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Nous avons développé une méthodologie pour évaluer si les néoplasmes du système nerveux chez les souris génétiquement modifiées récapitulent avec précision la pathologie de leurs homologues humains. Ici, nous appliquons ces techniques histologiques, des critères pathologiques définis et des méthodologies de culture aux neurofibromes et aux tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique survenant dans le modèle murin P 0-GGFβ3.
Les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1) développent généralement des neurofibromes plexiformes (NP) qui se transforment ensuite en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) très agressives. La compréhension du processus par lequel une NP se transforme en MPNST serait facilitée par la disponibilité de modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui reproduisent avec précision la progression PN-MPNST observée chez les humains atteints de NF1. Malheureusement, les modèles GEM avec ablation Nf1 ne récapitulent pas complètement ce processus. Cela nous a amenés à développer des souris P 0-GGFβ3, un modèle GEM dans lequel la surexpression de la neuréguline mitogène des cellules de Schwann (NRG1) dans les cellules de Schwann entraîne le développement de PN qui progressent pour devenir des MPNST à haute fréquence. Cependant, pour déterminer si la tumorigenèse et la progression néoplasique chez les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus observés chez les patients NF1, nous avons d’abord dû prouver que la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique P0-GGFβ3 récapitule la pathologie de leurs homologues humains.
Ici, nous décrivons les méthodologies spécialisées utilisées pour diagnostiquer et classer avec précision les néoplasmes du système nerveux périphérique dans des modèles GEM, en utilisant P 0-GGFβ3 et P0-GGFβ3 ; Les souris Trp53+/- par exemple. Nous décrivons les méthodes histologiques, immunohistochimiques et histochimiques utilisées pour diagnostiquer les NP et les MPNST, comment distinguer ces néoplasmes des autres types de tumeurs qui imitent leur pathologie, et comment classer ces néoplasmes. Nous discutons de l’établissement de cultures à passage précoce à partir de MPNST GEM, de la caractérisation de ces cultures par immunocytochimie et de la vérification de leur tumorigénicité par l’établissement d’allogreffes. Collectivement, ces techniques caractérisent la pathologie des NP et des MPNST qui surviennent dans les modèles GEM et comparent de manière critique la pathologie de ces tumeurs murines à leurs homologues humains.
Au cours des trois dernières décennies, de nombreux laboratoires ont tenté de créer des modèles murins de cancers humains en introduisant des mutations associées au cancer humain dans le génome de la souris ou en surexprimant un produit génique surexprimé dans les cancers humains. Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui en résultent peuvent être utilisés à diverses fins, telles que l’établissement que la modification génomique nouvellement introduite initie la tumorigenèse, l’identification d’autres changements génétiques ou épigénétiques ultérieurs qui contribuent à la progression tumorale et la définition des voies de signalisation clés qui conduisen....
Les procédures décrites ici ont été approuvées par l’IACUC de l’Université médicale de Caroline du Sud et ont été effectuées par du personnel correctement formé conformément au Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux directives institutionnelles de MUSC en matière de soins aux animaux.
1. Détermination de la pénétrance tumorale et de la survie chez les souris P 0-GGFβ3 et identification des tumeurs chez ces animaux pour une caractérisation plus approfondie
La figure 2 illustre des exemples de néoplasmes très évidents survenant chez les souris P 0-GGFβ3. Les tumeurs facilement identifiables à l’œil nu peuvent être vues comme des masses distendant des régions du corps, comme le montre la figure 2A (flèche). Pour déterminer si le néoplasme est potentiellement une tumeur de la gaine nerveuse périphérique, il est essentiel d’établir que la tumeur est associée à un nerf périphérique. Dan.......
Les méthodes histologiques et biochimiques présentées ici fournissent un cadre pour diagnostiquer et caractériser les modèles GEM du neurofibrome et de la pathogenèse MPNST. Au fil des ans, nous avons constaté que ces méthodologies étaient très utiles pour évaluer la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique apparaissant dans les modèles GEM 21,25,26. Cependant, bien que les protocoles décrits ici s.......
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R01 NS048353 et R01 NS109655 à la SLC ; R01 NS109655-03S1 au DPJ), au National Cancer Institute (R01 CA122804 au S.L.C.) et au ministère de la Défense (X81XWH-09-1-0086 et W81XWH-12-1-0164 au S.L.C.).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
100 mm Tissue Culture Plates | Corning Falcon | 353003 | |
3, 3'- Diaminobensidine (DAB) | Vector Laboratories | SK-400 | |
6- well plates | Corning Costar | 3516 | |
Acetic Acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A11029 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse) | Invitrogen | A21043 or A11004 | |
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit) | Invitrogen | A11036 | |
Ammonium Chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23225 | |
Bovine Serum Albumin | Fisher Scientific | BP1600-100 | |
Caldesmon | ABCAM | E89, ab32330 | |
CD117 | Cell Marque | 117R-18-ASR | |
CD163 | Leica | NCL-L-CD163 | |
CD31 | ABCAM | ab29364 | |
CD34 | ABCAM | ab81289 | |
CD86 | ABCAM | ab53004 | |
Cell Scraper | Sarstedt | 83.183 | |
Cell Stripper | Corning | 25-056-CI | |
Circle Coverslip | Fisher Scientific | 12-545-100 | |
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent) | Decon Laboratories | 5989-27-5 | |
Critic Acid | Fisher Scientific | A104-500 | |
Cytokeratin | ABCAM | C-11, ab7753 | |
Desmin | Agilent Dako | clone D33 (M0760) | |
Diaminobensizdine (DAB) Solution | Vector Laboratories | SK-4100 | |
DMEM | Corning | 15-013-CV | |
Eosin Y | Thermo Scientific | 7111 | |
Ethanol (200 Proof) | Decon Laboratories | 2716 | |
Fetal Calf Serum | Omega Scientific | FB-01 | |
Forksolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | 21-022-CV | |
Harris Hematoxylin | Fisherbrand | 245-677 | |
Hemacytometer | Brightline-Hauser Scientific | 1490 | |
Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-212 | |
Hydrogen Peroxide | Fisher Scientific | 327-500 | |
Iba1 | Wako Chemicals | 019-19741 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse | Vector Laboratories | MP-2400 | |
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit | Vector Laboratories | MP-7401 | |
Incubator | Thermo Scientific | Heracell 240i CO2 incubator | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A415 | |
Ki-67 | Cell Signaling | 12202 | |
Laminin | Thermo Fisher Scientific | 23017015 | |
Liquid Nitrogen | |||
MART1 | ABCAM | M2-9E3, ab187369 | |
Microtome | |||
Nestin | Millipore | Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401) | |
Neuregulin 1 beta | In house | Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems) | |
Neurofibromin | Santa Cruz Biotechnology | sc-67 | |
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice | Jackson Laboratory | 5557 | |
Nonfat Dry Milk | Walmart | Great Value Brand | |
P0-GGFβ3 mice | In house | ||
Paraffin Wax | Leica | Paraplast 39601006 | |
Parafilm M | Sigma-Aldrich | PM-999 | |
Paraformaldehyde (4%) | Thermo Scientific | J19943-K2 | |
Permount (Xylene Mounting Medium) | Fisher Scientific | SP15-100 | |
pH Meter | Mettler Toldedo | Seven Excellence, 8603 | |
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's) | Corning | 20-031-CV | |
PMEL | ABCAM | EP4863(2), ab137078 | |
Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P5899-5MG | |
Portable Isoflurance Machine | VetEquip Inhalation Anesthesia Systems | ||
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium) | Millipore Sigma | 10981100ML | |
Rice Cooker | Beech Hamilton | ||
S100B | Agilent Dako | Z0311 (now GA504) | |
SMA | Ventana Medical Systems | clone 1A4 | |
Sodium Chloride | Fisher Scientific | S640 | |
Sodium Citrate (Dihydrate) | Fisher Scientific | BP327-1 | |
Sox10 | ABCAM | ab212843 | |
Steel histology mold | |||
Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
TCF4/TCFL2 | Cell Signaling | (CH48H11) #2569 | |
Tissue Cassette | |||
Toluidine Blue | ACROS Organics | 348600050 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
TRIzol | Invitrogen | 15596026 | |
Trypsin | Corning | 25-051-31 |
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