Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Temsili Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Genetiği değiştirilmiş farelerdeki sinir sistemi neoplazmlarının insan meslektaşlarının patolojisini doğru bir şekilde özetleyip özetlemediğini değerlendirmek için bir metodoloji geliştirdik. Burada, bu histolojik teknikleri, tanımlanmış patolojik kriterleri ve kültür metodolojilerini P 0-GGFβ3 fare modelinde ortaya çıkan nörofibromlara ve malign periferik sinir kılıfı tümörlerine uyguluyoruz.

Özet

Otozomal dominant tümör yatkınlık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1) olan hastalar genellikle daha sonra oldukça agresif malign periferik sinir kılıfı tümörlerine (MPNST'ler) dönüşen pleksiform nörofibromlar (PN'ler) geliştirir. Bir PN'nin bir MPNST'ye dönüştüğü süreci anlamak, NF1'li insanlarda görülen PN-MPNST ilerlemesini doğru bir şekilde kopyalayan genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) modellerinin mevcudiyeti ile kolaylaştırılacaktır. Ne yazık ki, Nf1 ablasyonlu GEM modelleri bu süreci tam olarak özetlememektedir. Bu, Schwann hücrelerinde Schwann hücresi mitojen nöregulin-1'in (NRG1) aşırı ekspresyonunun yüksek frekanslı MPNST'ler haline gelen PN'lerin gelişmesiyle sonuçlandığı bir GEM modeli olan P 0-GGFβ3 farelerini geliştirmemize yol açtı. Bununla birlikte, P 0-GGFβ3 farelerinde tümör oluşumu ve neoplastik ilerlemenin NF1 hastalarında görülen süreçleri doğru bir şekilde modelleyip modellemediğini belirlemek için, önce P0-GGFβ3 periferik sinir kılıfı tümörlerinin patolojisinin insan meslektaşlarının patolojisini özetlediğini kanıtlamamız gerekiyordu.

Burada, P 0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3 kullanarak GEM modellerinde periferik sinir sistemi neoplazmlarını doğru bir şekilde teşhis etmek ve derecelendirmek için kullanılan özel metodolojileri açıklıyoruz; Örnek olarak Trp53+/- fareler. PN ve MPNST'leri teşhis etmek için kullanılan histolojik, immünohistokimyasal ve histokimyasal yöntemleri, bu neoplazmların patolojilerini taklit eden diğer tümör tiplerinden nasıl ayırt edileceğini ve bu neoplazmların nasıl derecelendirileceğini açıklıyoruz. GEM MPNST'lerden erken geçiş kültürlerinin oluşturulmasını, bu kültürlerin immünositokimya kullanılarak nasıl karakterize edileceğini ve allogreftler oluşturularak tümörjenitelerinin nasıl doğrulanacağını tartışıyoruz. Toplu olarak, bu teknikler GEM modellerinde ortaya çıkan PN'lerin ve MPNST'lerin patolojisini karakterize eder ve bu murin tümörlerinin patolojisini insan meslektaşlarıyla eleştirel olarak karşılaştırır.

Giriş

Son otuz yılda, çok sayıda laboratuvar, insan kanseriyle ilişkili mutasyonları fare genomuna sokarak veya insan kanserlerinde aşırı eksprese edilen bir gen ürününü aşırı eksprese ederek insan kanserlerinin fare modellerini oluşturmaya çalışmıştır. Ortaya çıkan genetiği değiştirilmiş fare (GEM) modelleri, yeni tanıtılan genomik modifikasyonun tümör oluşumunu başlattığını belirlemek, tümör ilerlemesine katkıda bulunan daha sonra meydana gelen diğer genetik veya epigenetik değişiklikleri tanımlamak ve tümörün başlamasını ve ilerlemesini sağlayan anahtar sinyal yollarını tanımlamak gibi çeşitli amaçlar için kullanılabilir. İmmün yetmezliği olan farelerin kullanımına dayan....

Protokol

Burada açıklanan prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nin IACUC'si tarafından onaylanmıştır ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve MUSC'nin kurumsal hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmiştir.

1. P 0-GGFβ3 farelerinde tümör penetransının ve sağkalımının belirlenmesi ve daha ileri karakterizasyon için bu hayvanlarda tümörlerin tanımlanması

  1. Tümör oluşumu açısından değerlendirilecek fare kohortunu oluşturun. Gerekli fare sayısı, tümör fenotipinin penetransına bağlıdır. Bu gibi kayıpları telafi etmek için, isten....

Temsili Sonuçlar

Şekil 2, P 0-GGFβ3 farelerinde ortaya çıkan büyük ölçüde belirgin neoplazmların örneklerini göstermektedir. Çıplak gözle kolayca tanımlanabilen tümörler, Şekil 2A'da (ok) görüldüğü gibi vücut bölgelerini şişiren kitleler olarak görülebilir. Neoplazmın potansiyel olarak bir periferik sinir kılıfı tümörü olup olmadığını belirlerken, tümörün bir periferik sinir ile ilişkili olduğunu belirlemek önemlidir. Bu .......

Tartışmalar

Burada sunulan histolojik ve biyokimyasal yöntemler, nörofibrom ve MPNST patogenezinin GEM modellerini teşhis etmek ve karakterize etmek için bir çerçeve sağlar. Yıllar geçtikçe, bu metodolojilerin GEM modellerinde ortaya çıkan periferik sinir kılıfı tümörlerinin patolojisini değerlendirmek için oldukça yararlı olduğunu gördük 21,25,26. Bununla birlikte, burada özetlenen protokoller, GEM modellerindeki t.......

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü'nden (R01 NS048353 ve R01 NS109655 SLC'ye hibelerle desteklenmiştir; R01 NS109655-03S1'den D.P.J.'ye), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804'den SLC'ye) ve Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086 ve W81XWH-12-1-0164'ten SLC'ye).

....

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

Referanslar

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır