JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد طورنا منهجية لتقييم ما إذا كانت أورام الجهاز العصبي في الفئران المعدلة وراثيا تلخص بدقة أمراض نظرائهم من البشر. هنا ، نطبق هذه التقنيات النسيجية ، والمعايير المرضية المحددة ، ومنهجيات الثقافة على الأورام الليفية العصبية وأورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة الناشئة في نموذج الماوس P 0-GGFβ3.

Abstract

عادة ما يصاب المرضى الذين يعانون من متلازمة حساسية الورم الوراثي السائد من النوع 1 (NF1) بأورام ليفية عصبية ضفيرية الشكل (PNs) تتحول لاحقا إلى أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة شديدة العدوانية (MPNSTs). سيتم تسهيل فهم العملية التي يتحول بها PN إلى MPNST من خلال توفر نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) التي تكرر بدقة تقدم PN-MPNST الذي شوهد في البشر مع NF1. لسوء الحظ ، فإن نماذج GEM مع الاجتثاث Nf1 لا تلخص هذه العملية بالكامل. قادنا هذا إلى تطوير فئران P 0-GGFβ3 ، وهو نموذج GEM يؤدي فيه الإفراط في التعبير عن ميتوجين خلية شوان neuregulin-1 (NRG1) في خلايا Schwann إلى تطوير PNs التي تتطور لتصبح MPNSTs ذات تردد عال. ومع ذلك ، لتحديد ما إذا كان تكوين الورم وتطور الأورام في الفئران P 0-GGFβ3 نمذجة بدقة العمليات التي شوهدت في مرضى NF1 ، كان علينا أولا إثبات أن أمراض أورام غمد الأعصاب المحيطية P0-GGFβ3 تلخص أمراض نظرائهم من البشر.

هنا ، نصف المنهجيات المتخصصة المستخدمة لتشخيص أورام الجهاز العصبي المحيطي وتصنيفها بدقة في نماذج GEM ، باستخدام P 0-GGFβ3 و P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران كمثال. نصف الطرق النسيجية والكيميائية المناعية والكيميائية النسيجية المستخدمة لتشخيص PNs و MPNSTs ، وكيفية التمييز بين هذه الأورام وأنواع الأورام الأخرى التي تحاكي أمراضها ، وكيفية تصنيف هذه الأورام. نناقش إنشاء ثقافات المرور المبكر من GEM MPNSTs ، وكيفية توصيف هذه الثقافات باستخدام الكيمياء الخلوية المناعية ، وكيفية التحقق من ورمها من خلال إنشاء الطعم الخيفي. بشكل جماعي ، تميز هذه التقنيات أمراض PNs و MPNSTs التي تنشأ في نماذج GEM وتقارن بشكل نقدي أمراض أورام الفئران هذه بنظيراتها البشرية.

Introduction

على مدى العقود الثلاثة الماضية ، حاولت العديد من المختبرات إنشاء نماذج فئران للسرطانات البشرية عن طريق إدخال طفرات مرتبطة بالسرطان البشري في جينوم الفئران أو عن طريق الإفراط في التعبير عن منتج جيني يتم التعبير عنه بشكل مفرط في السرطانات البشرية. يمكن استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) الناتجة لمجموعة متنوعة من الأغراض مثل إثبات أن التعديل الجينومي الذي تم إدخاله حديثا يبدأ تكوين الورم ، وتحديد التغيرات الجينية أو اللاجينية الأخرى التي تحدث لاحقا والتي تساهم في تطور الورم ، وتحديد مسارات الإشارات الرئيسية التي تدفع بدء الورم وتطوره. على عكس نماذج xenograft التقويمية ، التي تعتمد على استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فإن نماذج السرطان GEM لديها نظام مناعي يعمل بكامل طاقته وبالتالي أكثر دقة نموذج الاستجابات للعوامل العلاجية المرشحة. ومع ذلك ، عند استخدام نماذج السرطان GEM لأغراض مثل هذه ، من الضروري أن يؤكد الباحثون أن الملاحظات التي تم إجراؤها باستخدام أورام GEM ذات صلة بنظرائهم من البشر. يجب أن يتضمن هذا التحقق تقييما شاملا لأمراض أورام GEM وتحديد ما إذا كانت السمات المرضية لأورام GEM تلخص علم الأمراض لنوع الورم البشري المقابل.

متلازمة حساسية الورم الورم العصبي الليفي من النوع 1 (NF1) هو المرض الوراثي الأكثر شيوعا الذي يؤثر على الجهاز العصبي البشري ، ويحدث في حوالي 1 من كل 3000-3500 ولادة حية1،2،3. يصاب الأفراد المصابون ب NF1 بأورام غمد عصبية محيطية حميدة متعددة تعرف باسم الأورام الليفية العصبية في جلدهم (الأورام الليفية العصبية الجلدية) وفي الأعصاب الكبيرة والضفائر العصبية (الأورام الليفية العصبية الضفيرية). في حين أن كل من الأورام الليفية العصبية الجلدية والضفيرية الشكل تزيد من سوء نوعية حياة المريض من خلال إنتاج ضعف جسدي وسلوكي و / أو اجتماعي ، فإن الأورام الليفية العصبية الضفيرية (PNs) خطيرة بشكل خاص 4,5. وذلك لأن PNs تتحول في كثير من الأحيان إلى أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة (MPNSTs) ، وهي أورام خلايا المغزل العدوانية مع معدل بقاء منخفض بشكل استثنائي 1,2. ويرجع هذا المعدل المنخفض للبقاء على قيد الحياة إلى حد كبير إلى أن أنظمة العلاج الإشعاعي والعلاج الكيميائي المستخدمة حاليا لعلاج MPNSTs غير فعالة. ومع ذلك ، فإن تطوير علاجات جديدة أكثر فعالية كان يمثل تحديا. هذا لأنه ، على الرغم من مدى شيوع حدوث MPNSTs في مرضى NF1 ، إلا أنها لا تزال أوراما نادرة. نتيجة لذلك ، من الصعب جدا الحصول على أعداد كبيرة من الأورام البشرية للدراسة. من الصعب أيضا تجنيد عدد كاف من المرضى الذين يعانون من MPNSTs للتجارب السريرية. للتغلب على هذه القيود ، تم إنشاء العديد من نماذج GEM بهدف اكتساب مزيد من الأفكار حول التشوهات التي تؤدي إلى التسبب في الورم العصبي الليفي وتطور PN-MPNST وتسهيل التجارب قبل السريرية مع العوامل العلاجية المرشحة.

مرضى NF1 لديهم طفرات معطلة في نسخة واحدة من جين NF1. يحدث التسبب في الورم العصبي الليفي عندما تحدث طفرة معطلة في جين NF1 الوظيفي المتبقي في خلية في سلالة خلية شوان. ومع ذلك ، من المثير للدهشة أنه عندما تم إنشاء الفئران مع طفرات Nf1 المعطلة للخط الجرثومي ، فإنها لم تصاب بأورام ليفية عصبية 6,7. العرض اللاحق أن الفئران التي تحتوي على خلايا Nf1-null Schwann و Nf1 haploinsufficiency في جميع أنواع الخلايا الأخرى (Krox20-Cre;Nf1flox / - الفئران) وضعت الأورام الليفية العصبية الضفيرية الشكل اقترح أن انخفاض جرعة الجين Nf1 في أنواع الخلايا الإضافية كان مطلوبا لتسبب الورم العصبيالليفي 8. حتى ذلك الحين ، الأورام الليفية العصبية الضفيرية في Krox20-Cre ؛ لم تتقدم الفئران Nf1flox / - لتصبح MPNSTs وبالتالي قلدت جزئيا فقط بيولوجيا نظيراتها البشرية. حدث التسبب في MPNST عندما تم مشاركة طفرات Nf1 مع طفرات في جينات مثبطة للورم إضافية مثل Trp539 أو Cdkn2a10 ، ولكن MPNSTs في نماذج GEM هذه طورت من جديد أو من الأورام الليفية العصبية غير النمطية ذات الإمكانات البيولوجية غير المؤكدة (ANNUBPs) 11،12 ، بدلا من الأورام الليفية العصبية الضفيرية الحميدة الموجودة مسبقا (انظر13،14 للحصول على مراجعات ممتازة لهذه النماذج بالإضافة إلى نماذج أخرى تقدم طفرات إضافية مرتبطة بفقدان الوظيفة MPNST في الجينات مثل Suz12 و Pten15).

كانت نماذج الفئران هذه لا تقدر بثمن لتأسيس الدور الذي تلعبه الجينات مثل NF1 و TP53 و CDKN2A في التسبب في أورام الجهاز العصبي المحيطي المرتبطة ب NF1 وللتجارب قبل السريرية التي تختبر العوامل العلاجية المرشحة. ومع ذلك ، لا يزال لدينا فهم غير مكتمل للعملية التي تتطور بها الأورام الليفية العصبية الضفيرية لتصبح أوراما ليفية عصبية غير نمطية ذات إمكانات بيولوجية غير مؤكدة (ANNUBPs16) ثم MPNSTs. تم إحراز بعض التقدم مؤخرا في فهم هذه العملية مع التقرير الأخير الذي يفيد بأن الفئران التي تم حذفها في Nf1 و Arf تطور ANNUBPs التي تتقدم لتصبح MPNSTs11. ومع ذلك ، فإن نماذج الفئران القائمة على طفرة Nf1 التي تلخص تماما عملية تطور الورم العصبي الليفي الضفيري-MPNST الذي شوهد في البشر غير موجودة بعد. بالإضافة إلى ذلك ، ليس من الواضح ما إذا كانت هناك مسارات متميزة متعددة تؤدي إلى تطوير MPNSTs. بالنظر إلى ذلك ، من الممكن أن تكون GEMs الموصوفة أعلاه نموذجا فقط لمجموعة فرعية من عدة مسارات مختلفة تؤدي إلى تطور الورم العصبي الليفي-MPNST والتسبب في MPNST. يتم التأكيد على هذه النقطة من خلال حقيقة أن MPNSTs تحدث أيضا بشكل متقطع وأن بعض MPNSTs المتفرقة على ما يبدو لا تحتوي على طفرات NF1 17,18.

على الرغم من أن هذه النقطة الأخيرة قد تم تحديها من خلال اقتراح Magollon-Lorenz et al. الأخير بأن بعض MPNSTs المتفرقة التي تفتقر إلى طفرات NF1 على الأقل هي أورام ميلانينية أو نوع مختلف من الساركوما19 ، فقد أبلغنا مؤخرا عن MPNST متقطع وخط خلية مشتق من هذا الورم (خلايا 2XSB) التي كانت NF1 من النوعالبري 20. أثناء توصيف الورم الأم وخط الخلايا 2XSB ، استبعدنا بشكل منهجي إمكانيات التشخيص البديلة ، بما في ذلك سرطان الجلد وأنواع الساركوما المتعددة الأخرى التي يتم أخذها في الاعتبار بشكل روتيني في التشخيص التفريقي لورم غمد العصب المحيطي الخبيثالمتقطع 20. بالإضافة إلى ذلك ، نلاحظ أن Magollon-Lorenz et al. أقروا بأن النتائج التي توصلوا إليها في خطوط خلايا MPNST الثلاثة المتفرقة التي درسوها لا يمكن تعميمها للإشارة إلى أن جميع الأورام التي تم تحديدها على أنها MPNSTs متفرقة ليست MPNSTs.

لبناء نموذج GEM الذي لم يكن فيه الورم العصبي الليفي والتسبب في MPNST يعتمدان بالضرورة على طفرات جينية معينة مثبطة للورم ، قمنا بتوليد فئران معدلة وراثيا كان فيها التعبير المفرط عن ميتوجين خلية شوان القوي neuregulin-1 (NRG1) مدفوعا بمحفز بروتين المايلين الخاص بخلية شوان صفر (P0) (الفئرانP 0-GGFβ3)21. لقد أظهرنا سابقا أن الأورام الليفية العصبية البشرية ، MPNSTs ، وخطوط خلايا MPNST تعبر عن العديد من الأشكال المتماثلة NRG1 جنبا إلى جنب مع كينازات التيروزين مستقبلات erbB (erbB2 و erbB3 و erbB4) التي تتوسط إشارات NRG1 وأن مستقبلات erbB هذه يتم تنشيطها بشكل أساسي22. لقد أثبتنا أيضا أن المثبطات الدوائية لكينازات erbB تمنع بقوة انتشار MPNST22 والبقاء على قيد الحياة23 والهجرة24. تمشيا مع ملاحظاتنا في البشر ، P 0-GGFβ3 الفئران تطوير الأورام الليفية العصبية الضفيرية25 التي تتقدم لتصبح MPNSTs في تردد عال 21,25. لقد أظهرنا أن P 0-GGFβ3 MPNSTs ، مثل نظرائهم من البشر ، يطورون عادة طفرات في Trp53 و Cdkn2a ، بالإضافة إلى العديد من التشوهات الجينومية الأخرى التي من المحتمل أن تساهم في تكوين الورم25. MPNSTs الناشئة في الفئران P 0-GGFβ3 ليس لديها طفرات Nf1 معطلة. ومع ذلك ، باستخدام المكمل الجيني ، أظهرنا أن NRG1 يعزز تكوين الورم في الفئران P 0-GGFβ3 في الغالب من خلال نفس شلالات الإشارات التي يتم تغييرها بواسطة فقدان Nf1 26 ؛ يستند هذا الاستنتاج إلى النتيجة التي توصلنا إليها بأن استبدال التعبير المفرط NRG1 بفقدان Nf1 في وجود عدم كفاية Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- الفئران) تنتج التي تتطور فيها MPNSTs من جديد ، كما هو موضح في cis-Nf1 +/-؛ Trp53 +/- الفئران27.

للحصول على هذه المعلومات وغيرها من المعلومات التي تثبت أن الفئران P 0-GGFβ3 نمذجة دقيقة لعمليات التسبب في الورم العصبي الليفي وتطور الورم العصبي الليفي-MPNST الذي شوهد في البشر المصابين ب NF1 ، قمنا بتطوير منهجيات متخصصة لمعالجة الأنسجة من هذه ، وتشخيص أورامها بدقة ، وتصنيف MPNSTs الناشئة في هذه الفئران ، وإنشاء وتوصيف المرور المبكر P0-GGFβ3 و P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- مزارع MPNST ومقارنة نقدية لأمراض P 0-GGFβ3 PNs و MPNSTs و P0-GGFβ3 ؛ Trp53 + / - MPNSTs إلى نظرائهم من البشر. العديد من هذه المنهجيات قابلة للتعميم على نماذج GEM الأخرى لأورام الجهاز العصبي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن العديد من هذه المنهجيات قابلة للتطبيق على نطاق أوسع على نماذج GEM التي تنشأ فيها الأورام في مواقع الأعضاء الأخرى. وبالتالي ، نقدم هنا وصفا مفصلا لهذه المنهجيات.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة هنا من قبل IACUC التابع لجامعة ساوث كارولينا الطبية وتم تنفيذها من قبل موظفين مدربين بشكل صحيح وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية في MUSC.

1. تحديد اختراق الورم والبقاء على قيد الحياة في الفئران P 0-GGFβ3 وتحديد الأورام في هذه لمزيد من التوصيف

  1. توليد مجموعة من الفئران التي سيتم تقييمها لتكوين الأورام. يعتمد عدد الفئران المطلوبة على اختراق النمط الظاهري للورم. للتعويض عن مثل هذه الخسائر ، ابدأ بمجموعة أعلى بنسبة 10-15٪ من العدد النهائي المطلوب للحيوانات.
    ملاحظة: حددنا اختراق الورم في الفئران P 0-GGFβ3 تجريبيا في مجموعة أولية من 50 فأرا (ستة منها فقدت لأسباب لا علاقة لها بالأورام (مثل القتال))25.
  2. تقييم صحة ثلاث مرات أسبوعيا وتسجيل درجات حالة الجسم ، بما في ذلك الوزن والتغيرات السلوكية في كل فحص. إنهاء الفئران الحاملة للورم أو المحتضرة (انظر الملاحظة أدناه) باستخدام القتل الرحيم بثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم. سجل العمر عند الوفاة بالأيام. إذا كانت الأورام مرئية خارجيا ، فقم بتسجيل أبعاد الورم (الطول والعرض والارتفاع).
    ملاحظة: من الضروري عدم السماح للحيوانات بالمضي قدما بعد الحد الأقصى المسموح به لحجم الورم و / أو نقطة النهاية الإنسانية المعتمدة من IACUC.
  3. باستخدام العمر عند الوفاة ، قم بإنشاء منحنى بقاء كابلان ماير لتحديد متوسط العمر عند الوفاة ومدى البقاء على قيد الحياة.
    ملاحظة: كان متوسط عمر الفئرانP 0-GGFβ3 عند الوفاة 261.5 يوما ، مع نطاق يتراوح بين 74-533 يوما. كان 91٪ من مجموعتنا يعانون من أورام ليفية عصبية متعددة و 71٪ لديهمMPNSTs 21.
  4. حدد ما إذا كانت الأورام المرئية بشكل صارخ موجودة ، وإذا كانت موجودة ، فقم بتشريحها في ظل ظروف معقمة لتحديد ما إذا كان الورم مرتبطا بعصب محيطي ثم استئصال الورم. في P 0-GGFβ3 و P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران ، أورام غمد الأعصاب الطرفية هي الأكثر شيوعا في الأعصاب مثلث التوائم والوركي. حتى إذا لم يتم رؤية الأورام المرئية بشكل صارخ بالاقتران مع هذه الأعصاب ، فقم بإصلاح هذه الأعصاب وتضمينها كما هو موضح أدناه حتى يمكن فحصها بحثا عن وجود أورام دقيقة. تحدث الأورام الدقيقة عادة داخل العقد المرتبطة بهذه الأعصاب.
  5. قطع الأورام المرئية بشكل صارخ إلى ثلاث قطع (الشكل 1 أ). استخدم القطعة 1 لعلم الأنسجة (أقسام البارافين والكيمياء الهيستولوجية المناعية والكيمياء النسيجية). استخدم القطعة 2 لإنشاء ثقافات المرور المبكر. قطعة التجميد المفاجئة 3 (باستخدام النيتروجين السائل) للتجارب المستقبلية المحتملة (على سبيل المثال ، البقع المناعية والحمض النووي الريبي وعزل الحمض النووي).
  6. ثبت القطعة 1 في 4٪ بارافورمالدهيد في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) طوال الليل عند 4 درجاتمئوية. ثبت ما تبقى من جسم عن طريق الغمر في 4٪ بارافورمالدهيد طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

2. تضمين البارافين للأورام المرئية بشكل صارخ وإعداد أقسام ملطخة بالهيماتوكسيلين والإيوزين للتقييم التشخيصي الأولي

  1. تضمين البارافين للأورام المرئية بشكل صارخ
    1. بعد تثبيت قطعة الورم 1 بين عشية وضحاها في 4 ٪ بارافورمالدهايد ، شطف الأنسجة عن طريق وضعها في حجم PBS الذي لا يقل عن 10x أكبر من حجم الأنسجة لمدة 15 دقيقة. استخدم نفس الحجم لجميع الشطف اللاحق. كرر شطفتين إضافيتين لمدة 15 دقيقة من برنامج تلفزيوني ، باستخدام حجم جديد من PBS لكل شطف.
    2. نقل قطعة الورم 1 إلى 70 ٪ من الإيثانول. امسك المنديل في 70٪ إيثانول لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية. إذا رغبت في ذلك ، قم بتخزين الأنسجة على المدى الطويل في ظل هذه الظروف.
      ملاحظة: الخطوات من 2-1-1 إلى 2-1-7 مقدمة لفائدة المحققين الذين لا يستطيعون الوصول إلى آلة تجارية لمعالجة الأنسجة. إذا كان لدى الباحث إمكانية الوصول إلى معالج الأنسجة ، فستتم معالجة الأنسجة من خلال الإيثانول المتدرج والزيلين وفقا لبروتوكول الأداة المبرمجة.
    3. نقل قطعة الورم 1 إلى 80 ٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة لمدة 30 دقيقة إضافية في حجم جديد من الإيثانول بنسبة 80٪.
    4. نقل قطعة الورم 1 إلى 95 ٪ من الإيثانول لمدة 75 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة مرتين أخريين ، في كل مرة لمدة 75 دقيقة إضافية في حجم جديد من الإيثانول بنسبة 95٪.
    5. نقل قطعة الورم 1 إلى 100 ٪ من الإيثانول واحتضانها لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة لمدة 60 دقيقة مرتين أخريين ، في كل مرة باستخدام حجم جديد من الإيثانول بنسبة 100٪.
    6. نقل قطعة الورم 1 إلى مذيب قائم على الليمونين واحتضانها لمدة 30-60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نقل قطعة الورم 1 إلى حجم جديد من المذيب القائم على الليمونين واحتضانها لمدة 30-60 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة.
    7. انقل قطعة الورم 1 إلى 1: 1 مذيب قائم على البارافين / د-الليمونين لمدة ساعة واحدة عند 60 درجةمئوية. تخلص من المذيب القائم على البارافين 1: 1 / د-الليمونين وانقل قطعة الورم من 1 إلى 60 درجةمئوية واحتضانها لمدة 20 دقيقة عند 60 درجةمئوية. كرر الحضانة في حجم جديد من 60 درجةمئوية من البارافين مرة أخرى لمدة 20 دقيقة. احتضان قطعة الورم 1 في البارافين بين عشية وضحاها في 60 درجة مئوية.
    8. صب طبقة أساسية من البارافين في قالب الأنسجة الصلب واتركها تصلب. انقل قطعة الورم 1 إلى سطح البارافين الأساسي وبعد وضعه مباشرة ، قم بتغطية الأنسجة ببارافين 60 درجةمئوية وضع كاسيت الأنسجة فوق البارافين المنصهر وملامسته له. انقل القالب إلى الجانب البارد من محطة التضمين واتركه يتجمد لمدة 10-15 دقيقة.
    9. قم بإزالة كتلة البارافين مع كاسيت الأنسجة المرفق من القالب. استخدم شريط الأنسجة المرفق لتثبيت الكتلة في الميكروتوم أثناء التقطيع.
      ملاحظة: يمكن الآن تخزين كتلة البارافين إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة.
  2. تحضير أقسام الهيماتوكسيلين واليوزين الملطخة بالأورام المرئية بشكل صارخ.
    1. قطع 4-5 ميكرومتر أقسام من أنسجة الورم باستخدام ميكروتوم وتركيبها على شرائح زجاجية موجبة الشحنة.
    2. لأداء تلطيخ الهيماتوكسيلين والإيوزين (H&E ، قم بإزالة البارافين من أقسام الأنسجة عن طريق احتضان الشرائح في مذيب قائم على د-ليمونين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. كرر الحضانة في حجم جديد من المذيب القائم على د-ليمونين لمدة 10 دقائق.
    3. انقل الشرائح إلى إيثانول 100٪ واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل الشرائح إلى حجم جديد من الإيثانول بنسبة 100٪ واحتضانها لمدة 5 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة.
    4. انقل الشرائح إلى 95٪ إيثانول واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. انقل الشرائح إلى حجم جديد من الإيثانول بنسبة 95٪ واحتضانها لمدة 5 دقائق أخرى في درجة حرارة الغرفة.
    5. انقل الشرائح إلى 70٪ إيثانول واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم ، نقل إلى 50 ٪ من الإيثانول واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. انقل الشرائح إلى الماء المقطر واحتضانها لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. تلطيخ الشرائح عن طريق غمرها في الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. شطف بماء الصنبور الجاري لمدة 1-2 دقيقة. التفريق عن طريق غمس الشرائح 2-5x في 0.5 ٪ حمض الهيدروكلوريك في 70 ٪ من الإيثانول. شطف في حمام ماء الصنبور الجاري لمدة 1-2 دقيقة. ضع الشرائح في 95٪ إيثانول مع 0.5٪ حمض الخليك لمدة 10 ثوان.
    8. قم بتلطيخ الشرائح باستخدام eosin-Y لمدة 30 ثانية في درجة حرارة الغرفة ثم انقل الشرائح إلى إيثانول 100٪ لمدة 5 دقائق. امسح العينات في مذيب قائم على الليمونين لمدة 5 دقائق.
    9. قم بتركيب أغطية باستخدام وسيط تثبيت قائم على الزيلين بينما لا تزال الشريحة مبللة بالمذيب القائم على d-limonene. اسمح لوسيط التثبيت بالضبط طوال الليل.
      ملاحظة: لا تستخدم وسيط تركيب مائي.
  3. تحضير الأنسجة دون أورام مرئية بشكل صارخ لتحديد الأورام الليفية العصبية الضفيرية و MPNSTs الدقيقة. قم بتضمين الأنسجة في البارافين ، وقم بإعداد الأقسام النسيجية ، وصمة عار هذه الأقسام بالهيماتوكسيلين ويوزين.
    1. قم بإزالة الأعضاء الداخلية وتضمين أجزاء تمثيلية من كل عضو في البارافين لإعداد أقسام ملطخة ب H&E سيتم فحصها بحثا عن أدلة مجهرية على وجود أورام (الشكل 1 ب). قم بإزالة الرأس والأطراف الأمامية والأطراف الخلفية والذيل (الشكل 1C). لفحص الحبل الشوكي وجذور الأعصاب في الموقع بحثا عن دليل على أورام جذر العصب ، قم بإزالة الكلس من العمود الفقري والأضلاع والأنسجة الرخوة المرتبطة به عن طريق الغمر في 0.3 M EDTA / 4٪ paraformaldehye (درجة الحموضة 8.0) لمدة 48-72 ساعة عند 4 درجةمئوية ؛ ثم ، شطف العينات مع 1x PBS. في نهاية إزالة الكلس ، تأكد من اكتمال إزالة الكلس عن طريق محاولة اختراق العمود الفقري بإبرة. تنجح إزالة الكلس إذا اخترقت الإبرة العظم بسهولة دون طحن.
    2. قطع العمود الفقري منزوع الكلس والهياكل المرتبطة به إلى كتل تتناسب مع كاسيت الأنسجة. قم بالجفاف من خلال الإيثانول المتدرج متبوعا بمذيب قائم على d-limonene كما هو موضح في الخطوات 2.1.2-2.1.7. قم بتضمين البارافين وإعداد أقسام 4-5 ميكرومتر كما هو موضح في الخطوات 2.1.7-2.2.1. إجراء بقع H&E كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.9 ؛ اسمح لوسيط التثبيت بالضبط طوال الليل.

3. تحديد الأورام الليفية العصبية الضفيرية المحتملة وإجراء بقع خاصة لتأكيد التشخيص

ملاحظة: نوصي بشدة بتضمين أخصائي علم الأمراض البشري أو البيطري ذي الخبرة في تقييم H& E والبقع الخاصة لأقسام ورم GEM.

  1. افحص الشرائح الملطخة ب H&E المحضرة كما هو موضح أعلاه باستخدام الفحص المجهري برايت فيلد لتحديد أورام غمد الأعصاب المحيطية المحتملة. نظرا لأن الأورام الليفية العصبية و MPNSTs تنشأ داخل الأعصاب الطرفية ، فمن المهم تحديد ما إذا كانت الأورام المجهرية مرتبطة بالعصب المحيطي. حدد الكتل التي تحتوي على أورام غمد الأعصاب المحيطية المحتملة بحيث يمكن إجراء البقع المناعية والبقع الخاصة الأخرى لتأكيد التشخيصات أو دحضها.
  2. تمييز PNs المحتملة من MPNSTs / الأورام الأخرى عالية الجودة بناء على السمات النسيجية التي شوهدت أثناء فحص برايت فيلد للأقسام الملطخة ب H&E. PNs البشرية هي أورام مفرطة الخلية تتكون في الغالب من خلايا ذات نوى ممدودة ومموجة في كثير من الأحيان. في العديد من المناطق ، تكون الخلايا معبأة بشكل فضفاض ويمكن فصلها بواسطة مادة مخاطية خارج الخلية. PNs في الفئران P 0-GGFβ3 لها مظهر مماثل. الميتوسيس عادة غير موجودة. إذا كان الأمر كذلك وكان الورم معتدلا إلى مفرط الخلايا ، فإن الورم هو MPNST أو نوع آخر من الأورام عالية الدرجة (انظر أدناه).
  3. تتكون PNs من خليط من خلايا Schwann الورمية وأنواع الخلايا غير الورمية الأخرى مثل الخلايا البدينة. لتأكيد هوية PN ، قم بإجراء بقع مناعية لعلامات خلايا Schwann S100β و Sox10 وعلامة الخلايا البدينة CD117 (c-Kit) على أقسام من الكتل التي تحتوي على PNs المحتملة المحددة في فحص H&E (انظر القسم 3.4 للحصول على خيارات تلطيخ بديلة لعلامة الخلايا البدينة). قم بإجراء Ki67 immunostains لتأكيد معدلات الانتشار المنخفضة.
    ملاحظة: يسرد الجدول 1 علامات المستضد المستخدمة للتحديد الروتيني للأورام الليفية العصبية الضفيرية GEM (S100β ، Sox10 ، CD117 ، Ki67) ، وتشخيص MPNSTs ، ولإجراء تقييم كامل لأنواع الخلايا الأخرى الموجودة في الأورام الليفية العصبية ؛ نحن نلطخ هذه المستضدات الأخيرة فقط عند وصف نموذج GEM الجديد لأول مرة. راجع ورقة بيانات الشركة المصنعة للأجسام المضادة لمعرفة الحالات الموصى بها. لاحظ ما إذا كان إدخال الشركة المصنعة للأجسام المضادة يوصي باسترجاع المستضد ؛ لا تتطلب جميع المستضدات الاسترجاع لتكون قابلة للاكتشاف.
    1. قم بإعداد أقسام 4-5 ميكرومتر من كتل البارافين المحددة وقم بتركيبها على شرائح موجبة الشحنة. إزالة البارافين من الأقسام كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.6.
    2. شطف المقاطع مع 1x PBS لمدة 3-5 دقائق.
    3. إذا أوصت الشركة المصنعة للأجسام المضادة باسترجاع المستضد ، فقم بإعداد المخزن المؤقت للسيترات. الجمع بين 9 مل من محلول حامض الستريك (10.5 غرام من حامض الستريك في 500 مل من الماء المقطر) و 41 مل من محلول سترات الصوديوم (14.7 غرام من سترات الصوديوم في 500 مل من الماء المقطر).
    4. قم بإجراء استرجاع المستضد عن طريق وضع الشرائح في مخزن سترات مؤقت لمدة 20 دقيقة في قدر أرز ساخن.
    5. نقل الشرائح إلى 3٪ بيروكسيد الهيدروجين / 1x PBS لمدة 10 دقائق للقضاء على نشاط البيروكسيديز في الأنسجة.
      ملاحظة: اجعل هذا المحلول طازجا في كل مرة ولا تستخدم محلول مخزون بيروكسيد الهيدروجين إذا كان عمره أكثر من 3-4 أشهر.
    6. شطف المقاطع في 1x PBS.
    7. حظر المقاطع باستخدام المخزن المؤقت للحظر (2٪ BSA ، 0.1٪ Triton X-100 في 1x PBS) لمدة 1 ساعة. شطف الشرائح لفترة وجيزة في 1x PBS.
    8. أضف الأجسام المضادة الأولية إلى أقسام الأنسجة. تحضير الأجسام المضادة الأولية في المخزن المؤقت المخفف. احتضان الشرائح لمدة 2 ساعة عند 37 درجةمئوية أو بين عشية وضحاها في 4 درجةمئوية.
    9. اغسل الشرائح في 1x PBS لمدة 5 دقائق. كرر 3x.
    10. احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الثانوية البيوتينيل لمدة 1-2 ساعة.
    11. تحضير محلول ديامينوبنزيدين (DAB) بناء على بروتوكول الشركة المصنعة واغمر الشرائح في المحلول لمدة 2-10 دقائق. اغسل الشرائح في الماء لمدة 5 دقائق.
    12. أقسام مضادة عن طريق غمرها في الهيماتوكسيلين لمدة 10-15 دقيقة. تعرض للمياه الجارية حتى تصبح صافية. تراجع بسرعة الشرائح في الكحول وشطف الشرائح في الماء.
    13. قم بتجفيف الشرائح في الإيثانول المتدرج عن طريق غمس الشرائح بسرعة ، 4-5x لكل محلول ، في 70٪ إيثانول ، 95٪ إيثانول ، ثم 100٪ إيثانول. احتضان الشرائح في مذيب قائم على الليمونين لمدة 2 دقيقة. احتضان الشرائح في دفعة ثانية من المذيبات القائمة على الليمونين لمدة 2 دقيقة.
    14. قم بتركيب الشرائح باستخدام وسيط تركيب قائم على الزيلين.
    15. فحص الشرائح بواسطة المجهر برايتفيلد.
    16. بالنسبة للتألق المناعي ، احذف الخطوات 3.3.10-3.3.15. بدلا من ذلك ، احتضان الأنسجة مع الأجسام المضادة الثانوية الخاصة بالأنواع المخففة في منع العازلة لمدة 1-2 ساعة.
    17. شطف الشرائح في 1x PBS لمدة 5 دقائق. كرر 3x.
    18. قم بتركيب الشرائح باستخدام 1x PBS / glycerol.
    19. افحص الشرائح باستخدام الفحص المجهري الفلوري.
  4. طريقة بديلة لتلطيخ الخلايا البدينة: تلطيخ التولويدين الأزرق
    1. تحضير محلول مخزون التولويدين الأزرق عن طريق إذابة 1 غرام من التولويدين الأزرق O في 100 مل من الإيثانول بنسبة 70٪.
    2. تحضير محلول كلوريد الصوديوم (NaCl) بنسبة 1٪ عن طريق إذابة 0.5 جم من كلوريد الصوديوم في 50 مل من الماء المقطر. تخلط لتذوب. اضبط الأس الهيدروجيني على حوالي 2.0-2.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك.
      ملاحظة: يجب أن يكون محلول كلوريد الصوديوم هذا طازجا في كل مرة يتم فيها إجراء البقع.
    3. تحضير محلول عمل التولويدين الأزرق بإضافة 5 مل من محلول مخزون التولويدين الأزرق إلى 45 مل من محلول كلوريد الصوديوم 1٪. تخلط جيدا وتأكد من أن الرقم الهيدروجيني حوالي 2.3.
      ملاحظة: الرقم الهيدروجيني الأعلى من 2.5 سيؤدي إلى تلطيخ مع أقل metachromasia. اجعل هذا الحل طازجا في كل مرة يتم فيها تلطيخها.
    4. إزالة البارافين من 4-5 ميكرومتر من المقاطع المركبة على شرائح موجبة الشحنة كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.6. اغسل المقاطع منزوعة البارافين بالماء الجاري لمدة 2 دقيقة.
    5. أقسام وصمة عار في حل العمل الأزرق تولويدين لمدة 2-3 دقائق. يغسل بالماء المقطر لمدة 2 دقيقة.
    6. قم بتجفيف المقاطع عن طريق غمس 10 أضعاف في 95٪ إيثانول. تراجع الشرائح في 100 ٪ الإيثانول 10x. تراجع الشرائح في الإيثانول الطازج 100 ٪ 10 مرات أكثر.
    7. احتضان الشرائح في مذيب قائم على الليمونين لمدة 2 دقيقة. احتضان الشرائح في دفعة ثانية من المذيبات القائمة على الليمونين لمدة 2 دقيقة.
    8. قم بتركيب أغطية باستخدام وسيط تثبيت قائم على الزيلين بينما لا تزال الشريحة مبللة بمذيب قائم على d-limonene.
      ملاحظة: لا تستخدم وسيط تركيب مائي.
    9. فحص الشرائح بواسطة المجهر برايتفيلد. تحديد الخلايا البدينة من خلال وجود حبيبات أرجوانية داكنة في السيتوبلازم. أنواع الخلايا الأخرى ملطخة باللون الأزرق الفاتح.

4. بقع خاصة لتشخيص MPNSTs واستبعاد التشخيصات البديلة

  1. المظهر النسيجي ل MPNSTs البشرية متغير للغاية والعديد من أنواع الأورام المختلفة لها مظهر مشابه لمظهرMPNSTs 28. نظرا لأن MPNSTs مشتقة من سلالة خلايا Schwann ، حدد ما إذا كان الورم ينشأ من عصب محيطي أو داخل PN حميد موجود عن طريق الفحص الإجمالي أو الفحص المجهري برايتفيلد للأقسام الملطخة ب H&E. على الرغم من أن MPNSTs لا توجد أحيانا مرتبطة بالعصب المحيطي أو PN (عادة بسبب الانفصال غير المقصود عن العصب أثناء التسلخ ، أو تدمير PN الموجود مسبقا عبر فرط نمو MPNST ، أو لأن الآفة نقيلية) ، ابحث عن ارتباط الورم بعصب أو PN لأن التشخيص أقل احتمالا إذا لم يكن الورم مرتبطا بعصب أو PN.
  2. قم بإعداد أقسام 4-5 ميكرومتر من كتل البارافين التي تحتوي على MPNSTs المحتملة وقم بتركيبها على شرائح موجبة الشحنة كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. إزالة البارافين من الأقسام كما هو موضح في الخطوات 2.2.2-2.2.6.
  3. إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية مع لوحة الأجسام المضادة المشار إليها في الجدول 2 كما هو موضح في الخطوات 3.3.1-3.3.15.
  4. فحص البقع المناعية بواسطة مجهر برايتفيلد. نظرا لأن MPNSTs تظهر تمايز شواني ، فابحث عن تفاعل مناعي موحد أو غير مكتمل ل S100β و nestin و Sox10. إذا لم تكن الأورام إيجابية لهذه العلامات الثلاثة ، فارجع إلى الجدول 2 لتحديد التشخيص.
    ملاحظة: يمكن أن تظهر MPNSTs البشرية والماوس تمايز متباين. على سبيل المثال ، تظهر بعض MPNSTs البشرية تمايز الأرومات العضلية المخططة البؤرية (تعرف هذه المتغيرات باسم أورام Triton الخبيثة) ؛ على الرغم من أن هذه الأورام سوف تلطخ علامات Schwannian ، إلا أنها تعبر أيضا عن علامات العضلات مثل desmin و MyoD1 و myogenin. لا ينبغي أن يثني النشاط المناعي لهذه العلامات الأخيرة الباحثين عن تشخيص الورم على أنه MPNST. على الرغم من إنشاء نماذج متعددة للفئران تعبر بشكل مشروط عن جين الاندماج SS18-SSX لنمذجة التسبب في الساركوما الزليلية29 ، على حد علمنا ، فإن نماذج الساركوما الزليلية التي تولد تلقائيا نسخة الاندماج المكافئة غير معروفة. وبالتالي ، فإننا لا نبحث عن نصوص اندماج SS18-SSX في أورام GEM ونعتمد بدلا من ذلك على الملامح المناعية الكيميائية.

5. تصنيف MPNSTs

  1. تحديد ما إذا كان نخر الورم ، وهو السمة المميزة ل WHO من الدرجة الرابعة MPNSTs ، موجودا. بالنسبة إلى MPNSTs من الدرجة الرابعة ، ابحث عن فرط الخلية البارز ، والنشاط الانقسامي السريع (≥4 انقسامات لكل 10 حقول عالية الطاقة (40x)) ، واللانمطية الخلوية.
    1. إذا لم يكن النخر موجودا ، فقم بتقييم الورم لتحديد ما إذا كانت فرط الخلية والنشاط الانقسامي السريع واللانمطية الخلوية موجودة. إذا كانت جميع هذه الميزات موجودة في حالة عدم وجود نخر ، فقم بتصنيف الورم على أنه MPNST من الدرجة الثالثة لمنظمة الصحة العالمية.
    2. تتميز أورام منظمة الصحة العالمية من الدرجة الثانية بالخلوية التي تزداد ، ولكن بدرجة أقل من منظمة الصحة العالمية من الدرجة الثالثة والرابعة MPNSTs. تظهر نوى الخلايا السرطانية في MPNST من الدرجة الثانية لمنظمة الصحة العالمية زيادة في الحجم (أكثر من 3 أضعاف حجم نوى الخلايا السرطانية في الأورام الليفية العصبية) وفرط اللون. ترتبط زيادة النشاط الانقسامي (<4 انقسامات لكل 10 مجالات عالية الطاقة) بأورام منظمة الصحة العالمية من الدرجة الثانية ، ولكنها ليست شرطا لها.
      ملاحظة: نظرا لأن الأورام ذات الدرجة الأعلى تتطور عادة من الدرجات الدنيا ، فقد توجد مناطق منخفضة الدرجة وعالية الدرجة في نفس MPNST. في هذه الحالة ، يتم تحديد درجة الورم من خلال المنطقة الأعلى درجة الموجودة.
      ملاحظة: هناك جدل بين أخصائيي علم الأمراض البشرية حول ما إذا كان نظام تصنيف منظمة الصحة العالمية الموصوف أعلاه يتنبأ بنتائج المرضى ويفضل بعض أخصائيي علم الأمراض هؤلاء بدلا من ذلك تصنيف MPNSTs على أنها درجة منخفضة أو درجة عالية. بموجب هذا المخطط ، تحتوي MPNSTs عالية الجودة على لانمطية خلوية بارزة ، ونشاط انقسامي سريع (>5 انقسامات لكل 10 حقول طاقة عالية) ، وفرط خلوي ملحوظ مع أو بدون نخر. تفتقر MPNSTs منخفضة الدرجة إلى النخر ولكنها تظهر نشاطا انقساميا ، ونمطية خلوية ، وخلوية وسيطة بين MPNST عالي الجودة وورم ليفي عصبي غير نمطي مع إمكانات بيولوجية غير معروفة (ANNUBP). نحن نفضل النظام الموصوف أعلاه لأن التمييز بين ANNUBP و MPNST منخفض الدرجة يمكن أن يمثل تحديا للمحققين الذين ليس لديهم خبرة طويلة مع هذه الكيانات.

6. إعداد ثقافات المرور المبكر P 0-GGFβ3 MPNST الخلايا

  1. مزرعة المرور المبكر P 0-GGFβ3 الخلايا السرطانية من قطعة الورم الطازجة 2 (الخطوة 1.5 ، الشكل 1A). الحفاظ على ظروف معقمة من هذه النقطة فصاعدا.
    1. فصل الورم عن طريق تقطيعه إلى قطع صغيرة (2-4 مم) وفرمه في DMEM10 (الحد الأدنى من الوسط الأساسي ل Dulbecco) الذي يحتوي على مصل عجل الجنين بنسبة 10٪ ، و 2 ميكرومول / لتر فورسكولين ، و 10 نانومول / لتر نيوريجولين 1β (NRG1β) في أطباق زراعة الأنسجة 100 مم.
    2. اسمح للخلايا بالنمو من شظايا الأنسجة المفرومة عند 37 درجةمئوية في 5٪ CO2 حتى تتلاقى الألواح. تغيير الوسائط كل 3-4 أيام.
    3. تقسيم ثقافة الخلية. قم بإزالة الوسائط من طبق 100 مم واغسل الخلايا باستخدام PBS ؛ إزالة وتجاهل الأنسجة المفرومة. إزالة PBS وإضافة 1 مل من 0.25 ٪ التربسين لمدة 2-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. لتعزيز انفصال الخلايا ، اضغط برفق على اللوحة وتحقق من الانفصال باستخدام مجهر ضوئي ؛ تمديد حضانة التربسين حسب الحاجة.
    4. تحييد التربسين بإضافة 2 مل من DMEM10. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب طرد مركزي وخلايا بيليه عند 500 × جم لمدة 5 دقائق. قم بإزالة الوسائط وإضافة 5 مل من DMEM10 الطازج إلى الحبيبات.
    5. قم بتوزيع تعليق الخلية في طبقين إلى أربعة أطباق 100 مم تحتوي على DMEM10. لا تقم بتقسيم الخلايا لأكثر من خمسة مقاطع (الخطوتان 6.1.3 و 6.1.4) واحتفظ بها في DMEM بدون فورسكولين و NRG1β. تذكر تجميد الخلايا عند المقطع 2 لاستخدامها في المستقبل.

7. التحقق من هوية خلايا MPNST ذات المرور المبكر عن طريق الكيمياء الخلوية المناعية

  1. ضع أغطية زجاجية مستديرة معقمة مقاس 18 مم # 1.5 في آبار أطباق زراعة الأنسجة المعقمة المكونة من 6 آبار.
    1. ضع محلول بولي-L-ليسين / لامينين في الآبار بحجم كاف لتغطية غطاء الغطاء. أغلق اللوحة بغلاف بلاستيكي لتقليل التبخر. احتضان في 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في صباح اليوم التالي ، اغسل أغطية الغطاء 3x باستخدام برنامج تلفزيوني معقم.
      ملاحظة: لقد حاولنا وضع خلايا MPNST ذات المرور المبكر على أغطية غير مطلية ووجدنا أن الخلايا لا تلتصق جيدا في حالة عدم وجود طلاء poly-L-lysine / laminin.
    2. ضع 10000 خلية على غطاء الغطاء عن طريق إضافة 2 مل من معلق الخلية برفق في وسائط النمو إلى كل بئر تحتوي على قسيمة الغطاء. احتضان الألواح طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 في حاضنة زراعة الأنسجة.
    3. في صباح اليوم التالي ، اشطف أغطية الغطاء لمدة 2 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني.
    4. إصلاح الخلايا مع 4 ٪ بارافورمالدهيد في برنامج تلفزيوني لمدة 18 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. شطف أغطية 3 × 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني. إذا رغبت في ذلك ، أغلق اللوحة باستخدام فيلم بلاستيكي وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية في هذه المرحلة.
    6. اصنع 50 مللي متر NH4Cl طازجة في برنامج تلفزيوني. إخماد الألدهيدات عن طريق احتضان أغطية في 50 mM NH4Cl في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    7. تتخلل الخلايا عن طريق احتضان أغطية في 0.3٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل أغطية الملابس لمدة 3 × 5 دقائق باستخدام PBS.
    8. منع الربط غير المحدد عن طريق احتضان أغطية في المخزن المؤقت المانع (1x PBS يحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري ، و 0.2٪ حليب جاف منزوع الدسم ، و 0.3٪ Triton X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    9. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر وأضف أجساما مضادة أولية تتعرف على علامات MPNST الموجودة في الورم الأصلي (عادة S100β و Nestin و Sox10) المخففة إلى التخفيف الأمثل المحدد مسبقا في المخزن المؤقت للحظر. لف الطبق بغشاء بلاستيكي واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل في غرفة مرطبة.
    10. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني لإزالة الأجسام المضادة الأولية غير المرتبطة. أضف جسما مضادا ثانويا يحمل علامة الفلورسنت المخفف في المخزن المؤقت المانع واحتضانه لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. يحفظ بعيدا عن الضوء.
    11. اغسل 3 × 5 دقائق باستخدام برنامج تلفزيوني. احتضان أغطية في 1-5 ميكروغرام من صبغة Hoechst لمدة 10 دقائق. استمر في الحماية من الضوء.
    12. اغسل أغطية الغطاء باستخدام PBS لمدة 5 دقائق. قم بتركيب الشرائح باستخدام 1: 1 1x PBS / glycerol. صورة بمجهر الفلورسنت.

8. الطعم الخيفي للخلايا السرطانية المبكرة لإثبات الورم

  1. تنمو خلايا المرور المبكر P 0-GGFβ3 MPNST في التقاء DMEM10 إلى 80٪. اشطف الخلايا مرة واحدة باستخدام محلول الملح المتوازن (HBSS) من هانكس بدرجة حرارة الغرفة. عالج الخلايا لمدة 30 ثانية إلى 1 دقيقة بمحلول تفكك الخلايا غير الأنزيمي لإزالتها من الركيزة. أضف 5 مل من DMEM10 لكل 1 مل من كاشف تفكك الخلايا غير الأنزيمية.
    ملاحظة: قد يستغرق التفكك الخلوي وقتا أطول بكثير ، حتى 10-20 دقيقة. يرجى الرجوع إلى بروتوكول الشركة المصنعة.
    ملاحظة: لا تنمو الخلايا إلى التقاء لأن هذا سيقلل من فعالية الكسب غير المشروع.
    1. عد الخلايا باستخدام مقياس الدم. قم بتدوير الخلايا لأسفل عند 5 × جم لمدة 5 دقائق وأعد تعليقها بتركيز 1-2 × 106 خلايا لكل 100 ميكرولتر من DMEM10. احتفظ بالخلايا على الثلج حتى تصبح جاهزة للحقن.
    2. تخدير الفئران NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl / SzJ) في غرفة الحث لمبخر الأيزوفلوران. ضع على بطنه وعقم موقع الحقن بنسبة 70٪ من الإيثانول. اترك الموقع يجف في الهواء قبل الحقن. قبل الحقن ، اسمح للخلايا بالوصول إلى درجة حرارة الغرفة.
    3. حقن 1-2 × 106 خلايا تحت الجلد في الجناح الأيمن. ضع الماوس بمفرده في قفص خال من الفراش واتركه يتعافى. تأكد من وجود جزء فقط من القفص على وسادة تدفئة لمنع انخفاض حرارة الجسم. يوفر هذا منطقة يمكن للماوس الانتقال إليها إذا ارتفعت درجة حرارته.
      ملاحظة: نقوم بتطعيم ما لا يقل عن ثلاثة فئران مع كل مزرعة مرور مبكر لأن بعض الطعوم قد لا تأخذها.
    4. السماح للكسب غير المشروع بالنمو لمدة 15-60 يوما ؛ تقييم صحة 3 مرات أسبوعيا وتسجيل درجات حالة الجسم ، بما في ذلك الوزن والتغيرات السلوكية في كل فحص. قم بإنهاء الفئران التي وصلت إلى الحد الأقصى المسموح به لحجم الكسب غير المشروع أو الفئران المحتضرة باستخدام القتل الرحيم لثاني أكسيد الكربون متبوعا بخلع عنق الرحم. سجل العمر عند الوفاة بالأيام. عندما تصبح الأورام مرئية خارجيا ، سجل أبعاد الورم (الطول والعرض والارتفاع).
      ملاحظة: في تجربتنا ، فإن ثقافات MPNST المختلفة للمرور المبكر تطعم بكفاءة متفاوتة وتختلف في الوقت اللازم لنمو الكسب غير المشروع. يجب عدم السماح للحيوانات بتجاوز الحد الأقصى المسموح به لحجم الورم و / أو نقطة النهاية الإنسانية المعتمدة من IACUC.
  2. حصاد الورم ، وإصلاحه في 4٪ بارافورمالدهيد ، وتضمينه في البارافين ، وإجراء بقع H& E كما هو موضح في الأقسام 2.1-2.2.9 للتحقق من أن الطعم الخيفي هو ورم وليس نسيجا تفاعليا. إذا لزم الأمر ، مناعة الكسب غير المشروع للعلامات التي كانت موجودة في الورم الأم.

النتائج

يوضح الشكل 2 أمثلة على الأورام الواضحة بشكل صارخ التي تنشأ في الفئران P 0-GGFβ3. يمكن رؤية الأورام التي يمكن التعرف عليها بسهولة بالعين المجردة على أنها كتل تنتشر في مناطق الجسم كما هو موضح في الشكل 2 أ (السهم). عند تحديد ما إذا كان الورم يحتمل أن يكون ورما ف...

Discussion

توفر الطرق النسيجية والكيميائية الحيوية المعروضة هنا إطارا لتشخيص وتوصيف نماذج GEM للورم العصبي الليفي والتسبب في MPNST. على مر السنين ، وجدنا أن هذه المنهجيات مفيدة جدا لتقييم أمراض أورام غمد الأعصاب المحيطية الناشئة في نماذج GEM21،25،26. ومع ذ...

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 و R01 NS109655 إلى S.L.C. ؛ R01 NS109655-03S1 إلى D.P.J.) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804 إلى S.L.C.) ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 و W81XWH-12-1-0164 إلى S.L.C.).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620 (2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834 (2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096 (2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al., Louis, D. N., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. , 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588 (2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved