A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

لقد طورنا منهجية لتقييم ما إذا كانت أورام الجهاز العصبي في الفئران المعدلة وراثيا تلخص بدقة أمراض نظرائهم من البشر. هنا ، نطبق هذه التقنيات النسيجية ، والمعايير المرضية المحددة ، ومنهجيات الثقافة على الأورام الليفية العصبية وأورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة الناشئة في نموذج الماوس P 0-GGFβ3.

Abstract

عادة ما يصاب المرضى الذين يعانون من متلازمة حساسية الورم الوراثي السائد من النوع 1 (NF1) بأورام ليفية عصبية ضفيرية الشكل (PNs) تتحول لاحقا إلى أورام غمد الأعصاب المحيطية الخبيثة شديدة العدوانية (MPNSTs). سيتم تسهيل فهم العملية التي يتحول بها PN إلى MPNST من خلال توفر نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) التي تكرر بدقة تقدم PN-MPNST الذي شوهد في البشر مع NF1. لسوء الحظ ، فإن نماذج GEM مع الاجتثاث Nf1 لا تلخص هذه العملية بالكامل. قادنا هذا إلى تطوير فئران P 0-GGFβ3 ، وهو نموذج GEM يؤدي فيه الإفراط في التعبير عن ميتوجين خلية شوان neuregulin-1 (NRG1) في خلايا Schwann إلى تطوير PNs التي تتطور لتصبح MPNSTs ذات تردد عال. ومع ذلك ، لتحديد ما إذا كان تكوين الورم وتطور الأورام في الفئران P 0-GGFβ3 نمذجة بدقة العمليات التي شوهدت في مرضى NF1 ، كان علينا أولا إثبات أن أمراض أورام غمد الأعصاب المحيطية P0-GGFβ3 تلخص أمراض نظرائهم من البشر.

هنا ، نصف المنهجيات المتخصصة المستخدمة لتشخيص أورام الجهاز العصبي المحيطي وتصنيفها بدقة في نماذج GEM ، باستخدام P 0-GGFβ3 و P0-GGFβ3 ؛ Trp53 +/- الفئران كمثال. نصف الطرق النسيجية والكيميائية المناعية والكيميائية النسيجية المستخدمة لتشخيص PNs و MPNSTs ، وكيفية التمييز بين هذه الأورام وأنواع الأورام الأخرى التي تحاكي أمراضها ، وكيفية تصنيف هذه الأورام. نناقش إنشاء ثقافات المرور المبكر من GEM MPNSTs ، وكيفية توصيف هذه الثقافات باستخدام الكيمياء الخلوية المناعية ، وكيفية التحقق من ورمها من خلال إنشاء الطعم الخيفي. بشكل جماعي ، تميز هذه التقنيات أمراض PNs و MPNSTs التي تنشأ في نماذج GEM وتقارن بشكل نقدي أمراض أورام الفئران هذه بنظيراتها البشرية.

Introduction

على مدى العقود الثلاثة الماضية ، حاولت العديد من المختبرات إنشاء نماذج فئران للسرطانات البشرية عن طريق إدخال طفرات مرتبطة بالسرطان البشري في جينوم الفئران أو عن طريق الإفراط في التعبير عن منتج جيني يتم التعبير عنه بشكل مفرط في السرطانات البشرية. يمكن استخدام نماذج الفئران المعدلة وراثيا (GEM) الناتجة لمجموعة متنوعة من الأغراض مثل إثبات أن التعديل الجينومي الذي تم إدخاله حديثا يبدأ تكوين الورم ، وتحديد التغيرات الجينية أو اللاجينية الأخرى التي تحدث لاحقا والتي تساهم في تطور الورم ، وتحديد مسارات الإشارات الرئيسية التي تدفع بدء الورم وتطوره. على عكس نماذج xenograft التقويمية ، التي تعتمد على استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة ، فإن نماذج السرطان GEM لديها نظام من....

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات الموضحة هنا من قبل IACUC التابع لجامعة ساوث كارولينا الطبية وتم تنفيذها من قبل موظفين مدربين بشكل صحيح وفقا لدليل المعاهد الوطنية للصحة لرعاية واستخدام المختبر والمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية في MUSC.

1. تحديد اختراق الورم والبقاء على قيد الحياة في الفئران P 0-GGFβ3 وتحديد الأورام في هذه لمزيد من التوصيف

  1. توليد مجموعة من الفئران التي سيتم تقييمها لتكوين الأورام. يعتمد عدد الفئران المطلوبة على اختراق النمط الظاهري للورم. للتعويض عن مثل هذه الخسائر ، ابدأ بمجموعة أعلى بنسبة 10-15٪ من العدد النهائي المطلوب للحيوانات.
    ملاحظة: حددنا اختراق الورم في الفئران P 0-GGFβ3 تجريبيا في....

النتائج

يوضح الشكل 2 أمثلة على الأورام الواضحة بشكل صارخ التي تنشأ في الفئران P 0-GGFβ3. يمكن رؤية الأورام التي يمكن التعرف عليها بسهولة بالعين المجردة على أنها كتل تنتشر في مناطق الجسم كما هو موضح في الشكل 2 أ (السهم). عند تحديد ما إذا كان الورم يحتمل أن يكون ورما ف.......

Discussion

توفر الطرق النسيجية والكيميائية الحيوية المعروضة هنا إطارا لتشخيص وتوصيف نماذج GEM للورم العصبي الليفي والتسبب في MPNST. على مر السنين ، وجدنا أن هذه المنهجيات مفيدة جدا لتقييم أمراض أورام غمد الأعصاب المحيطية الناشئة في نماذج GEM21،25،26. ومع ذ.......

Disclosures

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للكشف عنه.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني للأمراض العصبية والسكتة الدماغية (R01 NS048353 و R01 NS109655 إلى S.L.C. ؛ R01 NS109655-03S1 إلى D.P.J.) ، والمعهد الوطني للسرطان (R01 CA122804 إلى S.L.C.) ووزارة الدفاع (X81XWH-09-1-0086 و W81XWH-12-1-0164 إلى S.L.C.).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

References

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE 207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved