Идентификация, диагностика и классификация злокачественных опухолей оболочки периферических нервов на генетически модифицированных мышиных моделях

Резюме

Мы разработали методику оценки того, точно ли новообразования нервной системы у генетически модифицированных мышей повторяют патологию своих собратьев человека. Здесь мы применяем эти гистологические методы, определяемые патологические критерии и методологии культивирования к нейрофибромам и злокачественным опухолям оболочки периферических нервов, возникающим на мышиной модели P 0-GGFβ3.

Аннотация

У пациентов с синдромом предрасположенности к аутосомно-доминантной опухоли нейрофиброматозом 1 типа (НФ1) обычно развиваются плексиформные нейрофибромы (ПН), которые впоследствии трансформируются в высокоагрессивные злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ). Понимание процесса, с помощью которого ПП трансформируется в МПНСТ, будет облегчено наличием генетически модифицированных мышиных моделей (GEM), которые точно воспроизводят прогрессию ПН-МПНСТ, наблюдаемую у людей с НФ1. К сожалению, модели GEM с абляцией Nf1 не полностью повторяют этот процесс. Это привело нас к разработке мышей P 0-GGFβ3, модели GEM, в которой гиперэкспрессия митогена нейрегулина-1 шванновских клеток (NRG1) в шванновских клетках приводит к развитию ПН, которые с высокой частотой превращаются в MPNST. Однако, чтобы определить, точно ли опухолегенез и опухолевая прогрессия у мышей P 0-GGFβ3 моделируют процессы, наблюдаемые у пациентов с NF1, мы должны были сначала доказать, что патология опухолей оболочки периферических нервов P_0-GGFβ3 повторяет патологию их человеческих аналогов.

В данной статье мы описываем специализированные методики, используемые для точной диагностики и классификации новообразований периферической нервной системы в моделях GEM, с использованием P 0-GGFβ3 и P_0-GGFβ3; В качестве примера можно привести мышей Trp53^+/-. Описаны гистологические, иммуногистохимические и гистохимические методы, применяемые для диагностики ПН и МПНСТ, как отличить эти новообразования от других типов опухолей, имитирующих их патологию, и как классифицировать эти новообразования. Мы обсуждаем создание ранних пассажных культур из GEM MPNST, как характеризовать эти культуры с помощью иммуноцитохимии и как проверить их опухолегенность путем создания аллотрансплантатов. В совокупности эти методы характеризуют патологию ПН и МПНСТ, возникающих в моделях GEM, и критически сравнивают патологию этих мышиных опухолей с их человеческими аналогами.

Введение

За последние три десятилетия многочисленные лаборатории пытались создать мышиные модели рака человека, вводя в геном мыши мутации, связанные с раком, или чрезмерно экспрессируя генный продукт, который чрезмерно экспрессируется в раковых опухолях человека. Полученные генетически модифицированные модели мышей (GEM) могут быть использованы для различных целей, таких как установление того, что вновь введенная геномная модификация инициирует опухолегенез, выявление других впоследствии происходящих генетических или эпигенетических изменений, которые способствуют прогрессированию опухоли, и определение ключевых сигнальных путей, которые управляют инициацией и прогрессировани....

протокол

Процедуры, описанные здесь, были одобрены IACUC Медицинского университета Южной Каролины и выполнялись надлежащим образом обученным персоналом в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациями MUSC по уходу за животными.

1. Определение пенетрантности и выживаемости опухоли у мышей P 0-GGFβ3 и идентификация опухолей у этих животных для дальнейшей характеристики

1. Создать когорту мышей, которые будут оцениваться на предмет онкогенеза. Необходимое количество мышей зависит от пенетрантности фенотипа опухоли. Чтобы компенсировать такие потери, начните с когорты, ....

Результаты

На рисунке 2 показаны примеры ярко выраженных новообразований, возникающих у мышей P 0-GGFβ3. Опухоли, которые легко идентифицировать невооруженным глазом, могут быть видны как образования, расширяющие области тела, как показано на рисунке 2А (стрелка).......

Обсуждение

Представленные здесь гистологические и биохимические методы обеспечивают основу для диагностики и характеристики GEM-моделей нейрофибромы и патогенеза MPNST. На протяжении многих лет мы обнаружили, что эти методики весьма полезны для оценки патологии опухолей оболочки периферических н?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31