JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Genetiği değiştirilmiş farelerdeki sinir sistemi neoplazmlarının insan meslektaşlarının patolojisini doğru bir şekilde özetleyip özetlemediğini değerlendirmek için bir metodoloji geliştirdik. Burada, bu histolojik teknikleri, tanımlanmış patolojik kriterleri ve kültür metodolojilerini P 0-GGFβ3 fare modelinde ortaya çıkan nörofibromlara ve malign periferik sinir kılıfı tümörlerine uyguluyoruz.

Özet

Otozomal dominant tümör yatkınlık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1) olan hastalar genellikle daha sonra oldukça agresif malign periferik sinir kılıfı tümörlerine (MPNST'ler) dönüşen pleksiform nörofibromlar (PN'ler) geliştirir. Bir PN'nin bir MPNST'ye dönüştüğü süreci anlamak, NF1'li insanlarda görülen PN-MPNST ilerlemesini doğru bir şekilde kopyalayan genetik olarak tasarlanmış fare (GEM) modellerinin mevcudiyeti ile kolaylaştırılacaktır. Ne yazık ki, Nf1 ablasyonlu GEM modelleri bu süreci tam olarak özetlememektedir. Bu, Schwann hücrelerinde Schwann hücresi mitojen nöregulin-1'in (NRG1) aşırı ekspresyonunun yüksek frekanslı MPNST'ler haline gelen PN'lerin gelişmesiyle sonuçlandığı bir GEM modeli olan P 0-GGFβ3 farelerini geliştirmemize yol açtı. Bununla birlikte, P 0-GGFβ3 farelerinde tümör oluşumu ve neoplastik ilerlemenin NF1 hastalarında görülen süreçleri doğru bir şekilde modelleyip modellemediğini belirlemek için, önce P0-GGFβ3 periferik sinir kılıfı tümörlerinin patolojisinin insan meslektaşlarının patolojisini özetlediğini kanıtlamamız gerekiyordu.

Burada, P 0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3 kullanarak GEM modellerinde periferik sinir sistemi neoplazmlarını doğru bir şekilde teşhis etmek ve derecelendirmek için kullanılan özel metodolojileri açıklıyoruz; Örnek olarak Trp53+/- fareler. PN ve MPNST'leri teşhis etmek için kullanılan histolojik, immünohistokimyasal ve histokimyasal yöntemleri, bu neoplazmların patolojilerini taklit eden diğer tümör tiplerinden nasıl ayırt edileceğini ve bu neoplazmların nasıl derecelendirileceğini açıklıyoruz. GEM MPNST'lerden erken geçiş kültürlerinin oluşturulmasını, bu kültürlerin immünositokimya kullanılarak nasıl karakterize edileceğini ve allogreftler oluşturularak tümörjenitelerinin nasıl doğrulanacağını tartışıyoruz. Toplu olarak, bu teknikler GEM modellerinde ortaya çıkan PN'lerin ve MPNST'lerin patolojisini karakterize eder ve bu murin tümörlerinin patolojisini insan meslektaşlarıyla eleştirel olarak karşılaştırır.

Giriş

Son otuz yılda, çok sayıda laboratuvar, insan kanseriyle ilişkili mutasyonları fare genomuna sokarak veya insan kanserlerinde aşırı eksprese edilen bir gen ürününü aşırı eksprese ederek insan kanserlerinin fare modellerini oluşturmaya çalışmıştır. Ortaya çıkan genetiği değiştirilmiş fare (GEM) modelleri, yeni tanıtılan genomik modifikasyonun tümör oluşumunu başlattığını belirlemek, tümör ilerlemesine katkıda bulunan daha sonra meydana gelen diğer genetik veya epigenetik değişiklikleri tanımlamak ve tümörün başlamasını ve ilerlemesini sağlayan anahtar sinyal yollarını tanımlamak gibi çeşitli amaçlar için kullanılabilir. İmmün yetmezliği olan farelerin kullanımına dayanan ortotopik ksenogreft modellerinin aksine, GEM kanser modelleri tamamen işlevsel bir bağışıklık sistemine sahiptir ve bu nedenle aday terapötik ajanlara verilen yanıtları daha doğru bir şekilde modellemektedir. Bununla birlikte, GEM kanser modellerini bu gibi amaçlar için kullanırken, araştırmacıların GEM neoplazmları ile yapılan gözlemlerin insan meslektaşlarıyla ilgili olduğunu doğrulamaları önemlidir. Bu doğrulama, GEM neoplazmlarının patolojisinin kapsamlı bir değerlendirmesini ve GEM neoplazmlarının patolojik özelliklerinin karşılık gelen insan tümör tipinin patolojisini özetleyip özetlemediğinin belirlenmesini içermelidir.

Tümör yatkınlık sendromu nörofibromatozis tip 1 (NF1), insan sinir sistemini etkileyen en yaygın genetik hastalıktır ve her 3.000-3.500 canlı doğumda yaklaşık 1'inde görülür 1,2,3. NF1'den etkilenen bireyler, derilerinde (dermal nörofibromlar) ve büyük sinirlerde ve sinir pleksuslarında (pleksiform nörofibromlar) nörofibromlar olarak bilinen çok sayıda iyi huylu periferik sinir kılıfı tümörü geliştirir. Hem dermal hem de pleksiform nörofibromlar fiziksel, davranışsal ve/veya sosyal bozukluk üreterek hastanın yaşam kalitesini kötüleştirirken, pleksiform nörofibromlar (PN'ler) özellikle tehlikelidir 4,5. Bunun nedeni, PN'lerin sıklıkla son derece düşük sağkalım oranınasahip agresif iğsi hücreli neoplazmlar olan malign periferik sinir kılıfı tümörlerine (MPNST'ler) dönüşmesidir 1,2. Büyük ölçüde, bu düşük sağkalım oranı, şu anda MPNST'leri tedavi etmek için kullanılan radyo ve kemoterapötik rejimlerin etkisiz olmasından kaynaklanmaktadır. Bununla birlikte, yeni, daha etkili tedaviler geliştirmek zor olmuştur. Bunun nedeni, MPNST'lerin NF1 hastalarında ne kadar sık ortaya çıktığına rağmen, hala nadir görülen neoplazmlar olmalarıdır. Sonuç olarak, çalışma için çok sayıda insan tümörü elde etmek çok zordur; Klinik araştırmalar için MPNST'li yeterli sayıda hastayı işe almak da zordur. Bu sınırlamaların üstesinden gelmek için, nörofibroma patogenezini ve PN-MPNST ilerlemesini yönlendiren anormallikler hakkında daha fazla bilgi edinmek ve aday terapötik ajanlarla klinik öncesi çalışmaları kolaylaştırmak amacıyla çeşitli GEM modelleri oluşturulmuştur.

NF1 hastaları, NF1 geninin bir kopyasında inaktive edici mutasyonlara sahiptir. Nörofibroma patogenezi Schwann hücre soyundan bir hücrede kalan fonksiyonel NF1 geninde inaktive edici bir mutasyon meydana geldiğinde tetiklenir. Bununla birlikte, şaşırtıcı bir şekilde, fareler germ hattını inaktive eden Nf1 mutasyonları ile üretildiğinde, nörofibromlargeliştirmediler 6,7. Nf1-null Schwann hücrelerine sahip farelerin ve diğer tüm hücre tiplerinde Nf1 haplo yetmezliğinin (Krox20-Cre;Nf1flox/- fareler) geliştirilen pleksiform nörofibromlar, nörofibrom patogenezi için ek hücre tiplerinde azaltılmış Nf1 gen dozajının gerekli olduğunu öne sürdü8. O zaman bile, Krox20-Cre'deki pleksiform nörofibromlar; Nf1flox/- fareler MPNST olmak için ilerlemediler ve bu nedenle insan meslektaşlarının biyolojisini sadece kısmen taklit ettiler. MPNST patogenezi Nf1 mutasyonları, Trp539 veya Cdkn2a10 gibi ek tümör baskılayıcı genlerdeki mutasyonlarla ortaklaştığında ortaya çıkmıştır, ancak bu GEM modellerindeki MPNST'ler, önceden var olan iyi huylu pleksiform nörofibromlardan ziyade de novo veya belirsiz biyolojik potansiyele sahip atipik nörofibromatöz neoplazmlardan (ANNUBP'ler)11,12 gelişmiştir (bkz.13,14 bu modellerin yanı sıra Suz12 ve Pten15 gibi genlerde MPNST ile ilişkili ek fonksiyon kaybı mutasyonlarını tanıtan diğer modellerin mükemmel incelemeleri için).

Bu fare modelleri, NF1, TP53 ve CDKN2A gibi genlerin NF1 ile ilişkili periferik sinir sistemi neoplazmlarının patogenezinde oynadığı rolü belirlemek ve aday terapötik ajanları test eden klinik öncesi çalışmalar için paha biçilmez olmuştur. Bununla birlikte, pleksiform nörofibromların belirsiz biyolojik potansiyele sahip atipik nörofibromatöz neoplazmlar (ANNUBPs16) ve daha sonra MPNST'ler haline gelme süreci hakkında hala eksik bir anlayışa sahibiz. Nf1 ve Arf'de delesyonları olan farelerin MPNST'ler11 olma yolunda ilerleyen ANNUBP'ler geliştirdiğine dair son raporla bu süreci anlamada son zamanlarda bazı ilerlemeler kaydedilmiştir. Bununla birlikte, insanlarda görülen pleksiform nörofibrom-MPNST ilerlemesi sürecini tam olarak özetleyen Nf1 mutasyonuna dayalı fare modelleri henüz mevcut değildir. Ek olarak, MPNST'lerin geliştirilmesine yol açan birden fazla farklı yol olup olmadığı açık değildir. Bu göz önüne alındığında, yukarıda tarif edilen GEM'lerin sadece nörofibrom-MPNST ilerlemesine ve MPNST patogenezine yol açan birkaç farklı yolun bir alt kümesini modellemesi mümkündür. Bu nokta, MPNST'lerin sporadik olarak da ortaya çıkması ve bazı sporadik MPNST'lerin görünüşte NF1 mutasyonlarına sahip olmamasıgerçeğiyle vurgulanmaktadır 17,18.

Bu son nokta, Magollon-Lorenz ve arkadaşlarının NF1 mutasyonlarından yoksun en azından bazı sporadik MPNST'lerin melanom veya farklı bir sarkomtipi 19 olduğu yönündeki son önerisiyle sorgulanmış olsa da, yakın zamanda sporadik bir MPNST ve bu tümörden türetilen bir hücre hattı (2XSB hücreleri) NF1 vahşi tip20. Ana tümörün ve 2XSB hücre hattının karakterizasyonu sırasında, sporadik malign periferik sinir kılıfı tümörünün ayırıcı tanısında rutin olarak düşünülen melanom ve diğer birçok sarkom tipi dahil olmak üzere alternatif tanı olasılıklarını sistematik olarak dışladık20. Ek olarak, Magollon-Lorenz ve ark. çalıştıkları üç sporadik MPNST hücre hattındaki bulgularının, sporadik MPNST'ler olarak tanımlanan tüm tümörlerin MPNST olmadığını gösterecek şekilde genelleştirilemeyeceğini kabul ettiler.

Nörofibrom ve MPNST patogenezinin mutlaka spesifik tümör baskılayıcı gen mutasyonlarına bağlı olmadığı bir GEM modeli oluşturmak için, güçlü Schwann hücresi mitojen nöregulin-1'in (NRG1) aşırı ekspresyonunun Schwann hücresine özgü miyelin proteini sıfır (P0) promotörü (P 0-GGFβ3 fareleri) tarafından yönlendirildiği transgenik fareler ürettik21. İnsan nörofibromlarının, MPNST'lerin ve MPNST hücre hatlarının, NRG1 sinyaline aracılık eden erbB reseptörü tirozin kinazlar (erbB2, erbB3 ve erbB4) ile birlikte birkaç NRG1 izoformunu eksprese ettiğini ve bu erbB reseptörlerinin yapısal olarak aktive olduğunu daha önce göstermiştik22. Ayrıca erbB kinazların farmakolojik inhibitörlerinin MPNST proliferasyonunu22, sağkalım23 ve migrasyon24'ü güçlü bir şekilde inhibe ettiğini gösterdik. İnsanlardaki gözlemlerimize uygun olarak, P 0-GGFβ3 fareleri, yüksek frekansta MPNST'ler haline gelen pleksiform nörofibromlar 25 geliştirir 21,25. P 0-GGFβ3 MPNST'lerin, insan meslektaşları gibi, yaygın olarak Trp53 ve Cdkn2a mutasyonlarının yanı sıra tümör oluşumuna potansiyel olarak katkıda bulunan çok sayıda başka genomik anormallik geliştirdiğini gösterdik25. P 0-GGFβ3 farelerinde ortaya çıkan MPNST'lerde inaktive edici Nf1 mutasyonları yoktur. Bununla birlikte, genetik tamamlamayı kullanarak, NRG1'in P 0-GGFβ3 farelerinde tümörijenezi desteklediğini gösterdik, ağırlıklı olarak Nf1 kaybı26 ile değiştirilen aynı sinyal kaskadları yoluyla; bu sonuç, Trp53 haploinyofisi varlığında Nf1 kaybı için NRG1 aşırı ekspresyonunun ikame edilmesinin (P 0-GGFβ3;Trp53+/- fareler), cis-Nf1+/-'de görüldüğü gibi, MPNST'lerin de novo geliştirdiği hayvanlar üretir; Trp53+/- fareler27.

P 0-GGFβ3 farelerinin, NF1'li insanlarda görülen nörofibroma patogenezi ve nörofibrom-MPNST ilerlemesi süreçlerini doğru bir şekilde modellediğini gösteren bu ve diğer bilgileri elde etmek için, bu hayvanlardan alınan dokuları işlemek, tümörlerini doğru bir şekilde teşhis etmek, bu farelerde ortaya çıkan MPNST'leri derecelendirmek, erken geçiş P0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3'ü oluşturmak ve karakterize etmek için özel metodolojiler geliştirdik; Trp53+/- MPNST kültürleri ve P 0-GGFβ3 PN'leri ve MPNST'ler ile P0-GGFβ3'ün patolojisinin eleştirel olarak karşılaştırılması; Trp53+/- MPNST'ler insan meslektaşlarınınkine. Bu metodolojilerin çoğu, sinir sistemi neoplazisinin diğer GEM modellerine genellenebilir. Ek olarak, bu metodolojilerin birçoğu, neoplazmların diğer organ bölgelerinde ortaya çıktığı GEM modellerine daha geniş bir şekilde uygulanabilir. Sonuç olarak, burada bu metodolojilerin ayrıntılı bir açıklamasını sunuyoruz.

Protokol

Burada açıklanan prosedürler, Güney Carolina Tıp Üniversitesi'nin IACUC'si tarafından onaylanmıştır ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve MUSC'nin kurumsal hayvan bakımı yönergelerine uygun olarak uygun şekilde eğitilmiş personel tarafından gerçekleştirilmiştir.

1. P 0-GGFβ3 farelerinde tümör penetransının ve sağkalımının belirlenmesi ve daha ileri karakterizasyon için bu hayvanlarda tümörlerin tanımlanması

  1. Tümör oluşumu açısından değerlendirilecek fare kohortunu oluşturun. Gerekli fare sayısı, tümör fenotipinin penetransına bağlıdır. Bu gibi kayıpları telafi etmek için, istenen nihai hayvan sayısından %10-15 daha yüksek bir kohortla başlayın.
    NOT: P 0-GGFβ3 farelerde tümör penetrasyonunu 50 fareden oluşan bir başlangıç kohortunda ampirik olarak belirledik (bunlardan altısı neoplazi ile ilgili olmayan nedenlerle kaybedildi (ör., kavga))25.
  2. Hayvanların sağlığını haftada üç kez değerlendirin ve her muayenede ağırlık ve davranış değişiklikleri dahil olmak üzere vücut kondisyon puanlarını kaydedin. Tümör taşıyan veya can çekişen fareleri (aşağıdaki nota bakın) karbondioksit ötenazi ve ardından servikal çıkık kullanarak sonlandırın. Ölüm yaşını gün olarak kaydedin. Tümörler dışarıdan görülebiliyorsa, tümör boyutlarını (uzunluk, genişlik ve yükseklik) kaydedin.
    NOT: Hayvanların, IACUC onaylı izin verilen maksimum tümör boyutunu ve/veya insani son noktayı geçmesine izin verilmemesi esastır.
  3. Ölüm yaşını kullanarak, ortalama ölüm yaşını ve hayatta kalma aralığını belirlemek için bir Kaplan-Meier sağkalım eğrisi oluşturun.
    NOT: P 0-GGFβ3 farelerinin ortalama ölüm yaşı 261.5 gündü ve aralığı 74-533 gündü; Kohortumuzun %91'inde multipl nörofibromlar ve %71'inde MPNST'lervardı 21.
  4. Büyük ölçüde görünür tümörlerin mevcut olup olmadığını belirleyin ve eğer varsa, tümörün periferik bir sinirle ilişkili olup olmadığını belirlemek için steril koşullar altında inceleyin ve ardından tümörü çıkarın. P 0-GGFβ3 ve P0-GGFβ3'te; Trp53+/- fareler, periferik sinir kılıfı tümörleri en sık trigeminal ve siyatik sinirlerde bulunur. Bu sinirlerle ilişkili olarak büyük ölçüde görünür tümörler görülmese bile, bu sinirleri aşağıda tarif edildiği gibi sabitleyin ve gömün, böylece mikro tümörlerin varlığı açısından incelenebilirler. Mikro tümörler tipik olarak bu sinirlerle ilişkili gangliyonlar içinde ortaya çıkar.
  5. Büyük ölçüde görülebilen tümörleri üç parçaya bölün (Şekil 1A). Histoloji (parafin kesitleri, immünohistokimya ve histokimya) için parça 1'i kullanın. Erken geçiş kültürleri oluşturmak için parça 2'yi kullanın. Gelecekteki olası deneyler (örneğin, immünoblotlar, RNA ve DNA izolasyonu) için parça 3'ü (sıvı nitrojen kullanarak) dondurun.
  6. Parça 1'i% 4'te 4 paraformaldehiti fosfat tamponlu salin (PBS) içinde gece boyunca 4 °C'de sabitleyin Hayvanın vücudunun geri kalanını gece boyunca 4 ° C'de% 4 paraformaldehite batırarak sabitleyin.

2. Büyük ölçüde görünür tümörlerin parafin gömülmesi ve ilk tanısal değerlendirme için hematoksilen ve eozin boyalı bölümlerin hazırlanması

  1. Büyük ölçüde görülebilen tümörlerin parafin gömülmesi
    1. Tümör parçasını 1 gece boyunca% 4 paraformaldehit içinde sabitledikten sonra, dokuyu 15 dakika boyunca doku hacminden en az 10 kat daha büyük bir PBS hacmine yerleştirerek durulayın; Sonraki tüm durulamalar için aynı hacmi kullanın. Her durulama için yeni bir PBS hacmi kullanarak iki kez daha 15 dakikalık PBS durulamayı tekrarlayın.
    2. Tümör parçasını 1 ila% 70 etanol aktarın. Dokuyu 4 ° C'de 24 saat boyunca% 70 etanol içinde tutun. İstenirse, dokuyu bu koşullar altında uzun süreli saklayın.
      NOT: 2.1.1'den 2.1.7'ye kadar olan adımlar, ticari bir kağıt mendil işleme makinesine erişimi olmayan araştırmacıların yararına sağlanmıştır. Araştırmacının bir doku işlemcisine erişimi varsa, doku, programlanmış cihaz protokolüne göre derecelendirilmiş etanoller ve ksilenler aracılığıyla işlenecektir.
    3. Tümör parçasını oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 1 ila% 80 etanol aktarın. İnkübasyonu, taze% 80 etanol hacminde 30 dakika daha tekrarlayın.
    4. Tümör parçasını oda sıcaklığında 75 dakika boyunca% 95 etanol ile% 95 arasında aktarın. İnkübasyonu iki kez daha tekrarlayın, her seferinde taze bir hacimde% 95 etanol içinde 75 dakika daha.
    5. Tümör parçasını 1 ila %100 etanol aktarın ve oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edin. 60 dakikalık inkübasyonu, her seferinde taze hacimde %100 etanol kullanarak iki kez daha tekrarlayın.
    6. Tümör parçası 1'i d-limonen bazlı bir çözücüye aktarın ve oda sıcaklığında 30-60 dakika inkübe edin. Tümör parçası 1'i taze bir d-limonen bazlı çözücü hacmine aktarın ve oda sıcaklığında 30-60 dakika daha inkübe edin.
    7. Tümör parçasını 1 ° C'de 1 saat boyunca 1: 1 parafin / d-limonen bazlı çözücüye aktarın 1 °C'de 1: 1 parafin / d-limonen bazlı çözücüyü atın ve tümör parçasını 1 °C'ye aktarın ve 60 °C'de 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonu taze bir hacimde 60 °C parafin içinde bir kez daha 20 dakika boyunca tekrarlayın. Tümör parçası 1'i gece boyunca 60 ° C'deparafin içinde inkübe edin.
    8. Çelik bir histoloji kalıbına bir taban parafin tabakası dökün ve katılaşmasına izin verin. Tümör parçası 1'i baz parafinin yüzeyine aktarın ve yerleştirmeden hemen sonra dokuyu 60 oC parafin ile örtün ve doku kasetini erimiş parafinin üzerine ve temas edecek şekilde yerleştirin. Kalıbı gömme istasyonunun soğuk tarafına aktarın ve 10-15 dakika katılaşmasına izin verin.
    9. Ekli doku kaseti ile parafin bloğunu kalıptan çıkarın. Kesitleme sırasında bloğu mikrotoma sıkıştırmak için ekli doku kasetini kullanın.
      NOT: Parafin bloğu artık oda sıcaklığında süresiz olarak saklanabilir.
  2. Büyük ölçüde görülebilen tümörlerin hematoksilen ve eozin ile boyanmış bölümlerini hazırlayın.
    1. Bir mikrotom kullanarak tümör dokusunun 4-5 μm'lik kesitlerini kesin ve bunları pozitif yüklü cam slaytlara monte edin.
    2. Hematoksilen ve eozin (H & E) boyaması yapmak için, slaytları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca d-limonen bazlı bir çözücü içinde inkübe ederek doku bölümlerini deparafinize edin. İnkübasyonu taze bir hacimde d-limonen bazlı çözücü içinde 10 dakika tekrarlayın.
    3. Slaytları %100 etanole aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Slaytları taze bir %100 etanol hacmine aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika daha inkübe edin.
    4. Slaytları% 95 etanole aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Slaytları taze bir hacimde% 95 etanole aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika daha inkübe edin.
    5. Slaytları% 70 etanole aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha sonra% 50 etanole aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    6. Slaytları damıtılmış suya aktarın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    7. Slaytları oda sıcaklığında 5 dakika hematoksilen içine batırarak boyayın. Akan musluk suyuyla 1-2 dakika durulayın. Slaytları %70 etanol içinde %0,5 hidroklorik asit içine 2-5x daldırarak farklılaştırın. Akan bir musluk suyu banyosunda 1-2 dakika durulayın. Slaytları 10 saniye boyunca% 0,5 asetik asit ile% 95 etanol içine yerleştirin.
    8. Slaytları oda sıcaklığında 30 saniye boyunca eozin-Y ile boyayın ve ardından slaytları 5 dakika boyunca% 100 etanole aktarın. Numuneleri d-limonen bazlı bir çözücüde 5 dakika boyunca temizleyin.
    9. Lameller, klişe hala d-limonen bazlı çözücü ile ıslakken ksilen bazlı bir montaj ortamı kullanarak monte edin. Montaj ortamının gece boyunca kurumasına izin verin.
      NOT: Su bazlı bir montaj ortamı kullanmayın.
  3. Pleksiform nörofibromları ve mikro-MPNST'leri tanımlamak için büyük ölçüde görünür tümörler olmadan dokuları hazırlayın. Dokuları parafine gömün, histolojik kesitler hazırlayın ve bu kesitleri hematoksilen ve eozin ile boyayın.
    1. Tümörlerin mikroskobik kanıtları için incelenecek H ve E ile boyanmış bölümleri hazırlamak için iç organları çıkarın ve her organın temsili kısımlarını parafine gömün (Şekil 1B). Başı, ön ayakları, arka ayakları ve kuyruğu çıkarın (Şekil 1C). Sinir kökü tümörlerinin kanıtı için omurilik ve sinir köklerini yerinde incelemek için, vertebral kolonu ve ilişkili kaburgaları ve yumuşak dokuyu 4 °C'de 48-72 saat boyunca 0.3 M EDTA /% 4 paraformaldehye (pH 8.0) içine daldırarak kireçten arındırın; daha sonra numuneleri 1x PBS ile durulayın. Dekalsifikasyonun sonunda, vertebral kolonu bir iğne ile delmeye çalışarak dekalsifikasyonun tamamlandığından emin olun. İğne kemiğe çatırdamadan kolayca nüfuz ederse dekalsifikasyon başarılıdır.
    2. Kireçten arındırılmış vertebral kolonu ve ilişkili yapıları bir doku kasetine sığacak bloklar halinde kesin. Kademeli etanoller ve ardından 2.1.2-2.1.7 adımlarında açıklandığı gibi d-limonen bazlı bir çözücü ile dehidre edin. Parafine gömün ve 2.1.7-2.2.1 adımlarında açıklandığı gibi 4-5 μm'lik bölümler hazırlayın. H&E boyalarını 2.2.2-2.2.9 adımlarında açıklandığı gibi gerçekleştirin; Montaj ortamının gece boyunca sertleşmesine izin verin.

3. Potansiyel pleksiform nörofibromları tanımlayın ve tanıları doğrulamak için özel boyalar yapın

NOT: H&E ve GEM tümör kesitlerinin özel lekelerinin değerlendirilmesine deneyimli bir insan veya veteriner patoloğun dahil edilmesini şiddetle tavsiye ederiz.

  1. Potansiyel periferik sinir kılıfı tümörlerini tanımlamak için parlak alan mikroskobu kullanarak yukarıda tarif edildiği gibi hazırlanan H & E boyalı slaytları inceleyin. Nörofibromlar ve MPNST'ler periferik sinirler içinde ortaya çıktığından, mikroskobik tümörlerin periferik sinirle ilişkili olup olmadığını belirlemek önemlidir. Potansiyel periferik sinir kılıfı tümörleri olan blokları tanımlayın, böylece tanıları doğrulamak veya çürütmek için immün boyalar ve diğer özel boyalar yapılabilir.
  2. H & E boyalı kesitlerin parlak alan incelemesi sırasında görülen histolojik özelliklere dayanarak potansiyel PN'leri MPNST'lerden / diğer yüksek dereceli neoplazmlardan ayırt edin. İnsan PN'leri, ağırlıklı olarak uzun, genellikle dalgalı çekirdekli hücrelerden oluşan hafif hiperselüler neoplazmlardır. Birçok alanda, hücreler gevşek bir şekilde paketlenmiştir ve miksoid hücre dışı materyal ile ayrılabilir; P 0-GGFβ3 farelerdeki PN'ler benzer bir görünüme sahiptir. Mitozlar tipik olarak mevcut değildir; eğer öyleyse ve tümör orta ila yüksek derecede hiperselüler ise, tümör bir MPNST veya başka bir yüksek dereceli neoplazm türüdür (aşağıya bakınız).
  3. PN'ler, neoplastik Schwann hücrelerinin ve mast hücreleri gibi diğer neoplastik olmayan hücre tiplerinin bir karışımından oluşur. Bir PN'nin kimliğini doğrulamak için, H&E incelemesinde tanımlanan potansiyel PN'leri içeren bloklardan kesitler üzerinde Schwann hücre belirteçleri S100β ve Sox10 ve mast hücre belirteci CD117 (c-Kit) için immün boyalar uygulayın (alternatif mast hücresi işaretleyici boyama seçenekleri için bkz. bölüm 3.4). Düşük proliferasyon oranlarını doğrulamak için Ki67 immün boyaları gerçekleştirin.
    NOT: Tablo 1 , GEM pleksiform nörofibromların (S100β, Sox10, CD117, Ki67) rutin olarak tanımlanması, MPNST'lerin teşhisi ve nörofibromlarda bulunan diğer hücre tiplerinin tam bir değerlendirmesi için kullanılan antijen belirteçlerini listeler; bu son antijenleri sadece yeni bir GEM modelini ilk tanımladığımızda boyarız. Önerilen koşullar için antikor üreticisinin veri sayfasına bakın. Antikor üreticisinin ekinin antijen alımını önerip önermediğine dikkat edin; Tüm antijenlerin saptanabilmesi için geri alınması gerekmez.
    1. Seçilen parafin bloklarından 4-5 μm'lik kesitler hazırlayın ve bunları pozitif yüklü slaytlara monte edin. 2.2.2-2.2.6 adımlarında açıklandığı gibi bölümleri deparafinize edin.
    2. Bölümleri 1x PBS ile 3-5 dakika durulayın.
    3. Antikor üreticisi antijen alımını önerirse, sitrat tamponu hazırlayın. 9 mL sitrik asit çözeltisini (500 mL damıtılmış suda 10.5 g sitrik asit) ve 41 mL sodyum sitrat çözeltisini (500 mL damıtılmış suda 14.7 g sodyum sitrat) birleştirin.
    4. Isıtılmış bir pirinç pişiricide 20 dakika boyunca slaytları sitrat tamponuna yerleştirerek antijen alımını gerçekleştirin.
    5. Dokudaki peroksidaz aktivitesini ortadan kaldırmak için slaytları 10 dakika boyunca% 3 hidrojen peroksit / 1x PBS'ye aktarın.
      NOT: Bu çözeltiyi her seferinde taze yapın ve 3-4 aydan daha eskiyse stok hidrojen peroksit çözeltisini kullanmayın.
    6. Bölümleri 1x PBS'de durulayın.
    7. 1 saat boyunca engelleme tamponu (% 2 BSA,% 0.1 Triton X-100 in 1x PBS) kullanarak bölümleri engelleyin. Slaytları 1x PBS'de kısa bir süre durulayın.
    8. Doku kesitlerine primer antikor ekleyin. Seyreltilmiş bloke edici tamponda birincil antikorları hazırlayın. Slaytları 37 ° C'de2 saat veya gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    9. Slaytları 1x PBS'de 5 dakika yıkayın.
    10. Dokuyu biyotinile edilmiş ikincil antikor ile 1-2 saat inkübe edin.
    11. Üreticinin protokolüne göre diaminobenzidin (DAB) çözeltisi hazırlayın ve slaytları 2-10 dakika boyunca çözeltiye daldırın. Slaytları 5 dakika suda yıkayın.
    12. Bölümleri 10-15 dakika hematoksilen içine batırarak karşı boyayın. Berraklaşana kadar akan suya maruz bırakın. Slaytları hızla alkole batırın ve slaytları suyla durulayın.
    13. %70 etanol, %95 etanol ve ardından %100 etanol içinde çözelti başına 4-5 kez slaytları hızlı bir şekilde daldırarak dereceli etanollerde dehidrat slaytları. Slaytları d-limonen bazlı bir çözücü içinde 2 dakika inkübe edin. Slaytları ikinci bir d-limonen bazlı çözücü partisinde 2 dakika inkübe edin.
    14. Kızakları ksilen bazlı bir montaj ortamıyla monte edin.
    15. Slaytları parlak alan mikroskobu ile inceleyin.
    16. İmmünofloresan için 3.3.10-3.3.15 adımlarını atlayın. Bunun yerine, dokuyu 1-2 saat boyunca bloke edici tamponda seyreltilmiş türe özgü ikincil antikor ile inkübe edin.
    17. Slaytları 1x PBS'de 5 dakika durulayın.
    18. Slaytları 1x PBS/gliserol kullanarak monte edin.
    19. Floresan mikroskobu kullanarak slaytları inceleyin.
  4. Mast hücrelerini boyamak için alternatif yöntem: toluidin mavisi boyama
    1. 1 g toluidin mavisi O'yu 100 mL% 70 etanol içinde çözerek toluidin mavisi stok çözeltisi hazırlayın.
    2. 0.5 g NaCl'yi 50 mL damıtılmış suda çözerek% 1 sodyum klorür (NaCl) çözeltisi hazırlayın. Çözmek için karıştırın. HCl kullanarak pH'ı yaklaşık 2.0-2.5'e ayarlayın.
      NOT: Bu NaCl çözeltisi, her leke yapıldığında taze hale getirilmelidir.
    3. % 1 NaCl çözeltisinin 45 mL'sine 5 mL toluidin mavisi stok çözeltisi ekleyerek toluidin mavisi çalışma çözeltisini hazırlayın. İyice karıştırın ve pH'ın yaklaşık 2.3 olduğundan emin olun.
      NOT: 2.5'ten yüksek bir pH, daha az metakromazi ile lekelenmeye neden olur. Her boyama yapıldığında bu çözeltiyi taze yapın.
    4. Adım 2.2.2-2.2.6'da açıklandığı gibi pozitif yüklü slaytlara monte edilmiş 4-5 μm kesitleri deparafinize edin. Deparafinli bölümleri akan suda 2 dakika yıkayın.
    5. Toluidin mavisi çalışma solüsyonunda 2-3 dakika leke bölümleri. Damıtılmış suda 2 dakika yıkayın.
    6. %95 etanole 10 kez daldırarak bölümleri kurutun. Slaytları %100 etanol 10x içine daldırın. Slaytları 10 kez daha taze %100 etanole batırın.
    7. Slaytları d-limonen bazlı bir çözücü içinde 2 dakika inkübe edin. Slaytları ikinci bir d-limonen bazlı çözücü partisinde 2 dakika inkübe edin.
    8. Lameller, klişe hala d-limonen bazlı bir çözücü ile ıslakken ksilen bazlı bir montaj ortamı kullanarak monte edin.
      NOT: Su bazlı bir montaj ortamı kullanmayın.
    9. Slaytları parlak alan mikroskobu ile inceleyin. Mast hücrelerini, sitoplazmalarında koyu mor granüllerin varlığına göre tanımlayın. Diğer hücre tipleri açık mavi renktedir.

4. MPNST'leri teşhis etmek ve alternatif teşhisleri ekarte etmek için özel lekeler

  1. İnsan MPNST'lerinin histolojik görünümü oldukça değişkendir ve birkaç farklı tümör tipi MPNST'lerinkine benzer bir görünüme sahiptir28. MPNST'ler Schwann hücre soyundan türetildiğinden, tümörün periferik bir sinirden mi yoksa mevcut bir iyi huylu PN'den mi kaynaklandığını H&E ile boyanmış bölümlerin brüt muayenesi veya parlak alan mikroskobik incelemesi ile belirleyin. MPNST'ler bazen periferik sinir veya PN ile ilişkili olmasa da (genellikle diseksiyon sırasında sinirden yanlışlıkla ayrılması, MPNST aşırı büyümesi yoluyla önceden var olan PN'nin tahrip edilmesi veya lezyonun metastatik olması nedeniyle), tümörün bir sinir veya PN ile ilişkisini arayın, çünkü tümör bir sinir veya PN ile ilişkili değilse tanı daha az olasıdır.
  2. Potansiyel MPNST'leri içeren parafin bloklarından 4-5 μm'lik kesitler hazırlayın ve bunları adım 2.2.1'de açıklandığı gibi pozitif yüklü slaytlara monte edin. 2.2.2-2.2.6 adımlarında açıklandığı gibi bölümleri deparafinize edin.
  3. Adım 3.3.1-3.3.15'te açıklandığı gibi Tablo 2'de belirtilen antikor paneli ile immünohistokimya gerçekleştirin.
  4. İmmün boyaları parlak alan mikroskobu ile inceleyin. MPNST'ler schwannian farklılaşması gösterdiğinden, S100β, nestin ve Sox10 için tek tip veya yamalı immünoreaktivite arayın. Tümörler bu üç belirteç için pozitif değilse, tanı koymak için Tablo 2'ye bakın.
    NOT: İnsan ve fare MPNST'leri farklı farklılaşmalar gösterebilir. Örneğin, bazı insan MPNST'leri fokal rabdomiyoblastik farklılaşma gösterir (bu varyantlar malign Triton tümörleri olarak bilinir); Bu neoplazmlar Schwannian belirteçleri için boyanacak olsa da, desmin, MyoD1 ve myogenin gibi kas belirteçlerini de eksprese ederler. Bu son belirteçler için immünoreaktivite, araştırmacıları tümörü MPNST olarak teşhis etmekten caydırmamalıdır. Sinovyal sarkom patogenezinimodellemek için SS18-SSX füzyon genini koşullu olarak eksprese eden çoklu fare modelleri oluşturulmuş olmasına rağmen, bildiğimiz kadarıyla, eşdeğer füzyon transkriptini kendiliğinden oluşturan sinovyal sarkom modelleri bilinmemektedir. Sonuç olarak, GEM tümörlerinde SS18-SSX füzyon transkriptlerini aramıyoruz ve bunun yerine immünohistokimyasal profillere güveniyoruz.

5. MPNST'lerin derecelendirilmesi

  1. DSÖ derece IV MPNST'lerin ayırt edici özelliği olan tümör nekrozunun mevcut olup olmadığını belirleyin. Derece IV MPNST'ler için, belirgin hiperselülarite, tempolu mitotik aktivite (10 yüksek güçlü (40x) alan başına ≥4 mitoz) ve sitolojik atipi arayın.
    1. Nekroz yoksa, hiperselülarite, tempolu mitotik aktivite ve sitolojik atipi olup olmadığını belirlemek için tümörü değerlendirin. Bu özelliklerin tümü nekroz yokluğunda mevcutsa, tümörü DSÖ derece III MPNST olarak derecelendirin.
    2. DSÖ derece II tümörler, DSÖ derece III ve IV MPNST'lerden daha az derecede artmış hücresellik ile karakterizedir. DSÖ derece II MPNST'deki tümör hücrelerinin çekirdekleri, artmış boyut (nörofibromlarda tümör hücresi çekirdeklerinin boyutunun 3 katından fazla) ve hiperkromazi gösterir. Artan mitotik aktivite (10 yüksek güç alanı başına <4 mitoz), DSÖ derece II tümörleri ile ilişkilidir, ancak bir gereklilik değildir.
      NOT: Yüksek dereceli tümörler tipik olarak daha düşük derecelerden ilerlediğinden, aynı MPNST'de düşük dereceli ve yüksek dereceli bölgeler mevcut olabilir. Bu durumda, tümörün derecesi mevcut en yüksek dereceli bölge tarafından belirlenir.
      NOT: İnsan patologları arasında, yukarıda açıklanan DSÖ derecelendirme sisteminin hasta sonuçlarını öngörüp öngörmediği konusunda tartışmalar vardır ve bu patologların bazıları bunun yerine MPNST'leri düşük dereceli veya yüksek dereceli olarak sınıflandırmayı tercih etmektedir. Bu şemaya göre, yüksek dereceli MPNST'ler belirgin sitolojik atipiye, tempolu mitotik aktiviteye (10 yüksek güç alanı başına >5 mitoz) ve nekrozlu veya nekrozsuz belirgin hiperselülariteye sahiptir. Düşük dereceli MPNST'ler nekrozdan yoksundur, ancak yüksek dereceli MPNST ile bilinmeyen biyolojik potansiyele sahip atipik bir nörofibromatöz neoplazm (ANNUBP) arasında orta düzeyde mitotik aktivite, sitolojik atipi ve hücresellik gösterir. Yukarıda açıklanan sistemi tercih ediyoruz çünkü bir ANNUBP ile düşük dereceli bir MPNST arasında ayrım yapmak, bu kuruluşlarla uzun deneyime sahip olmayan araştırmacılar için zor olabilir.

6. Erken geçiş P 0-GGFβ3 MPNST hücrelerinin kültürlerinin hazırlanması

  1. Taze tümör parçası 2'den erken geçiş P 0-GGFβ3 tümör hücrelerini kültürleyin (adım 1.5, Şekil 1A). Bu noktadan itibaren steril koşulları koruyun.
    1. Tümörü küçük (2-4 mm) parçalara ayırarak ve 100 mm'lik doku kültürü kaplarında %10 fetal buzağı serumu, 2 μmol/L forskolin ve 10 nmol/L nöregulin 1β (NRG1β) içeren DMEM10'da (Dulbecco'nun minimal esansiyel ortamı) kıyarak ayırın.
    2. Hücrelerin kıyılmış doku parçalarından 37 ° C'de% 5 CO2'de plakalar birleşene kadar büyümesine izin verin. Medyayı her 3-4 günde bir değiştirin.
    3. Hücre kültürünü bölün. Ortamı 100 mm'lik tabaktan çıkarın ve hücreleri PBS ile yıkayın; Kıyılmış dokuyu çıkarın ve atın. PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında 2-5 dakika boyunca 1 mL% 0.25 tripsin ekleyin. Hücre ayrılmasını desteklemek için, plakaya hafifçe vurun ve bir ışık mikroskobu kullanarak ayrılma olup olmadığını kontrol edin; Tripsin inkübasyonunu gerektiği gibi uzatın.
    4. 2 mL DMEM10 ekleyerek tripsini nötralize edin. Hücre süspansiyonunu bir santrifüj tüpüne ve pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 500 × g'da aktarın. Ortamı çıkarın ve pelete 5 mL taze DMEM10 ekleyin.
    5. Hücre süspansiyonunu DMEM10 içeren iki ila dört adet 100 mm'lik tabağa dağıtın. Hücreleri beşten fazla geçiş için bölmeyin (adım 6.1.3 ve 6.1.4) ve forskolin ve NRG1β olmadan DMEM'de tutun. İleride kullanmak üzere 2. pasajdaki hücreleri dondurmayı unutmayın.

7. Erken geçiş MPNST hücrelerinin kimliğinin immünositokimya ile doğrulanması

  1. Steril 18 mm # 1.5 yuvarlak cam lameller 6 oyuklu steril doku kültürü kaplarının kuyucuklarına yerleştirin.
    1. Poli-L-lizin/laminin çözeltisini, lamel örtmeye yetecek bir hacimde kuyucuklara yerleştirin. Buharlaşmayı en aza indirmek için plakayı plastik sargı ile kapatın. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin. Ertesi sabah, lamelleri 3x steril PBS ile yıkayın.
      NOT: Erken geçişli MPNST hücrelerini kaplanmamış lameller üzerine kaplamaya çalıştık ve hücrelerin poli-L-lizin/laminin kaplama yokluğunda iyi yapışmadığını bulduk.
    2. Lamel içeren her bir oyuğa büyüme ortamında 2 mL hücre süspansiyonu ekleyerek lamel üzerine 10.000 hücre yerleştirin. Plakaları bir doku kültürü inkübatöründe% 5 CO2 ile 37 ° C'de gece boyunca inkübe edin.
    3. Ertesi sabah, lamelleri PBS ile 2 x 5 dakika durulayın.
    4. Hücreleri% 4 paraformaldehit ile PBS'de oda sıcaklığında 18 dakika sabitleyin.
    5. Lamelleri PBS ile 3 x 5 dakika durulayın. İstenirse, plakayı plastik film kullanarak kapatın ve bu noktada 4 °C'de saklayın.
    6. PBS'de taze 50 mM NH4Cl yapın. Lamelleri 50 mM NH4Cl'de PBS'de oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ederek aldehitleri söndürün.
    7. Lamelleri PBS'de% 0.3 Triton X-100 içinde oda sıcaklığında 15 dakika inkübe ederek hücreleri geçirgenleştirin. Lamelleri PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
    8. Lamelleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edici tamponda (% 1 sığır serum albümini,% 0.2 yağsız kuru süt ve% 0.3 Triton X-100 içeren 1x PBS) inkübe ederek spesifik olmayan bağlanmayı bloke edin.
    9. Bloke edici tamponu çıkarın ve ana tümörde (tipik olarak S100β, Nestin ve Sox10) bulunan MPNST belirteçlerini tanıyan birincil antikorları ekleyin, bloke edici tamponda önceden belirlenmiş optimal seyreltmeye seyreltin. Plakayı plastik filmle sarın ve nemlendirilmiş bir odada gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    10. Bağlanmamış primer antikoru çıkarmak için PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın. Bloke edici tamponda seyreltilmiş floresan etiketli ikincil antikor ekleyin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Işıktan koruyun.
    11. PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın. Lamelleri 1-5 μg Hoechst boyasında 10 dakika inkübe edin. Işıktan korumaya devam edin.
    12. Lamelleri PBS ile 5 dakika yıkayın. Slaytları 1:1 1x PBS/gliserol kullanarak monte edin. Floresan mikroskop ile görüntü.

8. Tümörjeniteyi göstermek için erken geçiş tümör hücrelerinin allogrefti

  1. DMEM10'da erken geçişli P 0-GGFβ3 MPNST hücrelerini %80 birleşmeye kadar büyütün. Hücreleri oda sıcaklığında Hanks'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ile bir kez durulayın. Hücreleri, substrattan çıkarmak için enzimatik olmayan bir hücre ayrışma solüsyonu ile 30 s ila 1 dakika boyunca tedavi edin. Enzimatik olmayan bir hücre ayrışma reaktifinin 1 mL'si başına 5 mL DMEM10 ekleyin.
    NOT: Hücresel ayrışma 10-20 dakikaya kadar çok daha uzun sürebilir. Lütfen üreticinin protokolüne bakın.
    NOT: Greft etkinliğini azaltacağından hücreleri birleşecek şekilde büyütmeyin.
    1. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın. Hücreleri 5 dakika boyunca 5 × g'da döndürün ve 100 μL DMEM10 başına 1-2 ×10 6 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Enjeksiyona hazır olana kadar hücreleri buz üzerinde tutun.
    2. NOD-SCIDy (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) fareleri bir izofluran buharlaştırıcının indüksiyon odasında uyuşturun. Hayvanı karnına yerleştirin ve enjeksiyon bölgesini% 70 etanol ile sterilize edin. Enjeksiyondan önce bölgenin kurumasını bekleyin. Enjeksiyondan önce, hücrelerin oda sıcaklığına gelmesine izin verin.
    3. Sağ kanatta deri altına 1-2 x 106 hücre enjekte edin. Fareyi tek başına yataksız bir kafese yerleştirin ve iyileşmesine izin verin. Hipotermiyi önlemek için kafesin sadece bir kısmının ısıtma yastığı üzerinde olduğundan emin olun. Bu, aşırı ısınması durumunda farenin hareket edebileceği bir bölge sağlar.
      NOT: Bazı greftler alamayacağından, her erken geçiş kültüründe en az üç fareyi aşılıyoruz.
    4. Greftin 15-60 gün büyümesine izin verin; Hayvan sağlığını haftada 3 kez değerlendirin ve her muayenede ağırlık ve davranış değişiklikleri dahil olmak üzere vücut kondisyon puanlarını kaydedin. Maksimum izin verilen greft boyutuna ulaşan fareleri veya karbondioksit ötenazisi ve ardından servikal çıkık kullanarak can çekişen fareleri sonlandırın. Ölüm yaşını gün olarak kaydedin. Tümörler dışarıdan görünür hale geldikçe, tümör boyutlarını (uzunluk, genişlik ve yükseklik) kaydedin.
      NOT: Deneyimlerimize göre, farklı erken pasajlı MPNST kültürleri, değişen verimlilikle greftlenir ve greft büyümesi için gereken süre bakımından farklılık gösterir. Hayvanların, IACUC onaylı izin verilen maksimum tümör boyutunu ve/veya insancıl son noktayı geçmesine izin verilmemelidir.
  2. Tümörü toplayın, %4 paraformaldehit içinde sabitleyin, parafine gömün ve allogreftin reaktif bir dokudan ziyade bir tümör olduğunu doğrulamak için bölüm 2.1-2.2.9'da açıklandığı gibi H&E boyaları yapın. Gerekirse, ana tümörde bulunan belirteçler için grefti immün boya.

Sonuçlar

Şekil 2, P 0-GGFβ3 farelerinde ortaya çıkan büyük ölçüde belirgin neoplazmların örneklerini göstermektedir. Çıplak gözle kolayca tanımlanabilen tümörler, Şekil 2A'da (ok) görüldüğü gibi vücut bölgelerini şişiren kitleler olarak görülebilir. Neoplazmın potansiyel olarak bir periferik sinir kılıfı tümörü olup olmadığını belirlerken, tümörün bir periferik sinir ile ilişkili olduğunu belirlemek önemlidir. Bu ...

Tartışmalar

Burada sunulan histolojik ve biyokimyasal yöntemler, nörofibrom ve MPNST patogenezinin GEM modellerini teşhis etmek ve karakterize etmek için bir çerçeve sağlar. Yıllar geçtikçe, bu metodolojilerin GEM modellerinde ortaya çıkan periferik sinir kılıfı tümörlerinin patolojisini değerlendirmek için oldukça yararlı olduğunu gördük 21,25,26. Bununla birlikte, burada özetlenen protokoller, GEM modellerindeki t...

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, Ulusal Nörolojik Hastalıklar ve İnme Enstitüsü'nden (R01 NS048353 ve R01 NS109655 SLC'ye hibelerle desteklenmiştir; R01 NS109655-03S1'den D.P.J.'ye), Ulusal Kanser Enstitüsü (R01 CA122804'den SLC'ye) ve Savunma Bakanlığı (X81XWH-09-1-0086 ve W81XWH-12-1-0164'ten SLC'ye).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

Referanslar

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620 (2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834 (2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096 (2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al., Louis, D. N., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. , 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588 (2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır