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Dans cet article

  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats Représentatifs
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Nous avons développé une méthodologie pour évaluer si les néoplasmes du système nerveux chez les souris génétiquement modifiées récapitulent avec précision la pathologie de leurs homologues humains. Ici, nous appliquons ces techniques histologiques, des critères pathologiques définis et des méthodologies de culture aux neurofibromes et aux tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique survenant dans le modèle murin P 0-GGFβ3.

Résumé

Les patients atteints du syndrome de susceptibilité tumorale autosomique dominante neurofibromatose de type 1 (NF1) développent généralement des neurofibromes plexiformes (NP) qui se transforment ensuite en tumeurs malignes de la gaine nerveuse périphérique (MPNST) très agressives. La compréhension du processus par lequel une NP se transforme en MPNST serait facilitée par la disponibilité de modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui reproduisent avec précision la progression PN-MPNST observée chez les humains atteints de NF1. Malheureusement, les modèles GEM avec ablation Nf1 ne récapitulent pas complètement ce processus. Cela nous a amenés à développer des souris P 0-GGFβ3, un modèle GEM dans lequel la surexpression de la neuréguline mitogène des cellules de Schwann (NRG1) dans les cellules de Schwann entraîne le développement de PN qui progressent pour devenir des MPNST à haute fréquence. Cependant, pour déterminer si la tumorigenèse et la progression néoplasique chez les souris P 0-GGFβ3 modélisent avec précision les processus observés chez les patients NF1, nous avons d’abord dû prouver que la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique P0-GGFβ3 récapitule la pathologie de leurs homologues humains.

Ici, nous décrivons les méthodologies spécialisées utilisées pour diagnostiquer et classer avec précision les néoplasmes du système nerveux périphérique dans des modèles GEM, en utilisant P 0-GGFβ3 et P0-GGFβ3 ; Les souris Trp53+/- par exemple. Nous décrivons les méthodes histologiques, immunohistochimiques et histochimiques utilisées pour diagnostiquer les NP et les MPNST, comment distinguer ces néoplasmes des autres types de tumeurs qui imitent leur pathologie, et comment classer ces néoplasmes. Nous discutons de l’établissement de cultures à passage précoce à partir de MPNST GEM, de la caractérisation de ces cultures par immunocytochimie et de la vérification de leur tumorigénicité par l’établissement d’allogreffes. Collectivement, ces techniques caractérisent la pathologie des NP et des MPNST qui surviennent dans les modèles GEM et comparent de manière critique la pathologie de ces tumeurs murines à leurs homologues humains.

Introduction

Au cours des trois dernières décennies, de nombreux laboratoires ont tenté de créer des modèles murins de cancers humains en introduisant des mutations associées au cancer humain dans le génome de la souris ou en surexprimant un produit génique surexprimé dans les cancers humains. Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) qui en résultent peuvent être utilisés à diverses fins, telles que l’établissement que la modification génomique nouvellement introduite initie la tumorigenèse, l’identification d’autres changements génétiques ou épigénétiques ultérieurs qui contribuent à la progression tumorale et la définition des voies de signalisation clés qui conduisen....

Protocole

Les procédures décrites ici ont été approuvées par l’IACUC de l’Université médicale de Caroline du Sud et ont été effectuées par du personnel correctement formé conformément au Guide des NIH pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire et aux directives institutionnelles de MUSC en matière de soins aux animaux.

1. Détermination de la pénétrance tumorale et de la survie chez les souris P 0-GGFβ3 et identification des tumeurs chez ces animaux pour une caractérisation plus approfondie

  1. Générer la cohorte de souris qui sera évaluée pour la tumorigenèse. Le nombre de souris nécessaires dépend de....

Résultats Représentatifs

La figure 2 illustre des exemples de néoplasmes très évidents survenant chez les souris P 0-GGFβ3. Les tumeurs facilement identifiables à l’œil nu peuvent être vues comme des masses distendant des régions du corps, comme le montre la figure 2A (flèche). Pour déterminer si le néoplasme est potentiellement une tumeur de la gaine nerveuse périphérique, il est essentiel d’établir que la tumeur est associée à un nerf périphérique. Dan.......

Discussion

Les méthodes histologiques et biochimiques présentées ici fournissent un cadre pour diagnostiquer et caractériser les modèles GEM du neurofibrome et de la pathogenèse MPNST. Au fil des ans, nous avons constaté que ces méthodologies étaient très utiles pour évaluer la pathologie des tumeurs de la gaine nerveuse périphérique apparaissant dans les modèles GEM 21,25,26. Cependant, bien que les protocoles décrits ici s.......

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national des maladies neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux (R01 NS048353 et R01 NS109655 à la SLC ; R01 NS109655-03S1 au DPJ), au National Cancer Institute (R01 CA122804 au S.L.C.) et au ministère de la Défense (X81XWH-09-1-0086 et W81XWH-12-1-0164 au S.L.C.).

....

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

Références

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.

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