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Dans cet article

  • Résumé
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Résumé

Nous avons développé une méthodologie pour évaluer si les néoplasmes du système nerveux chez les souris génétiquement modifiées récapitulent avec précision la pathologie de leurs homologues humains. Ici, nous appliquons ces techniques histologiques, des critères pathologiques définis et des méthodologies de culture aux neurofibromes et aux tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique survenant dans le modèle murin P 0-GGFβ3.

Résumé

Les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1) développent généralement des neurofibromes plexiformes (NP) qui se transforment ensuite en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) très agressives. La compréhension du processus par lequel une NP se transforme en MPNST serait facilitée par la disponibilité de modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui reproduisent avec précision la progression PN-MPNST observée chez les humains atteints de NF1. Malheureusement, les modèles GEM avec ablation Nf1 ne récapitulent pas complètement ce processus. Cela nous a amenés à développer des souris P 0-GGFβ3, un modèle GEM dans lequel la surexpression de la neuréguline mitogène des cellules de Schwann (NRG1) dans les cellules de Schwann entraîne le développement de PN qui progressent pour devenir des MPNST à haute fréquence. Cependant, pour déterminer si la tumorigenèse et la progression néoplasique chez les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus observés chez les patients NF1, nous avons d’abord dû prouver que la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique P0-GGFβ3 récapitule la pathologie de leurs homologues humains.

Ici, nous décrivons les méthodologies spécialisées utilisées pour diagnostiquer et classer avec précision les néoplasmes du système nerveux périphérique dans des modèles GEM, en utilisant P 0-GGFβ3 et P0-GGFβ3 ; Les souris Trp53+/- par exemple. Nous décrivons les méthodes histologiques, immunohistochimiques et histochimiques utilisées pour diagnostiquer les NP et les MPNST, comment distinguer ces néoplasmes des autres types de tumeurs qui imitent leur pathologie, et comment classer ces néoplasmes. Nous discutons de l’établissement de cultures à passage précoce à partir de MPNST GEM, de la caractérisation de ces cultures par immunocytochimie et de la vérification de leur tumorigénicité par l’établissement d’allogreffes. Collectivement, ces techniques caractérisent la pathologie des NP et des MPNST qui surviennent dans les modèles GEM et comparent de manière critique la pathologie de ces tumeurs murines à leurs homologues humains.

Introduction

Au cours des trois dernières décennies, de nombreux laboratoires ont tenté de créer des modèles murins de cancers humains en introduisant des mutations associées au cancer humain dans le génome de la souris ou en surexprimant un produit génique surexprimé dans les cancers humains. Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui en résultent peuvent être utilisés à diverses fins, telles que l’établissement que la modification génomique nouvellement introduite initie la tumorigenèse, l’identification d’autres changements génétiques ou épigénétiques ultérieurs qui contribuent à la progression tumorale et la définition des voies de signalisation clés qui conduisent à l’initiation et à la progression de la tumeur. Contrairement aux modèles de xénogreffes orthotopiques, qui reposent sur l’utilisation de souris immunodéficientes, les modèles de cancer GEM ont un système immunitaire entièrement fonctionnel et modélisent donc plus précisément les réponses aux agents thérapeutiques candidats. Cependant, lorsqu’ils utilisent des modèles de cancer GEM à des fins comme celles-ci, il est essentiel que les chercheurs confirment que les observations faites avec les néoplasmes GEM sont pertinentes pour leurs homologues humains. Cette validation doit inclure une évaluation approfondie de la pathologie des tumeurs GEM et une détermination quant à savoir si les caractéristiques pathologiques des tumeurs GEM récapitulent la pathologie du type de tumeur humaine correspondant.

Le syndrome de susceptibilité tumorale neurofibromatose de type 1 (NF1) est la maladie génétique la plus courante affectant le système nerveux humain, survenant dans environ 1 naissance vivante sur 3 000 à 3 500 1,2,3. Les personnes atteintes de NF1 développent de multiples tumeurs bénignes de la gaine nerveuse périphérique appelées neurofibromes dans leur peau (neurofibromes dermiques) et dans les gros nerfs et plexus nerveux (neurofibromes plexiformes). Alors que les neurofibromes dermiques et plexiformes aggravent la qualité de vie du patient en produisant des troubles physiques, comportementaux et/ou sociaux, les neurofibromes plexiformes (NP) sont particulièrement dangereux 4,5. En effet, les NP se transforment fréquemment en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST), qui sont des néoplasmes agressifs à cellules fusiformes avec un taux de survie exceptionnellement faible 1,2. Ce faible taux de survie est dû en grande partie à l’inefficacité des schémas radiothérapeutiques et chimiothérapeutiques actuellement utilisés pour traiter les TPNM. Cependant, le développement de nouvelles thérapies plus efficaces a été difficile. En effet, malgré la fréquence des MPNST chez les patients atteints de NF1, il s’agit toujours de tumeurs rares. En conséquence, il est très difficile d’obtenir un grand nombre de tumeurs humaines pour l’étude ; il est également difficile de recruter suffisamment de patients atteints de MPNST pour les essais cliniques. Pour surmonter ces limites, plusieurs modèles GEM ont été générés dans le but d’obtenir des informations supplémentaires sur les anomalies à l’origine de la pathogenèse du neurofibrome et de la progression du PN-MPNST et de faciliter les essais précliniques avec des agents thérapeutiques candidats.

Les patients atteints de NF1 présentent des mutations inactivatrices dans une copie du gène NF1. La pathogenèse du neurofibrome est déclenchée lorsqu’une mutation inactivatrice du gène NF1 fonctionnel restant se produit dans une cellule de la lignée cellulaire de Schwann. Étonnamment, cependant, lorsque des souris ont été générées avec des mutations inactivatrices de la lignée germinale Nf1, elles n’ont pas développé de neurofibromes 6,7. La démonstration ultérieure que les souris avec des cellules de Schwann Nf1-null et une haploinsuffisance Nf1 dans tous les autres types de cellules (Krox20-Cre ;Nf1flox/- souris) ont développé des neurofibromes plexiformes suggérant qu’une dose réduite du gène Nf1 dans d’autres types de cellules était nécessaire pour la pathogenèse du neurofibrome8. Même dans ce cas, les neurofibromes plexiformes de Krox20-Cre ; Les souris Nf1flox/- n’ont pas progressé pour devenir des MPNST et n’ont donc que partiellement imité la biologie de leurs homologues humains. La pathogenèse des MPNST s’est produite lorsque les mutations de Nf1 étaient associées à des mutations dans d’autres gènes suppresseurs de tumeurs tels que Trp539 ou Cdkn2a10, mais les MPNST dans ces modèles GEM se sont développés de novo ou à partir de néoplasmes neurofibromateux atypiques à potentiel biologique incertain (ANNUBPs)11,12, plutôt que de neurofibromes plexiformes bénins préexistants (voir13,14 pour d’excellentes revues de ces modèles ainsi que d’autres modèles introduisant des mutations de perte de fonction supplémentaires associées à MPNST dans des gènes tels que Suz12 et Pten15).

Ces modèles murins ont été inestimables pour établir le rôle que jouent des gènes tels que NF1, TP53 et CDKN2A dans la pathogenèse des néoplasmes du système nerveux périphérique associés à la NF1 et pour les essais précliniques testant des agents thérapeutiques candidats. Cependant, nous avons encore une compréhension incomplète du processus par lequel les neurofibromes plexiformes évoluent pour devenir des néoplasmes neurofibromateux atypiques à potentiel biologique incertain (ANNUPP16) puis des MPNST. Des progrès ont récemment été réalisés dans la compréhension de ce processus avec le rapport récent selon lequel des souris présentant des délétions dans Nf1 et Arf développent des ANNUBP qui progressent pour devenir des MPNST11. Cependant, il n’existe pas encore de modèles murins basés sur la mutation Nf1 qui récapitulent entièrement le processus de progression du neurofibrome plexiforme-MPNST observé chez l’homme. De plus, il n’est pas clair s’il existe plusieurs voies distinctes qui mènent au développement des MPNST. Compte tenu de cela, il est possible que les GEM décrits ci-dessus ne modélisent qu’un sous-ensemble de plusieurs voies différentes qui conduisent à la progression du neurofibrome-MPNST et à la pathogenèse du MPNST. Ce point est souligné par le fait que les MPNST se produisent également sporadiquement et que certains MPNST sporadiques ne présentent apparemment pas de mutations NF1 17,18.

Bien que ce dernier point ait été remis en question par la récente suggestion de Magollon-Lorenz et al. selon laquelle au moins certains MPNST sporadiques dépourvus de mutations NF1 sont des mélanomes ou un type différent de sarcome19, nous avons récemment rapporté un MPNST sporadique et une lignée cellulaire dérivée de cette tumeur (cellules 2XSB) qui était de type sauvage NF1 20. Lors de la caractérisation de la tumeur mère et de la lignée cellulaire 2XSB, nous avons systématiquement exclu les possibilités de diagnostic alternatives, y compris le mélanome et les multiples autres types de sarcomes qui sont systématiquement pris en compte dans le diagnostic différentiel d’une tumeur maligne sporadique de la gaine nerveuse périphérique20. De plus, nous notons que Magollon-Lorenz et al. ont reconnu que leurs résultats dans les trois lignées cellulaires MPNST sporadiques qu’ils ont étudiées ne pouvaient pas être généralisés pour indiquer que toutes les tumeurs identifiées comme MPNST sporadiques ne sont pas des MPNST.

Pour construire un modèle GEM dans lequel le neurofibrome et la pathogenèse du MPNST ne dépendaient pas nécessairement de mutations spécifiques du gène suppresseur de tumeur, nous avons généré des souris transgéniques chez lesquelles la surexpression de la puissante neuréguline-1 mitogène à cellules de Schwann (NRG1) était entraînée par le promoteur de la protéine de myéline zéro (P0) spécifique à la cellule de Schwann (souris P 0-GGFβ3)21. Nous avons précédemment montré que les neurofibromes humains, les MPNST et les lignées cellulaires MPNST expriment plusieurs isoformes de NRG1 avec les tyrosines kinases du récepteur erbB (erbB2, erbB3 et erbB4) qui médient la signalisation NRG1 et que ces récepteurs erbB sont activés de manière constitutive22. Nous avons également démontré que les inhibiteurs pharmacologiques des kinases erbB inhibent puissamment la prolifération des MPNST22, la survie23 et la migration24. Conformément à nos observations chez l’homme, les souris P 0-GGFβ3 développent des neurofibromes plexiformes25 qui évoluent pour devenir des MPNST à une fréquence élevée21,25. Nous avons montré que les MPNST P 0-GGFβ3, comme leurs homologues humains, développent couramment des mutations de Trp53 et Cdkn2a, ainsi que de nombreuses autres anomalies génomiques qui contribuent potentiellement à la tumorigenèse25. Les MPNST apparaissant chez les souris P 0-GGFβ3 ne présentent pas de mutations inactivatrices de Nf1. Cependant, en utilisant la complémentation génétique, nous avons montré que NRG1 favorise la tumorigenèse chez les souris P 0-GGFβ3 principalement par les mêmes cascades de signalisation qui sont altérées par la perte de Nf1 26 ; cette conclusion est basée sur notre constat que la substitution de la surexpression de NRG1 à la perte de Nf1 en présence d’une haploinsuffisance Trp53 (P 0-GGFβ3 ;Trp53+/- souris) produit des animaux chez lesquels les MPNST se développent de novo, comme on le voit chez cis-Nf1+/- ; Trp53+/- souris 27.

Pour obtenir cette information et d’autres démontrant que les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus de pathogenèse du neurofibrome et de progression du neurofibrome-MPNST observés chez les humains atteints de NF1, nous avons développé des méthodologies spécialisées pour traiter les tissus de ces animaux, diagnostiquer avec précision leurs tumeurs, classer les MPNST apparaissant chez ces souris, établir et caractériser le passage précoce de P0-GGFβ3 et P0-GGFβ3 ; Trp53+/- MPNST et comparaison critique de la pathologie des PN et MPNST de P 0-GGFβ3 et de P0-GGFβ3 ; Trp53+/- MPNST à celui de leurs homologues humains. Beaucoup de ces méthodologies sont généralisables à d’autres modèles GEM de néoplasie du système nerveux. De plus, plusieurs de ces méthodologies sont plus largement applicables aux modèles GEM dans lesquels les néoplasmes apparaissent dans d’autres sites d’organes. Par conséquent, nous présentons ici une description détaillée de ces méthodologies.

Protocole

Les procédures décrites ici ont été approuvées par l’IACUC de l’Université médicale de Caroline du Sud et ont été effectuées par du personnel correctement formé conformément au Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux directives institutionnelles de MUSC en matière de soins aux animaux.

1. Détermination de la pénétrance tumorale et de la survie chez les souris P 0-GGFβ3 et identification des tumeurs chez ces animaux pour une caractérisation plus approfondie

  1. Générer la cohorte de souris qui sera évaluée pour la tumorigenèse. Le nombre de souris nécessaires dépend de la pénétrance du phénotype tumoral. Pour compenser de telles pertes, commencez par une cohorte supérieure de 10 à 15 % au nombre final d’animaux souhaité.
    REMARQUE : Nous avons déterminé empiriquement la pénétrance tumorale chez les souris P 0-GGFβ3 dans une cohorte initiale de 50 souris (dont six ont été perdues pour des raisons non liées à la néoplasie (par exemple, les bagarres))25.
  2. Évaluez la santé des animaux trois fois par semaine et notez les scores d’état corporel, y compris le poids et les changements de comportement à chaque examen. Éliminer les souris tumorales ou moribondes (voir note ci-dessous) en utilisant l’euthanasie au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale. Enregistrer l’âge au décès en jours. Si les tumeurs sont visibles de l’extérieur, notez les dimensions de la tumeur (longueur, largeur et hauteur).
    REMARQUE : Il est essentiel que les animaux ne soient pas autorisés à dépasser la taille maximale autorisée de la tumeur et/ou le critère d’évaluation humain approuvés par l’IACUC.
  3. À l’aide de l’âge au décès, établissez une courbe de survie de Kaplan-Meier pour déterminer l’âge moyen au décès et la fourchette de survie.
    REMARQUE : Les souris P 0-GGFβ3 avaient un âge moyen à la mort de 261,5 jours, avec une fourchette de 74 à 533 jours ; 91 % de notre cohorte avait des neurofibromes multiples et 71 % avaient des MPNST21.
  4. Déterminez si des tumeurs visiblement visibles sont présentes et, si elles le sont, disséquez-les dans des conditions stériles pour établir si la tumeur est associée à un nerf périphérique, puis excisez la tumeur. Dans P 0-GGFβ3 et P0-GGFβ3 ; Les tumeurs de la gaine nerveuse périphérique chez les souris Trp53+/- se trouvent le plus souvent dans les nerfs trijumeau et sciatique. Même si des tumeurs visiblement visibles ne sont pas observées en association avec ces nerfs, fixez et intégrez ces nerfs comme décrit ci-dessous afin qu’ils puissent être examinés pour la présence de micro-tumeurs. Les micro-tumeurs se produisent généralement dans les ganglions associés à ces nerfs.
  5. Coupez les tumeurs très visibles en trois morceaux (Figure 1A). Utilisez la pièce 1 pour l’histologie (coupes en paraffine, immunohistochimie et histochimie). Utilisez la pièce 2 pour établir des cultures de passage précoce. Congélation instantanée de la pièce 3 (à l’aide d’azote liquide) pour d’éventuelles expériences futures (par exemple, immunotransferts, isolement de l’ARN et de l’ADN).
  6. Fixer la pièce 1 dans du paraformaldéhyde à 4 % dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant la nuit à 4 °C. Fixer le reste du corps de l’animal par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit à 4 °C.

2. Enrobage de paraffine de tumeurs visiblement visibles et préparation de coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine pour l’évaluation diagnostique initiale

  1. Enrobage de paraffine de tumeurs visibles,
    1. Après avoir fixé le morceau tumoral 1 pendant la nuit dans du paraformaldéhyde à 4 %, rincez le tissu en le plaçant dans un volume de PBS au moins 10 fois supérieur au volume du tissu pendant 15 min ; Utilisez le même volume pour tous les rinçages suivants. Répétez deux autres rinçages PBS de 15 minutes, en utilisant un nouveau volume de PBS pour chaque rinçage.
    2. Transférer le morceau de tumeur 1 à 70% d’éthanol. Maintenez le tissu dans de l’éthanol à 70 % pendant 24 h à 4 °C. Si vous le souhaitez, conservez le tissu à long terme dans ces conditions.
      REMARQUE : Les étapes 2.1.1 à 2.1.7 sont fournies à l’intention des chercheurs qui n’ont pas accès à un appareil commercial de traitement des tissus. Si l’investigateur a accès à un processeur de tissus, les tissus seront traités à l’aide d’éthanols et de xylènes classés selon le protocole de l’instrument programmé.
    3. Transvasez le morceau de tumeur 1 à 80% d’éthanol pendant 30 min à température ambiante. Répétez l’incubation pendant 30 minutes supplémentaires dans un volume frais d’éthanol à 80 %.
    4. Transférez le morceau de tumeur 1 à 95% d’éthanol pendant 75 min à température ambiante. Répétez l’incubation deux fois de plus, à chaque fois pendant 75 minutes supplémentaires dans un volume frais d’éthanol à 95 %.
    5. Transférez le morceau de tumeur 1 à 100% d’éthanol et incubez pendant 60 min à température ambiante. Répétez l’incubation de 60 minutes deux fois de plus, en utilisant à chaque fois un nouveau volume d’éthanol à 100 %.
    6. Transférez le morceau de tumeur 1 dans un solvant à base de d-limonène et incubez pendant 30 à 60 minutes à température ambiante. Transférez le morceau de tumeur 1 dans un nouveau volume de solvant à base de d-limonène et incubez pendant 30 à 60 minutes supplémentaires à température ambiante.
    7. Transférer le morceau de tumeur 1 dans un solvant à base de paraffine/d-limonène 1:1 pendant 1 h à 60 °C. Jeter le solvant à base de paraffine/d-limonène 1:1 et transférer le morceau de tumeur 1 à 60 °C de paraffine et incuber pendant 20 min à 60 °C. Répéter l’incubation dans un nouveau volume de paraffine à 60 °C une fois de plus pendant 20 min. Incuber le morceau de tumeur 1 dans de la paraffine pendant la nuit à 60 °C.
    8. Versez une couche de base de paraffine dans un moule histologique en acier et laissez-la se solidifier. Transférez le morceau de tumeur 1 à la surface de la paraffine de base et immédiatement après le positionnement, couvrez le tissu avec de la paraffine à 60 °C et placez la cassette tissulaire au-dessus et en contact avec la paraffine fondue. Transférez le moule sur le côté froid de la station d’enrobage et laissez-le se solidifier pendant 10-15 min.
    9. Retirez le bloc de paraffine avec la cassette de tissu attachée du moule. Utilisez la cassette de tissu attachée pour serrer le bloc dans le microtome pendant la section.
      REMARQUE : Le bloc de paraffine peut maintenant être stocké indéfiniment à température ambiante.
  2. Préparez des coupes colorées à l’hématoxyline et à l’éosine des tumeurs visibles.
    1. Coupez des sections de tissu tumoral de 4 à 5 μm à l’aide d’un microtome et montez-les sur des lames de verre chargées positivement.
    2. Pour effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E), déparaffinez les coupes de tissu en incubant les lames dans un solvant à base de d-limonène pendant 10 min à température ambiante. Répétez l’incubation dans un nouveau volume de solvant à base de d-limonène pendant 10 min.
    3. Transférez les lames dans de l’éthanol à 100 % et laissez incuber pendant 5 min à température ambiante. Transférez les lames dans un volume frais d’éthanol à 100 % et incubez encore 5 minutes à température ambiante.
    4. Transférez les lames à 95% d’éthanol et incubez pendant 5 min à température ambiante. Transférez les lames dans un volume frais d’éthanol à 95 % et incubez encore 5 minutes à température ambiante.
    5. Transférer les lames à 70% d’éthanol et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, transférez dans de l’éthanol à 50% et incubez pendant 5 min à température ambiante.
    6. Transférez les lames dans de l’eau distillée et incubez pendant 5 min à température ambiante.
    7. Teintez les lames en les plongeant dans de l’hématoxyline pendant 5 min à température ambiante. Rincer à l’eau courante du robinet pendant 1 à 2 min. Différencier en trempant les lames 2 à 5 fois dans de l’acide chlorhydrique à 0,5 % dans de l’éthanol à 70 %. Rincer au bain-marie pendant 1 à 2 min. Placer les lames dans de l’éthanol à 95 % avec de l’acide acétique à 0,5 % pendant 10 s.
    8. Colorer les lames avec de l’éosine-Y pendant 30 s à température ambiante, puis transférer les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 5 min. Nettoyer les échantillons dans un solvant à base de d-limonène pendant 5 min.
    9. Montez les lamelles à l’aide d’un support de montage à base de xylène pendant que la lame est encore humide avec le solvant à base de d-limonène. Laissez le support de montage prendre pendant la nuit.
      REMARQUE : N’utilisez pas de support de montage à base d’eau.
  3. Préparez des tissus sans tumeurs visibles, pour identifier les neurofibromes plexiformes et les micro-MPNST. Incorporez les tissus dans de la paraffine, préparez des coupes histologiques et colorez ces coupes avec de l’hématoxyline et de l’éosine.
    1. Retirez les organes internes et intégrez des parties représentatives de chaque organe dans de la paraffine pour préparer des coupes colorées à l’H&E qui seront examinées pour détecter des signes microscopiques de tumeurs (Figure 1B). Retirez la tête, les membres antérieurs, les membres postérieurs et la queue (Figure 1C). Examiner la moelle épinière et les racines nerveuses in situ à la recherche de signes de tumeurs des racines nerveuses, décalcifier la colonne vertébrale et les côtes et tissus mous associés par immersion dans 0,3 M d’EDTA/4 % de paraformaldéhye (pH 8,0) pendant 48 à 72 h à 4 °C ; ensuite, rincez les échantillons avec 1x PBS. À la fin de la décalcification, assurez-vous que la décalcification est complète en essayant de percer la colonne vertébrale avec une aiguille. La décalcification est réussie si l’aiguille pénètre facilement dans l’os sans craquer.
    2. Coupez la colonne vertébrale décalcifiée et les structures associées en blocs qui s’adapteront à une cassette de tissus. Déshydrater à l’aide d’éthanols gradués suivis d’un solvant à base de d-limonène comme décrit aux étapes 2.1.2 à 2.1.7. Incorporer dans la paraffine et préparer des sections de 4 à 5 μm comme décrit aux étapes 2.1.7-2.2.1. Effectuer les colorations H&E comme décrit aux étapes 2.2.2-2.2.9 ; Laissez le support de montage prendre pendant la nuit.

3. Identifier les neurofibromes plexiformes potentiels et effectuer des colorations spéciales pour confirmer les diagnostics

REMARQUE : Nous recommandons fortement d’inclure un pathologiste humain ou vétérinaire expérimenté dans l’évaluation de l’H&E et des colorations spéciales des coupes tumorales GEM.

  1. Examinez les lames colorées à l’H&E préparées comme décrit ci-dessus à l’aide de la microscopie à fond clair pour identifier les tumeurs potentielles de la gaine nerveuse périphérique. Étant donné que les neurofibromes et les MPNST surviennent dans les nerfs périphériques, il est important de déterminer si les tumeurs microscopiques sont associées à un nerf périphérique. Identifier les blocs présentant des tumeurs potentielles de la gaine nerveuse périphérique afin que des immunocolorations et d’autres colorations spéciales puissent être effectuées pour confirmer ou infirmer les diagnostics.
  2. Distinguer les PN potentiels des MPNST/autres néoplasmes de haut grade en fonction des caractéristiques histologiques observées lors de l’examen en fond clair des coupes colorées par H&E. Les NP humains sont des néoplasmes légèrement hypercellulaires principalement composés de cellules avec des noyaux allongés et souvent ondulés. Dans de nombreuses régions, les cellules sont peu serrées et peuvent être séparées par du matériel extracellulaire myxoïde ; Les PN chez les souris P 0-GGFβ3 ont une apparence similaire. Les mitoses ne sont généralement pas présentes ; si elles le sont et que la tumeur est modérément à fortement hypercellulaire, la tumeur est un MPNST ou un autre type de néoplasme de haut grade (voir ci-dessous).
  3. Les NP sont composés d’un mélange de cellules de Schwann néoplasiques et d’autres types de cellules non néoplasiques telles que les mastocytes. Pour confirmer l’identité d’un NP, effectuer des immunocolorations pour les marqueurs de cellules de Schwann S100β et Sox10 et le marqueur de mastocytes CD117 (c-Kit) sur des sections de blocs contenant des NP potentiels identifiés lors de l’examen H&E (voir rubrique 3.4 pour d’autres options de coloration des marqueurs de mastocytes). Effectuer des immunocolorations Ki67 pour confirmer les faibles taux de prolifération.
    REMARQUE : Le tableau 1 énumère les marqueurs antigéniques utilisés pour l’identification systématique des neurofibromes plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), le diagnostic des MPNST et pour une évaluation complète des autres types de cellules présentes dans les neurofibromes ; nous ne colorons ces derniers antigènes que lorsque nous décrivons pour la première fois un nouveau modèle GEM. Consultez la fiche technique du fabricant de l’anticorps pour connaître les conditions recommandées. Notez si la notice du fabricant de l’anticorps recommande la récupération de l’antigène ; Tous les antigènes ne nécessitent pas de prélèvement pour être détectables.
    1. Préparez des sections de 4 à 5 μm à partir des blocs de paraffine sélectionnés et montez-les sur des lames chargées positivement. Déparaffiniser les sections comme décrit aux étapes 2.2.2 à 2.2.6.
    2. Rincer les sections avec 1x PBS pendant 3 à 5 min.
    3. Si le fabricant d’anticorps recommande la récupération de l’antigène, préparez un tampon de citrate. Mélanger 9 mL de solution d’acide citrique (10,5 g d’acide citrique dans 500 mL d’eau distillée) et 41 mL de solution de citrate de sodium (14,7 g de citrate de sodium dans 500 mL d’eau distillée).
    4. Effectuer le prélèvement d’antigènes en plaçant les lames dans un tampon de citrate pendant 20 minutes dans un cuiseur à riz chauffé.
    5. Transférer les lames dans du peroxyde d’hydrogène à 3 % / 1x PBS pendant 10 min pour éliminer l’activité de la peroxydase dans les tissus.
      REMARQUE : Préparez cette solution fraîche à chaque fois et n’utilisez pas la solution mère de peroxyde d’hydrogène si elle date de plus de 3-4 mois.
    6. Rincer les sections en 1x PBS.
    7. Bloquer les sections à l’aide d’un tampon de blocage (2% BSA, 0,1% Triton X-100 en 1x PBS) pendant 1 h. Rincez brièvement les lames en 1x PBS.
    8. Ajouter l’anticorps primaire aux coupes de tissus. Préparez les anticorps primaires dans un tampon de blocage dilué. Incuber les lames pendant 2 h à 37 °C ou toute la nuit à 4 °C.
    9. Lavez les lames en 1x PBS pendant 5 min. Répétez 3x.
    10. Incuber les tissus avec des anticorps secondaires biotinylés pendant 1 à 2 h.
    11. Préparez une solution de diaminobenzidine (DAB) selon le protocole du fabricant et plongez les lames dans la solution pendant 2 à 10 minutes. Laver les lames à l’eau pendant 5 min.
    12. Contre-colorez les sections en les immergeant dans de l’hématoxyline pendant 10-15 min. Exposer à l’eau courante jusqu’à ce qu’elle soit claire. Trempez rapidement les lames dans de l’alcool et rincez les lames dans l’eau.
    13. Déshydrater les lames dans les éthanols classés en les trempant rapidement, 4 à 5 fois par solution, dans de l’éthanol à 70 %, à 95 % d’éthanol, puis à 100 % d’éthanol. Incuber les lames dans un solvant à base de d-limonène pendant 2 min. Incuber les lames dans un deuxième lot de solvant à base de d-limonène pendant 2 min.
    14. Montez les diapositives avec un support de montage à base de xylène.
    15. Examinez les lames par microscopie à fond clair.
    16. Pour l’immunofluorescence, omettre les étapes 3.3.10 à 3.3.15. Au lieu de cela, incubez des tissus avec des anticorps secondaires spécifiques à l’espèce dilués dans un tampon bloquant pendant 1 à 2 heures.
    17. Rincer les lames en 1x PBS pendant 5 min. Répéter 3x.
    18. Montez les lames en utilisant 1x PBS/glycérol.
    19. Examiner les lames à l’aide de la microscopie à fluorescence.
  4. Méthode alternative pour colorer les mastocytes : coloration au bleu de toluidine
    1. Préparer une solution mère de bleu de toluidine en dissolvant 1 g de bleu de toluidine O dans 100 mL d’éthanol à 70 %.
    2. Préparer une solution de chlorure de sodium (NaCl) à 1 % en dissolvant 0,5 g de NaCl dans 50 mL d’eau distillée. Mélanger pour dissoudre. Ajustez le pH à environ 2,0-2,5 en utilisant HCl.
      REMARQUE : Cette solution de NaCl doit être rafraîchie chaque fois que des taches sont effectuées.
    3. Préparer la solution de travail du bleu de toluidine en ajoutant 5 mL de solution mère de bleu de toluidine à 45 mL de solution de NaCl à 1 %. Bien mélanger et s’assurer que le pH est d’environ 2,3.
      REMARQUE : Un pH supérieur à 2,5 entraînera une coloration avec moins de métachromasie. Faites en sorte que cette solution soit fraîche à chaque fois qu’une coloration est effectuée.
    4. Déparaffiniser des sections de 4 à 5 μm montées sur des lames chargées positivement comme décrit aux étapes 2.2.2-2.2.6. Laver les sections déparaffinées à l’eau courante pendant 2 min.
    5. Tremper les sections dans une solution de travail au bleu de toluidine pendant 2-3 min. Laver à l’eau distillée pendant 2 min.
    6. Déshydratez les sections en trempant 10x dans de l’éthanol à 95%. Glisses de trempage dans 100% éthanol 10x. Tremper les diapositives dans de l’éthanol frais à 100 % 10 fois de plus.
    7. Incuber les lames dans un solvant à base de d-limonène pendant 2 min. Incuber les lames dans un deuxième lot de solvant à base de d-limonène pendant 2 min.
    8. Montez les lamelles à l’aide d’un milieu de montage à base de xylène pendant que la lame est encore humide avec un solvant à base de d-limonène.
      REMARQUE : N’utilisez pas de support de montage à base d’eau.
    9. Examinez les lames par microscopie à fond clair. Identifier les mastocytes par la présence de granules violet foncé dans leur cytoplasme. Les autres types de cellules sont colorés en bleu clair.

4. Colorations spéciales pour diagnostiquer les MPNST et exclure les diagnostics alternatifs

  1. L’aspect histologique des MPNST humains est très variable et plusieurs types de tumeurs différents ont une apparence similaire à celle des MPNST28. Étant donné que les MPNST sont dérivés de la lignée cellulaire de Schwann, déterminez si la tumeur provient d’un nerf périphérique ou d’une NP bénigne existante par un examen macroscopique ou un examen microscopique en fond clair de coupes colorées par H&E. Bien que les MPNST ne soient parfois pas associés à un nerf périphérique ou à une NP (généralement en raison d’une séparation accidentelle du nerf pendant la dissection, de la destruction de la NP préexistante par une prolifération de MPNST ou parce que la lésion est métastatique), recherchez l’association de la tumeur avec un nerf ou une NP car le diagnostic est moins probable si la tumeur n’est pas associée à un nerf ou à une NP.
  2. Préparez des coupes de 4 à 5 μm à partir de blocs de paraffine contenant des MPNST potentiels et montez-les sur des lames chargées positivement comme décrit à l’étape 2.2.1. Déparaffiniser les sections comme décrit aux étapes 2.2.2 à 2.2.6.
  3. Effectuer l’immunohistochimie avec le panel d’anticorps indiqué dans le tableau 2 comme décrit aux étapes 3.3.1 à 3.3.15.
  4. Examiner les immunocolorations par microscopie à fond clair. Étant donné que les MPNST démontrent une différenciation schwannienne, recherchez une immunoréactivité uniforme ou inégale pour S100β, nestine et Sox10. Si les tumeurs ne sont pas positives pour ces trois marqueurs, reportez-vous au tableau 2 pour établir le diagnostic.
    REMARQUE : Les MPNST humains et murins peuvent présenter une différenciation divergente. Par exemple, certains MPNST humains présentent une différenciation rhabdomyoblastique focale (ces variantes sont connues sous le nom de tumeurs malignes de Triton) ; bien que ces néoplasmes colorent les marqueurs de Schwanni, ils expriment également des marqueurs musculaires tels que la desmine, MyoD1 et la myogénine. L’immunoréactivité de ces derniers marqueurs ne devrait pas dissuader les chercheurs de diagnostiquer la tumeur comme un MPNST. Bien que plusieurs modèles murins exprimant conditionnellement le gène de fusion SS18-SSX aient été établis pour modéliser la pathogenèse du sarcome synovial29, à notre connaissance, les modèles de sarcome synovial qui génèrent spontanément le transcrit de fusion équivalent ne sont pas connus. Par conséquent, nous ne recherchons pas les transcrits de fusion SS18-SSX dans les tumeurs GEM et nous nous appuyons plutôt sur des profils immunohistochimiques.

5. Classement des MPNST

  1. Déterminer si une nécrose tumorale, une caractéristique des MPNST de grade IV de l’OMS, est présente. Pour les MPNST de grade IV, recherchez une hypercellularité importante, une activité mitotique rapide (≥4 mitoses pour 10 champs de haute puissance (40x)) et une atypie cytologique.
    1. En l’absence de nécrose, évaluez la tumeur pour déterminer si une hypercellularité, une activité mitotique rapide et une atypie cytologique sont présentes. Si ces caractéristiques sont toutes présentes en l’absence de nécrose, classer la tumeur comme un MPNST de grade III de l’OMS.
    2. Les tumeurs de grade II de l’OMS sont caractérisées par une cellularité accrue, mais à un degré moindre que les MPNST de grade III et IV de l’OMS. Les noyaux des cellules tumorales d’un MPNST de grade II de l’OMS présentent une augmentation de la taille (plus de 3 fois la taille des noyaux des cellules tumorales dans les neurofibromes) et une hyperchromasie. L’augmentation de l’activité mitotique (<4 mitoses pour 10 champs de haute puissance) est associée aux tumeurs de grade II de l’OMS, mais n’est pas obligatoire.
      REMARQUE : Étant donné que les tumeurs de haut grade progressent généralement à partir de bas grades, des régions de bas grade et de haut grade peuvent être présentes dans le même MPNST. Dans ce cas, le grade de la tumeur est déterminé par la région de grade le plus élevé présente.
      REMARQUE : Il existe une controverse parmi les pathologistes humains quant à savoir si le système de classification de l’OMS décrit ci-dessus est prédictif des résultats des patients et certains de ces pathologistes préfèrent plutôt simplement classer les MPNST comme étant de bas grade ou de haut grade. Dans ce schéma, les MPNST de haut grade présentent une atypie cytologique importante, une activité mitotique rapide (>5 mitoses pour 10 champs de haute puissance) et une hypercellularité marquée avec ou sans nécrose. Les MPNST de bas grade ne sont pas nécrosées mais présentent une activité mitotique, une atypie cytologique et une cellularité intermédiaires entre un MPNST de haut grade et un néoplasme neurofibromateux atypique au potentiel biologique inconnu (ANNUBP). Nous préférons le système décrit ci-dessus car il peut être difficile de faire la distinction entre un ANNUBP et un MPNST de faible qualité pour les chercheurs qui n’ont pas une longue expérience de ces entités.

6. Préparation de cultures decellules MPNST P 0-GGFβ3 à passage précoce

  1. Cultiver des cellules tumorales P 0-GGFβ3 à passage précoce à partir d’un morceau de tumeur frais 2 (étape 1.5, Figure 1A). Maintenez des conditions stériles à partir de ce moment.
    1. Dissociez la tumeur en la coupant en petits morceaux (2-4 mm) et en la hachant dans du DMEM10 (milieu essentiel minimal de Dulbecco) contenant 10 % de sérum de veau fœtal, 2 μmol/L de forskoline et 10 nmol/L de neuréguline 1β (NRG1β) dans des boîtes de culture tissulaire de 100 mm.
    2. Laisser les cellules se développer à partir des fragments de tissu haché à 37 °C dans 5 % de CO2 jusqu’à ce que les plaques soient confluentes. Changez de support tous les 3-4 jours.
    3. Divisez la culture cellulaire. Retirer le milieu des cellules de vaisselle et laver les cellules de 100 mm avec du PBS ; Retirer et jeter le tissu haché. Retirer le PBS et ajouter 1 mL de trypsine à 0,25 % pendant 2 à 5 minutes à température ambiante. Pour favoriser le détachement des cellules, tapotez doucement la plaque et vérifiez le détachement à l’aide d’un microscope optique ; prolonger l’incubation de la trypsine au besoin.
    4. Neutraliser la trypsine en ajoutant 2 mL de DMEM10. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger et des cellules à granulés à 500 × g pendant 5 min. Retirer le support et ajouter 5 ml de DMEM10 frais à la pastille.
    5. Répartissez la suspension cellulaire dans deux à quatre boîtes de 100 mm contenant du DMEM10. Ne divisez pas les cellules pendant plus de cinq passages (étapes 6.1.3 et 6.1.4) et maintenez-les dans DMEM sans forskoline ni NRG1β. N’oubliez pas de congeler les cellules au passage 2 pour une utilisation future.

7. Vérification de l’identité des cellules MPNST à passage précoce par immunocytochimie

  1. Placer des lamelles rondes stériles en verre #1,5 de 18 mm dans les puits des boîtes de culture tissulaire stériles à 6 puits.
    1. Placer la solution de poly-L-lysine/laminine dans les puits dans un volume suffisant pour couvrir la lamelle. Scellez la plaque avec une pellicule plastique pour minimiser l’évaporation. Incuber à 4 °C pendant la nuit. Le lendemain matin, lavez les lamelles 3x avec du PBS stérile.
      REMARQUE : Nous avons tenté de plaquer des cellules MPNST à passage précoce sur des lamelles non revêtues et avons constaté que les cellules n’adhèrent pas bien en l’absence d’enrobage de poly-L-lysine/laminine.
    2. Déposer 10 000 cellules sur la lamelle en ajoutant délicatement 2 mL de suspension cellulaire dans un milieu de croissance dans chaque puits contenant la lamelle. Incuber les plaques pendant la nuit à 37 °C avec 5% de CO2 dans un incubateur de culture tissulaire.
    3. Le lendemain matin, rincez les lamelles pendant 2 x 5 min avec du PBS.
    4. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 18 min à température ambiante.
    5. Rincer les lamelles 3 x 5 min avec du PBS. Si vous le souhaitez, scellez la plaque avec un film plastique et conservez-la à 4 °C à ce stade.
    6. Faire 50 mM de NH4Cl frais dans du PBS. Tremper les aldéhydes en incubant des lamelles dans 50 mM de NH4Cl dans du PBS pendant 10 min à température ambiante.
    7. Perméabiliser les cellules en incubant des lamelles dans du Triton X-100 à 0,3 % dans du PBS pendant 15 min à température ambiante. Laver les lamelles pendant 3 x 5 min avec PBS.
    8. Bloquer la liaison non spécifique en incubant des lamelles dans un tampon bloquant (1x PBS contenant 1 % d’albumine sérique bovine, 0,2 % de lait écrémé en poudre et 0,3 % de Triton X-100) pendant 1 h à température ambiante.
    9. Retirez le tampon bloquant et ajoutez des anticorps primaires reconnaissant les marqueurs MPNST présents dans la tumeur mère (généralement S100β, Nestin et Sox10) dilués à la dilution optimale prédéterminée dans le tampon bloquant. Enveloppez la plaque d’un film plastique et laissez incuber à 4 °C pendant une nuit dans une chambre humidifiée.
    10. Laver 3 x 5 min avec du PBS pour éliminer l’anticorps primaire non lié. Ajouter l’anticorps secondaire marqué par fluorescence dilué dans un tampon bloquant et incuber pendant 1 h à température ambiante. Protéger de la lumière.
    11. Laver 3 x 5 min avec PBS. Incuber les lamelles dans 1 à 5 μg de colorant Hoechst pendant 10 min. Continuer à protéger de la lumière.
    12. Lavez les lamelles avec du PBS pendant 5 min. Montez les lames en utilisant 1:1 1x PBS/glycérol. Image avec un microscope fluorescent.

8. Allogreffe de cellules tumorales à passage précoce pour démontrer la tumorigénicité

  1. Cultiver des cellules MPNST P 0-GGFβ3 à passage précoce dans la confluence DMEM10 à 80 %. Rincez les cellules une fois avec la solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) à température ambiante. Traiter les cellules pendant 30 s à 1 min avec une solution de dissociation cellulaire non enzymatique pour les éliminer du substrat. Ajouter 5 mL de DMEM10 pour 1 mL d’un réactif de dissociation cellulaire non enzymatique.
    REMARQUE : La dissociation cellulaire peut prendre beaucoup plus de temps, jusqu’à 10 à 20 minutes. Veuillez vous référer au protocole du fabricant.
    REMARQUE : Ne pas faire pousser les cellules jusqu’à la confluence car cela réduirait l’efficacité de la greffe.
    1. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Faire tourner les cellules à 5 × g pendant 5 minutes et les remettre en suspension à une concentration de 1-2 × 106 cellules par 100 μL de DMEM10. Conservez les cellules sur de la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à être injectées.
    2. Anesthésier des souris NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) dans la chambre d’induction d’un vaporisateur d’isoflurane. Placez l’animal sur le ventre et stérilisez le site d’injection avec de l’éthanol à 70 %. Laissez le site sécher à l’air libre avant l’injection. Avant l’injection, laissez les cellules revenir à température ambiante.
    3. Injecter 1-2 x 106 cellules par voie sous-cutanée dans le flanc droit. Placez la souris seule dans une cage sans litière et laissez-la récupérer. Assurez-vous que seule une partie de la cage est sur un coussin chauffant pour éviter l’hypothermie. Cela fournit une zone vers laquelle la souris peut se déplacer si elle surchauffe.
      REMARQUE : Nous greffons un minimum de trois souris avec chaque culture à passage précoce, car certaines greffes peuvent ne pas prendre.
    4. Laissez le greffon pousser pendant 15 à 60 jours ; Évaluer la santé des animaux 3 fois par semaine et noter les scores d’état corporel, y compris le poids et les changements de comportement à chaque examen. Éliminez les souris qui ont atteint la taille maximale autorisée du greffon ou les souris moribondes en utilisant l’euthanasie au dioxyde de carbone suivie d’une luxation cervicale. Enregistrer l’âge au décès en jours. Lorsque les tumeurs deviennent visibles de l’extérieur, notez les dimensions de la tumeur (longueur, largeur et hauteur).
      REMARQUE : D’après notre expérience, différentes cultures MPNST à passage précoce greffent avec une efficacité variable et diffèrent par le temps nécessaire à la croissance du greffon. Les animaux ne doivent pas être autorisés à dépasser la taille maximale autorisée de la tumeur et/ou le critère d’évaluation humain approuvés par l’IACUC.
  2. Récoltez la tumeur, fixez-la dans du paraformaldéhyde à 4 %, intégrez-la dans de la paraffine et effectuez des colorations H&E comme décrit dans les sections 2.1-2.2.9 pour vérifier que l’allogreffe est une tumeur plutôt qu’un tissu réactif. Si nécessaire, immunocolorez le greffon pour les marqueurs présents dans la tumeur mère.

Résultats

La figure 2 illustre des exemples de néoplasmes très évidents survenant chez les souris P 0-GGFβ3. Les tumeurs facilement identifiables à l’œil nu peuvent être vues comme des masses distendant des régions du corps, comme le montre la figure 2A (flèche). Pour déterminer si le néoplasme est potentiellement une tumeur de la gaine nerveuse périphérique, il est essentiel d’établir que la tumeur est associée à un nerf périphérique. Dan...

Discussion

Les méthodes histologiques et biochimiques présentées ici fournissent un cadre pour diagnostiquer et caractériser les modèles GEM du neurofibrome et de la pathogenèse MPNST. Au fil des ans, nous avons constaté que ces méthodologies étaient très utiles pour évaluer la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique apparaissant dans les modèles GEM 21,25,26. Cependant, bien que les protocoles décrits ici s...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R01 NS048353 et R01 NS109655 à la SLC ; R01 NS109655-03S1 au DPJ), au National Cancer Institute (R01 CA122804 au S.L.C.) et au ministère de la Défense (X81XWH-09-1-0086 et W81XWH-12-1-0164 au S.L.C.).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

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