген лейкоцитов (CD45), трансмембранный фосфогликопротеин (CD34), гликолипид-заякоренный мембранный гликопротеин (CD14), интегрин альфа-М (CD11b), альфа-цепь, ассоциированный с рецептором антигена В-клеток (CD79α) или В-лимфоцитарный поверхностный антиген B4 (CD19) и человеческий лейкоцитарный антиген II класса (HLA-II). Кроме того, требуется функциональная характеристика, и клетки должны быть способны дифференцироваться в остеобластные, хондробластные или адиобластные клетки21.

Здесь мы показываем, как получить МСК из жировой ткани придатка яичка с помощью механической диссоциации и ферментативного расщепления для исследований in vitro и морфологической характеристики, предварительно полученной с помощью МСКТ.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с международными рекомендациями по этике животных и были одобрены институциональными комитетами по уходу и использованию Государственного университета Санта-Крус под номером 021/22. Швейцарские самцы мышей (6-8 недель) были приобретены в Лаборатории разведения, содержания и экспериментов животных Исследовательского центра Государственного университета Санта-Круз (LaBIO-UESC) в специальных условиях, свободных от патогенов, получая воду и пищу в неограниченном количестве с 12-часовыми циклами света/темноты.

ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать другую линию мышей; Мы рекомендуем использовать взрослым мышам (6-8 недель), так как у них более развита жировая ткань и клетки с высокой пролиферативной активностью.

1. Подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Прежде чем продолжить, приготовьте следующие реагенты, описанные ниже. Информацию о реагентах и поставщиках материалов см. в Таблице материалов . Во всех практических процедурах необходимо носить средства индивидуальной защиты, такие как маски, шапки, лабораторные халаты и перчатки.

  1. Экстракция эпидидимальной жировой ткани
    1. Запасите материалы для операции: три комплекта стерильных пинцетов и ножниц, пять игл и стакан, содержащий 200 мл 70% этанола.
    2. Приготовьте терминальный анестетик, смешав кетамин (100 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг).
  2. Культура ADSC
    1. Базальная среда: Приготовьте модифицированную среду Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 50 мкг/мл гентамицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина.
    2. Раствор для разложения: Приготовьте 0,15% коллагеназы II типа в PBS, стерилизованных в фильтре 0,25 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости использовать четыре антибиотика, описанные в базальной среде. Это будет зависеть от условий культивирования клеток в лаборатории, где это выполняется.
  3. Фенотипическая характеристика ADSC
    1. Приготовьте 1% бычий сывороточный альбумин (БСА) в PBS.
    2. Разбавьте антитела против мыши, как указано в таблице 1.
    3. Приготовьте 2% формальдегид в PBS.
  4. Остеогенная дифференцировка ADSCs
    1. Остеогенная среда для дифференцировки: Приготовьте DMEM с добавлением 5,67 М аскорбиновой кислоты, 10 нМ дексаметазона, 0,02 М β-глицерофосфата, 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
    2. Для окрашивания по Фон Коссе приготовьте следующие растворы: 70% этанола в воде, 5% нитрата серебра в воде, дистиллированной воде, 5% тиосульфата натрия в воде и 1% эозина B в воде.
  5. Адипогенная дифференцировка:
    1. Среда для адипогенной дифференцировки: Приготовьте DMEM с добавлением 0,5 мМ 3-изобутил-1-метилксантина, 200 мкМ индометацина, 1 мкМ дексаметазона, 10 мкМ инсулина, 10% FBS и 1 % пенициллина/стрептомицина.
    2. Для окрашивания Oil-red приготовьте следующие растворы: 10% формалин в деионизированной воде, 60% изопропанол в деионизированной воде, лизохром (жирорастворимый краситель), диазокраситель (раствор Oil-Red O) в 60% изопропаноле, и 1% гематоксилин в деионизированной воде.
  6. Хондрогенная дифференцировка:
    1. Среда для хондрогенной дифференцировки: Приготовьте хондрогенную среду с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина.
    2. Приготовьте 10% формальдегид в PBS.
    3. Для окрашивания протеогликанами и гликозаминогликанами готовят следующие растворы: краситель гетерогликан (Alcian Blue 1%) в уксусной кислоте, pH 2,5, парафин, гематоксилин, разведение этанолевого ряда в воде (100%, 96%, 80%, 70%).

Антитела/флуорофорыРазбавлениеКлонКонечная концентрация (мкг/мл)Функция и ячейка, в которой она экспрессируется
КД34- ПЭ1:100Оперативная память342Фактор адгезии клеток. Гемопоэтические стволовые клетки.
CD45- БТР1:10030-F112Ассистирование в активации лейкоцитов. Выражается в лейкоцитах.
CD71-FITC1:100С25Контролирует поглощение железа во время пролиферации клеток. Пролиферирующие клетки, ретикулоциты и клетки-предшественники.
CD29-FITC1:100Ха2/55Адгезия и активация, эмбриогенез, лейкоциты, дендритные клетки, тромбоциты, тучные клетки, фибробласты и эндотелиальные клетки.
CD90- ПерХПФ1:100ОКС-72Сигнализация, сцепление. Т-лимфоциты, NK, моноциты, гемопоэтические стволовые клетки, нейроны и фибробласты.

Таблица 1: Антитела, используемые для фенотипической характеристики ADSC с помощью проточного цитометра. Список антител с соответствующими флуорохромами, разведениями, клоном и конечной концентрацией, а также их функцией в экспрессируемой клетке.

2. Методы

ПРИМЕЧАНИЕ: Жировая ткань распределяется по всему телу в подкожном или внутрибрюшном расположении. У мышей наиболее распространенными жировыми тканями, используемыми для экспериментов, являются подкожная эпидидимальная, брыжеечная и забрюшинная22. Здесь показаны этапы получения жировой ткани придатка яичка (рисунок 1).

figure-protocol-6139
Рисунок 1: План эксперимента по получению стволовых клеток, полученных из жировой ткани швейцарских мышей. (A) С помощью игл поместите животное на пробковую или пенопластовую доску; (Б) Подтяните кожу с помощью пинцета, сделайте надрез в центре брюшной области и отделите кожу от брюшины; (В) определить белую жировую ткань над придатком яичка; (D) перенести ткань в среду DMEM с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков, тщательно промыть придатковую жировую ткань PBS и перевести ткань в раствор для переваривания; Е) фрагментировать ткань и F) инкубировать при 37°С в течение 1 ч, энергично встряхивая каждые 10 мин; (G) после подсчета клеток поместить в 6-луночные планшеты и наблюдать за морфологией клеток под перевернутым микроскопом. (F) Морфология клеток изменится с круглой на фибробластоподобную. Масштабная линейка = 22,22 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

  1. Экстракция придатка яичка и яичка жировой ткани
    ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что все процедуры должны проводиться в стерильных условиях в ламинарном шкафу, чтобы обеспечить чистую и свободную от загрязнения культуру клеток.
    1. Усыпляют животных с использованием раствора кетамина и ксилазина (100 и 10 мг/кг, как описано в шаге 1.1.2) внутрибрюшинным путем.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать и другие методы эвтаназии23. Убедитесь в том, что животное мертво, подтвердив отсутствие сердцебиения.
    2. Поместите животное брюшной стороной вверх на пробковую или пенопластовую доску, покрытую алюминиевой фольгой, и зафиксируйте его с помощью стерильных игл (рисунок 1А).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнения распылите 70% спирт в область живота. В качестве альтернативы можно сбрить волосы с помощью скальпеля.
    3. Подтяните кожу с помощью пинцета в центре брюшной области и сделайте надрез стерильными ножницами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание загрязнения необходимы два комплекта стерильных пинцетов и ножниц. Первый используется для вскрытия животного, разрезания кожи и брюшинного слоя; Второй используется для забора жировой ткани придатка яичка. Кроме того, оставьте 150 мл 70% спирта в стакане для очистки ножниц и пинцета между шагами.
    4. Введите ножницы под кожу животного и откройте его, чтобы отделить от брюшины (рисунок 1B). Поднимите брюшинный слой с помощью пинцета и разрежьте стерильными ножницами.
    5. Используйте еще один набор стерильных пинцетов и ножниц и определите придаток яичек над яичками и белую жировую ткань над придатком яичка. Вытяните всю жировую ткань придатка яичка с помощью стерильного пинцета, размером примерно 2 см, и разрежьте очень близко к придатку яичка (рисунок 1В).
    6. Поместите жир в стерильную коническую пробирку объемом 50 мл с базальной средой и положите ее на лед (Рисунок 1D). В капюшоне перейдите к следующим шагам, как описано ниже.
  2. Выделение стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обрабатывайте образцы в капюшоне с ламинарным потоком класса II по биологическому признаку, персонал должен быть одет в лабораторный халат, перчатки и хирургическую маску.
    1. Тщательно промойте жировую ткань придатка яичка с помощью PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для удаления крови и других частиц из образца. Кровь может ингибировать фермент коллагеназу II типа и поставить под угрозу эксперимент.
    2. С помощью стерильного пинцета перенесите жировую ткань придатка яичка в пробирку объемом 50 мл, содержащую 15-20 мл раствора для расщепления, приготовленного на шаге 1.2.2. Фрагментируйте ткань с помощью стерильных ножниц и инкубируйте ткань при температуре 37 °C в течение 1 ч (рис. 1E, F).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно использовать водяную баню или инкубатор при температуре 37 °C. Каждые 10 минут суспензию необходимо энергично встряхивать, чтобы облегчить пищеварение. Не продлевайте время инкубации на 1 час.
    3. Инактивируйте коллагеназу, разбавив образец в соотношении 1:1 в базальной среде, и центрифугируйте суспензию при 250 х г в течение 10 мин при 4 °С для получения сосудистой фракции стромы. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл базальной среды.
    4. Проверьте жизнеспособность и подсчитайте клетки с помощью метода исключения трипанового синего красителя в камере Нойбауэра с использованием разведения 1:10 или 1:100.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ожидаемый выход составляет около 0,5-1 миллиона клеток/г переработанной жировой ткани и жизнеспособность 80%.
    5. Выделенные клетки (0,3-0,5 млн) наносят в 3 мл базальной среды в одну лунку 6-луночного планшета. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C с 5 % CO2.
    6. На следующий день: Достаньте среду из лунки и промойте клетки PBS. Добавьте 3 мл базальной среды. Повторяйте этот процесс каждые 2 дня до тех пор, пока клетки не станут сливаться на 90%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда наблюдайте за морфологией клеток под инвертированным микроскопом, меняющейся от круглой до фибробластоподобной (Рисунок 1H).
  3. Экспансия стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как только клетки вырастут на ~90% сливающимися, приступайте к субкультуре, как описано ниже.
    1. Достаньте среду из лунки и промойте ячейки PBS. Добавьте 0,5 мл/лунку трипсина/ЭДТА (0,05 % трипсина; 200 мг/л ЭДТА) и инкубируйте планшет в течение 3-5 минут при 37 °C для отделения клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не принимайте трипсин/ЭДТА более 5 минут. Полная отслойка клеток должна быть проверена под инвертированным микроскопом. Процесс можно ускорить, осторожно пипетируя вверх и вниз или постукивая по боковой стороне планшета.
    2. Инактивировать фермент путем разведения образца в соотношении 1:1 в DMEM с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% антибиотиков.
    3. Разделите клеточную суспензию на 2 лунки и добавьте 3 мл базальной среды (DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % антибиотиков). Инкубировать в течение ночи при 37 °C с 5%CO2.
    4. Меняйте среду на следующий день, затем каждые 2 дня до 90% слияния.
    5. Повторяйте процесс до третьего прохода и приступайте к фенотипизации и функциональной характеристике.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда наблюдайте за морфологией клеток под инвертированным микроскопом, меняющейся от круглой до фибробластоподобной.
  4. Характеристика стволовых клеток, полученных из жировой ткани (ADSC)
    1. Фенотипическая характеристика методом проточной цитометрии
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА, как описано в шагах с 2.3.1 по 2.3.2.
      2. Соберите клетки в коническую пробирку (50 мл) и центрифугируйте при температуре 250 x g в течение 10 минут при 4 °C. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в 1 мл PBS.
      3. Подсчитайте клетки, как описано на шаге 2.2.4, и затравите 0,5-1 x 106 клеток в 100 мкл PBS в 96-луночный планшет.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Количество лунок будет зависеть от цвета конъюгата флуорохрома и фильтров/лазеров цитометра.
      4. Добавьте антитела (табл. 1), разведенные в 1% BSA в PBS.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости использовать Fc-блок, чтобы избежать неспецифического связывания, потому что мы уже используем BSA для разбавления антител. Резервируйте образец клеток без получения антител, которые будут использоваться в качестве контроля окрашивания. Антитела могут быть объединены в одной лунке в соответствии с флуорохромовым красителем и цитометром, доступными в лаборатории. Все антитела, описанные в таблице 1 , могут быть добавлены в одну и ту же лунку, за исключением CD71 FITC и CD29 FITC, которые должны находиться в разных лунках из-за одного и того же флуорохрома.
      5. Выдержать тарелку в течение 30 минут при температуре 4 °C в темноте.
      6. Промойте ячейки, затем заполните объем до 200 μL с помощью PBS, центрифугируйте планшет при 252 x g в течение 10 минут при 4 °C и выбросьте надосадочную жидкость. Повторите этот шаг еще раз.
      7. Закрепите ячейки, добавив 200 мкл 200 мкл 2% формальдегида в PBS на лунку. Храните клетки в темноте при температуре 4 °C до анализа в проточном цитометре.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Для достижения наилучших результатов как можно скорее получите клетки на проточном цитометре. Яркость флуоресценции маркеров значительно снижается через 48 ч для большинства флуорохров. Так, не превышайте 48 ч для считывания показаний на табличке. Рекомендуется приобрести 30 000 мероприятий.
      8. Используйте стратегию стробирования, представленную на рисунке 2B , для выбора популяции ASC.
    2. Функциональная характеристика: остеогенная дифференцировка
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА (как описано в шагах 2.3.1 - 2.3.2), соберите и центрифугируйте клетки (как описано в шагах 2.4.1.2 и 2.4.1.2) и подсчитайте их (как описано в шагах 2.2.4).
      2. Планшет, в трех экземплярах, 2 x 105 клеток на лунку в 6-луночных планшетах в базальном медиальном диапазоне (DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % антибиотиков); инкубировать при 37 °C с 5%CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуются два 6-луночных планшета, по одному на каждое время дифференцировки (14 и 21 день).
      3. На следующий день смените среду на остеогенную среду (шаг 1.4.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: резервировать 3 лунки при культивировании только базальной средой, которая будет являться контролем для дифференциации.
      4. Культивируют клетки в течение 14 и 21 суток в остеогенных средах и контрольных клетках, меняя среды каждые 3 суток. Приступайте к окрашиванию по методу фон Косса (шаг 1.4.2) для оценки минерализованных конкреций в конце каждого периода культивирования.
      5. Отсадите среду из каждой лунки и дважды промойте клетки PBS. Зафиксируйте ячейки 2 мл 70% этанола на ночь при комнатной температуре (RT). Тщательно промойте клетки в проточной воде.
      6. Добавьте 2 мл 5% раствора нитрата серебра и инкубируйте планшет в ультрафиолете в течение 1 ч. Промойте клетки дистиллированной водой. Добавьте 2 мл 5% тиосульфата натрия и выдерживайте 5 минут. Умываем дистиллированной водой.
      7. Контрокрашивание 2 мл эозина в течение 40 с. Промойте дистиллированной водой до тех пор, пока раствор для окрашивания не будет удален, и визуализируйте окрашивание с помощью оптического микроскопа.
    3. Функциональная характеристика: Адипогенная дифференцировка
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА (как описано в шагах 2.3.1 - 2.3.2), соберите и центрифугируйте клетки (как описано в шагах 2.4.1.2 и 2.4.1.2) и подсчитайте их (как описано в шагах 2.2.4).
      2. Планшет 2 х 10по 5 клеток в лунку в 6-луночных планшетах в базальном медиальном диапазоне (DMEM с добавлением 10 % FBS и 1 % антибиотиков); инкубировать при 37 °C с 5%CO2.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Потребуются два 6-луночных планшета, по одному на каждое время дифференцировки (14 и 21 день).
      3. На следующий день смените среду на адипогенную среду (шаг 2.5.1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Резервировать 3 лунки, культивируя только базальную среду в качестве контроля.
      4. Культивируют клетки в течение 14 и 21 суток в адипогенной среде, меняя среды каждые 3 суток. В конце каждого периода культивирования приступают к окрашиванию Oil-Red O (шаги 2.4.3.5-2.4.3.7), индикатору внутриклеточного накопления липидов.
      5. Отсасывайте среду из каждой лунки. Дважды промойте клетки PBS. Зафиксируйте клетки в 2 мл 10% формалина на 1 ч. Умойтесь один раз PBS, а затем один раз водой.
      6. Окрашивать 2 мл раствора Oil-Red O в 60% изопропаноле в течение 5 минут. Один раз промыть дистиллированной водой.
      7. Противокрасить 2 мл 1% гематоксилина, разведенного в соотношении 1:2 в дистиллированной воде в течение 1 мин. Промойте дистиллированной водой до тех пор, пока раствор для окрашивания не будет удален, и визуализируйте окрашенные образцы с помощью оптического микроскопа.
    4. Функциональная характеристика: хондрогенная дифференцировка
      1. Отсоедините клетки с помощью трипсина/ЭДТА (как описано в шагах 2.3.1 - 2.3.2), соберите и центрифугируйте клетки (как описано в шагах 2.4.1.2 и 2.4.1.2) и подсчитайте их (как описано в шагах 2.2.4).
      2. Поместите 5 x 105 ADSC в четыре полипропиленовые конические пробирки и центрифугируйте при 450 x g в течение 5 минут для получения гранулы. Выбросьте надосадочную жидкость.
      3. Гранулы культивируют в конической трубке в хондрогенной среде (стадия 1.6.1) или только в базальной среде (контроль дифференцировки) в течение 14 и 21 суток при 37 °С в 5%СО2. Меняйте среду каждые 3 дня и избегайте удаления гранул.
        Примечание: Каждая клеточная гранула относится к каждому времени культивирования, а также к их соответствующему контролю, выращенному только с базальной средой.
      4. В конце каждого этапа культивирования соберите гранулы с помощью пинцета с тонким наконечником и поместите их в 24-луночный планшет. Приступают к гистологическому срезу и окрашиванию протеогликанов и гликозаминогликанов (этапы 2.4.4.5.-2.4.4.9).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая гранула обрабатывается в отдельной лунке.
      5. Зафиксировать гранулы в 2 мл 10% буферизованного формальдегида на 30 мин. Выбросьте раствор формальдегида и добавьте 2 мл 70% этанола. Извлеките гранулу из конической трубки с помощью наконечника и заделайте гранулы в парафин.
      6. С помощью вращающегося парафинового микротома делают гистологические срезы размером 5 мкм. Инкубируйте секции в течение 15 минут при температуре 60 °C и дважды погрузите их в ксилол (на 5 и 15 минут).
      7. Регидратация образцов путем погружения гистологических срезов в спиртовые ванны при убывающих концентрациях (100%, 96%, 80% и 70%) на 2 мин каждая, затем промывание деионизированной водой в течение 5 мин.
      8. Приступайте к окрашиванию образцов альцианским синим 1% в уксусной кислоте, pH 2,5, в течение 30 минут.
      9. Закрасьте гематоксилином в течение 1 минуты, и промойте дистиллированной водой. Монтируйте с помощью DPX (монтант для гистологии) или другого решения для монтирования и визуализируйте образцы с помощью оптического микроскопа.

Результаты

Клетки, выделенные из жировой ткани в соответствии с представленным здесь протоколом, показали морфологию, соответствующую минимальным критериям для МСК, предложенным ISCT. Обзор протокола показан на рисунке 1. Фенотипически ADSC продемонстрировали приверженность к пласт...

Обсуждение

МСК могут быть извлечены из различных тканей. Несмотря на то, что костный мозг является общим источником МСК как у мышей, так и у человека25,26, мы решили работать с жировой тканью в этом исследовании из-за ее богатства МСК, распределения в организме и легкос?...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Исследование поддержано грантом Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnologico (480807/2011-6) и Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (APQ-01237-11). Это исследование было частично профинансировано PROPP UESC (073.6764.2019.0021079-85). MGAG и URS благодаря стипендии, предоставленной Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) и Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) соответственно.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
140 °C High Heat Sterilization CO2 IncubatorRADOBIO SCIENTIFIC CO. LTD, ChinaC180
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI7018
Acetic acid glacialSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1748
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA9186BioReagent, suitable for detection of glycoproteins. 1% in acetic acid, pH 2.5
Alcohol 70%Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA65350-M70% in water
Amphotericin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1662
Antibodies anti-mouse anti-CD29 FITC (Clone Ha2/5)BD Biosciences, San Diego, CA, USA555005Functions in the cell: Adhesion and activation, embryogenesis, Leukocytes, DC, platelets, mast cells, fibroblasts and endothelial cells
Antibodies anti-mouse anti-CD34 PE (Clone RAM34)BD Biosciences, San Diego, CA, USA551387Functions in the cell: Cell adhesion factor. Hematopoietic stem cells
Antibodies anti-mouse anti-CD45 APC (Clone 30-F11)BD Biosciences, San Diego, CA, USA559864Functions in the cell: Assists in the activation of leukocytes
Antibodies anti-mouse anti-CD71 FITC (Clone C2)BD Biosciences, San Diego, CA, USA553266Functions in the cell: Controls iron uptake during cell proliferation. Proliferating cells, reticulocytes and precursors
Antibodies anti-mouse anti-CD90 PerCP (Clone OX-7)BD Biosciences, San Diego, CA, USA557266Functions in the cell: Signaling, adhesion. T lymphocyte, NK, monocyte, HSC, neuron, fibroblast
Ascorbic acidSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR1008
Automatic pipettesThermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA4700850NFinnpipette F1 Good Laboratory Pipetting (GLP) Kits
BeakerNot applicable1 unit
Bovine serum albuminSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAA7906
Cell culture plates (6-well)Merck, Darmstadt, GermanyZ70775907 units sterile. TPP tissue culture plates
Cell culture plates (96-well. Round or V bottom)Merck, Darmstadt, GermanyCLS35307701 unit sterile. Wells, 96, Tissue Culture (TC)-treated surface, round bottom clear wells, sterile
Chondrogenic mediumStem Pro Chondrogenesis Differentiation–Life TechnologiesA1007101TGF-β2, TGF-β3, dexamethasone, insulin, transferrin, ITS, sodium-l - ascorbate, sodium pyruvate, ascorbate-2-phosphate
Collagenase type IILife Technologies, California, USA17101015
cork or styrofoam board covered with aluminumNot applicable1 unit
cottonNot applicable50 g
DexamethasoneSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD4902
Dissecting scissorNot applicable03 units sterile
DPX Mountant for histologySigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA6522
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAD5523With 1000 mg/L glucose and L-glutamine, without sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture
Eosin BSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA861006
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAF4135
FormaldehydeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA47608
FormalinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAHT501128
GentamicinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG1397
HematoxylinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAH3136
Hypodermic Needle (0.3mm x 13mm)Not applicable5 units
IndomethacinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI0200000
InsulinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAI3536
IsopropanolSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA56393570% in H2O
Ketamine-D4 hydrochloride solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAK-0061.0 mg/mL in methanol (as free base), certified reference material, Cerilliant®
Neubauer chamberSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USABR718620BRAND counting chamber BLAUBRAND Neubauer pattern. With clips, double ruled
Nichiryo pipette tips (0.1–10 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645540Volume range 0.1–10 μL, elongated, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (1–10 mL)Merck, Darmstadt, GermanyZ717401Volume range 1–10 mL, universal, bulk pack. Sterile
Nichiryo pipette tips (200 μL)Merck, Darmstadt, GermanyZ645516Maximum volume 200 μL, graduated, ministack. Sterile
Oil-Red O solutionSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAO13910.5% in isopropanol
ParaffinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA107.15146–48, in block form
Penicillin/StreptomycinSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP4333Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, 0.1 μm filtered, BioReagent, suitable for cell culture
Phosphate-buffered saline solution 1x (PBS).Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAP3813Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions. Balanced and sterile
Polypropylene conical tubes (15 mL)Falcon, Fisher Scientific14-959-53ASterile
Polypropylene conical tubes (50 mL)Falcon, Fisher Scientific14-432-222 units sterile
scalpel (optional)Not applicable1 unit
Silver nitrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA85228
Sodium thiosulfateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USA72049
Surgical tweezer (15 cm)Not applicable3 units sterile
Swiss male mice (6–8 weeks)Bioterium, Santa Cruz State University021/22
syringe (1 mL)Not applicable1 unit
Trypan Blue DyeSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT81540.4%, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
Trypsin/EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)Sigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAT3924
XylazineSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAPHR3263
β-glycerophosphate disodium salt hydrateSigma-Aldrich, San Luis, Missouri, USAG9422BioUltra, suitable for cell culture, suitable for plant cell culture, ≥99% (titration)

Ссылки

  1. Caplan, A. I. Mesenchymal stem cells. J Orthop Res. 9 (5), 641-650 (1991).
  2. Pittenger, M., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. npj Regen Med. 4, 22 (2019).
  3. Lin, W., et al. Mesenchymal stem cells and cancer: Clinical challenges and opportunities. BioMed Res Int. 2820853, 1-12 (2019).
  4. Mazini, L., et al. Hopes and limits of adipose-derived stem cells (ADSCs) and mesenchymal stem cells (MSCs) in wound healing. Int J Mol Sci. 21 (4), 1306 (2020).
  5. Shi, Y., et al. Immunoregulatory mechanisms of mesenchymal stem and stromal cells in inflammatory diseases. Nat Rev Nephrol. 14 (8), 493-507 (2018).
  6. Uccelli, A., et al. Mesenchymal stem cells in health and disease. Nat Rev Immunol. 8 (9), 726-736 (2008).
  7. Dong, J., et al. Human adipose tissue-derived small extracellular vesicles promote soft tissue repair through modulating M1-to-M2 polarization of macrophages. Stem Cell Res Ther. 14 (1), 67 (2023).
  8. Maffioli, E., et al. Proteomic analysis of the secretome of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells primed by pro-inflammatory cytokines. J. Proteomics. 166, 115-126 (2017).
  9. Akiyama, K., et al. Mesenchymal-stem-cell-induced immunoregulation involves FAS-ligand-/FAS-mediated T cell apoptosis. Cell Stem Cell. 10, 544-555 (2012).
  10. Wang, Y., et al. Plasticity of mesenchymal stem cells in immunomodulation: pathological and therapeutic implications. Nat Immunol. 15, 1009-1016 (2014).
  11. Li, C., et al. Allogeneic vs. autologous mesenchymal stem/stromal cells in their medication practice. Cell Biosci. 11, 187 (2021).
  12. Zhang, J., et al. The challenges and promises of allogeneic mesenchymal stem cells for use as a cell-based therapy. Stem Cell Res Ther. 6, 234 (2015).
  13. Jurado, M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stromal cells as part of therapy for chronic graft-versus-host disease: A phase I/II study. Cytotherapy. 19 (8), 927-936 (2017).
  14. Zhang, M., et al. Mesenchymal stem cell-derived exosome-educated macrophages alleviate systemic lupus erythematosus by promoting efferocytosis and recruitment of IL-17+ regulatory T cell. Stem Cell Res Ther. 13 (1), 484 (2022).
  15. Fernández, O., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells (AdMSC) for the treatment of secondary-progressive multiple sclerosis: A triple blinded, placebo controlled, randomized phase I/II safety and feasibility study. PLoS One. 13 (5), 0195891 (2018).
  16. Abdolmohammadi, K., et al. Mesenchymal stem cell-based therapy as a new therapeutic approach for acute inflammation. Life Sci. 312, 121206 (2023).
  17. Hoang, D. M., et al. Stem cell-based therapy for human diseases. Signal Transduct Target Ther. 7 (1), 272 (2022).
  18. Lee, R. H., et al. Characterization and expression analysis of mesenchymal stem cells from human bone marrow and adipose tissue. Cell Physiol Biochem. 14 (4-6), 311-324 (2004).
  19. Strem, B. M., et al. Multipotential differentiation of adipose tissue derived stem cells. Keio J Med. 54 (3), 132-141 (2005).
  20. Kern, S., et al. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24 (5), 1294-1301 (2006).
  21. Dominici, M. D., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  22. Berryman, D. E., et al. Growth hormone's effect on adipose tissue: Quality versus quantity. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1621 (2017).
  23. Shomer, N. H., et al. Review of rodent euthanasia methods. J Am Assoc Lab Anim Sci. 59 (3), 242-253 (2020).
  24. Miranda, V. H. S., et al. Liver damage in schistosomiasis is reduced by adipose tissue-derived stem cell therapy after praziquantel treatment. PLoS Negl Trop Dis. 14 (8), e0008635 (2020).
  25. Li, H., et al. Isolation and characterization of primary bone marrow mesenchymal stromal cells. Ann N Y Acad Sci. 1370 (1), 109-118 (2016).
  26. Boregowda, S. V., et al. Isolation of mouse bone marrow mesenchymal stem cells. Methods Mol Biol. 1416, 205-223 (2016).
  27. Sreejit, P., et al. Generation of mesenchymal stem cell lines from murine bone marrow. Cell Tissue Res. 350 (1), 55-68 (2012).
  28. Bunnell, B. A. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Cells. 10 (12), 3433 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

in vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены