АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы разработали методику оценки того, точно ли новообразования нервной системы у генетически модифицированных мышей повторяют патологию своих собратьев человека. Здесь мы применяем эти гистологические методы, определяемые патологические критерии и методологии культивирования к нейрофибромам и злокачественным опухолям оболочки периферических нервов, возникающим на мышиной модели P 0-GGFβ3.

Аннотация

У пациентов с синдромом предрасположенности к аутосомно-доминантной опухоли нейрофиброматозом 1 типа (НФ1) обычно развиваются плексиформные нейрофибромы (ПН), которые впоследствии трансформируются в высокоагрессивные злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ). Понимание процесса, с помощью которого ПП трансформируется в МПНСТ, будет облегчено наличием генетически модифицированных мышиных моделей (GEM), которые точно воспроизводят прогрессию ПН-МПНСТ, наблюдаемую у людей с НФ1. К сожалению, модели GEM с абляцией Nf1 не полностью повторяют этот процесс. Это привело нас к разработке мышей P 0-GGFβ3, модели GEM, в которой гиперэкспрессия митогена нейрегулина-1 шванновских клеток (NRG1) в шванновских клетках приводит к развитию ПН, которые с высокой частотой превращаются в MPNST. Однако, чтобы определить, точно ли опухолегенез и опухолевая прогрессия у мышей P 0-GGFβ3 моделируют процессы, наблюдаемые у пациентов с NF1, мы должны были сначала доказать, что патология опухолей оболочки периферических нервов P0-GGFβ3 повторяет патологию их человеческих аналогов.

В данной статье мы описываем специализированные методики, используемые для точной диагностики и классификации новообразований периферической нервной системы в моделях GEM, с использованием P 0-GGFβ3 и P0-GGFβ3; В качестве примера можно привести мышей Trp53+/-. Описаны гистологические, иммуногистохимические и гистохимические методы, применяемые для диагностики ПН и МПНСТ, как отличить эти новообразования от других типов опухолей, имитирующих их патологию, и как классифицировать эти новообразования. Мы обсуждаем создание ранних пассажных культур из GEM MPNST, как характеризовать эти культуры с помощью иммуноцитохимии и как проверить их опухолегенность путем создания аллотрансплантатов. В совокупности эти методы характеризуют патологию ПН и МПНСТ, возникающих в моделях GEM, и критически сравнивают патологию этих мышиных опухолей с их человеческими аналогами.

Введение

За последние три десятилетия многочисленные лаборатории пытались создать мышиные модели рака человека, вводя в геном мыши мутации, связанные с раком, или чрезмерно экспрессируя генный продукт, который чрезмерно экспрессируется в раковых опухолях человека. Полученные генетически модифицированные модели мышей (GEM) могут быть использованы для различных целей, таких как установление того, что вновь введенная геномная модификация инициирует опухолегенез, выявление других впоследствии происходящих генетических или эпигенетических изменений, которые способствуют прогрессированию опухоли, и определение ключевых сигнальных путей, которые управляют инициацией и прогрессированием опухоли. В отличие от ортотопических ксенотрансплантатов, которые основаны на использовании мышей с иммунодефицитом, модели рака GEM имеют полностью функциональную иммунную систему и, таким образом, более точно моделируют реакцию на потенциальные терапевтические агенты. Тем не менее, при использовании GEM-моделей рака для подобных целей важно, чтобы исследователи подтвердили, что наблюдения, сделанные с новообразованиями GEM, имеют отношение к их человеческим аналогам. Эта валидация должна включать в себя тщательную оценку патологии новообразований ГЭМ и определение того, повторяют ли патологические особенности новообразований ГЭМ патологию соответствующего типа опухоли человека.

Синдром предрасположенности к опухолям нейрофиброматоз 1 типа (НФ1) является наиболее распространенным генетическим заболеванием, поражающим нервную систему человека, встречающимся примерно у 1 из каждых 3000-3500 живорожденных 1,2,3. У людей, страдающих НФ1, развиваются множественные доброкачественные опухоли оболочки периферических нервов, известные как нейрофибромы, на коже (дермальные нейрофибромы) и в крупных нервах и нервных сплетениях (плексиформные нейрофибромы). В то время как как кожные и плексиформные нейрофибромы ухудшают качество жизни пациента, вызывая физические, поведенческие и/или социальные нарушения, плексиформные нейрофибромы (ПН) особенно опасны 4,5. Это связано с тем, что ПП часто трансформируются в злокачественные опухоли оболочки периферических нервов (МПНСТ), которые являются агрессивными веретеноклеточными новообразованиями с исключительно низкой выживаемостью 1,2. В значительной степени такая низкая выживаемость объясняется тем, что радио- и химиотерапевтические схемы, которые в настоящее время используются для лечения МПНСТ, неэффективны. Тем не менее, разработка новых, более эффективных методов лечения является сложной задачей. Это связано с тем, что, несмотря на то, что MPNST часто встречаются у пациентов с НФ1, они все еще являются редкими новообразованиями. В результате очень трудно получить большое количество опухолей человека для изучения; Кроме того, сложно набрать достаточное количество пациентов с МПНСТ для клинических испытаний. Для преодоления этих ограничений было создано несколько моделей GEM с целью получения более глубокого представления об аномалиях, лежащих в основе патогенеза нейрофибромы и прогрессирования PN-MPNST, а также для содействия доклиническим испытаниям потенциальных терапевтических агентов.

У пациентов с НФ1 наблюдаются инактивирующие мутации в одной копии гена НФ1. Патогенез нейрофибромы запускается, когда в клетке шванновской клеточной линии происходит инактивирующая мутация в оставшемся функциональном гене NF1. Удивительно, однако, что когда у мышей были получены мутации Nf1, инактивирующие зародышевую линию, у них не развились нейрофибромы 6,7. Последующая демонстрация того, что мыши с Nf1-нулевыми шванновскими клетками и гаплонедостаточностью Nf1 во всех других типах клеток (Krox20-Cre;У мышей Nf1flox/- развились плексиформные нейрофибромы, что позволило предположить, что для патогенеза нейрофибромы требуется снижение дозы гена Nf1 в дополнительных типах клеток8. Даже в этом случае плексиформные нейрофибромы в Krox20-Cre; Мыши Nf1flox/- не прогрессировали, чтобы стать MPNST, и поэтому лишь частично имитировали биологию своих человеческих собратьев. Патогенез MPNST действительно возникал, когда мутации Nf1 сочетались с мутациями в дополнительных генах-супрессорах опухолей, таких как Trp539 или Cdkn2a10, но MPNST в этих моделях GEM развивались de novo или из атипичных нейрофиброматозных новообразований с неопределенным биологическим потенциалом (ANNUBPs)11,12, а не из ранее существовавших доброкачественных плексиформных нейрофибром (см.13,14 за отличные обзоры этих моделей, а также других моделей, вводящих дополнительные мутации с потерей функции MPNST, связанные с потерей функции в генах, таких как Suz12 и Pten15).

Эти мышиные модели были неоценимы для установления роли таких генов, как NF1, TP53 и CDKN2A, в патогенезе NF1-ассоциированных новообразований периферической нервной системы, а также для доклинических испытаний потенциальных терапевтических агентов. Тем не менее, у нас все еще есть неполное понимание процесса, посредством которого плексиформные нейрофибромы прогрессируют, превращаясь в атипичные нейрофиброматозные новообразования с неопределенным биологическим потенциалом (ANNUBPs 16), а затем в MPNST. Недавно был достигнут некоторый прогресс в понимании этого процесса, в связи с недавним сообщением о том, что у мышей с делециями в Nf1 и Arf развиваются ANNUBP, которые прогрессируют, чтобы стать MPNST11. Тем не менее, мышиных моделей, основанных на мутации Nf1, которые полностью повторяют процесс прогрессирования плексиформной нейрофибромы-MPNST, наблюдаемого у людей, пока не существует. Кроме того, неясно, существует ли несколько различных путей, которые приводят к развитию MPNST. Учитывая это, вполне возможно, что описанные выше ГЭМ моделируют только подмножество нескольких различных путей, которые приводят к прогрессированию нейрофибромы-МПНСТ и патогенезу МПНСТ. Этот момент подчеркивается тем фактом, что MPNST также встречаются спорадически и что некоторые спорадические MPNST, по-видимому, не имеют мутаций NF1 17,18.

Несмотря на то, что последнее утверждение было оспорено недавним предположением Magollon-Lorenz et al. о том, что, по крайней мере, некоторые спорадические MPNST, лишенные мутаций NF1 , являются меланомами или другим типом саркомы19, мы недавно сообщили о спорадическом MPNST и клеточной линии, полученной из этой опухоли (клетки 2XSB), которая была NF1 дикого типа20. При характеристике родительской опухоли и клеточной линии 2XSB мы систематически исключали альтернативные диагностические возможности, включая меланому и множество других типов саркомы, которые обычно рассматриваются в дифференциальной диагностике спорадической злокачественной опухоли оболочки периферических нервов20. Кроме того, мы отмечаем, что Magollon-Lorenz et al. признали, что их результаты в трех спорадических клеточных линиях MPNST, которые они изучали, не могут быть обобщены, чтобы указать, что все опухоли, идентифицированные как спорадические MPNST, не являются MPNST.

Для построения модели GEM, в которой патогенез нейрофибромы и MPNST не обязательно зависел от специфических мутаций генов-супрессоров опухолей, мы создали трансгенных мышей, у которых гиперэкспрессия мощного митогенного нейрегулина-1 (NRG1) из шванновских клеток была обусловлена промотором шванновского клеточного миелинового белка ноль (P0) (мыши P 0-GGFβ3)21. Ранее мы показали, что нейрофибромы человека, MPNST и клеточные линии MPNST экспрессируют несколько изоформ NRG1 вместе с тирозинкиназами рецептора erbB (erbB2, erbB3 и erbB4), которые опосредуют передачу сигналов NRG1, и что эти рецепторы erbB конститутивно активированы22. Мы также продемонстрировали, что фармакологические ингибиторы киназ erbB мощно ингибируют пролиферацию MPNST22, выживаемость23 и миграцию24. В соответствии с нашими наблюдениями на людях, у мышей с P 0-GGFβ3 развиваются плексиформные нейрофибромы25, которые прогрессируют в MPNST с высокой частотой21,25. Мы показали, что P0-GGFβ3 MPNST, как и их человеческие аналоги, обычно развивают мутации Trp53 и Cdkn2a, а также множество других геномных аномалий, которые потенциально способствуют опухолегенезу25. MPNST, возникающие у мышей P 0-GGFβ3, не имеют инактивирующих мутаций Nf1. Однако, используя генетическую комплементацию, мы показали, что NRG1 способствует опухолегенезу у мышей P 0-GGFβ3 преимущественно через те же сигнальные каскады, которые изменяются при потере Nf1 26; Этот вывод основан на нашем выводе о том, что замена гиперэкспрессии NRG1 на потерю Nf1 в присутствии гаплонедостаточности Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- мышей) продуцирует животных, у которых MPNST развиваются de novo, как это наблюдается у цис-Nf1+/-; Trp53+/- мыши27.

Для получения этой и другой информации, демонстрирующей, что мыши с P 0-GGFβ3 точно моделируют процессы патогенеза нейрофибромы и прогрессирования нейрофибромы-MPNST, наблюдаемые у людей с НФ1, нами были разработаны специализированные методики обработки тканей этих животных, точной диагностики их опухолей, классификации МПНСТ, возникающих у этих мышей, установления и характеристики раннего пассажа P0-GGFβ3 и P0-GGFβ3; Культуры Trp53+/- MPNST и критическое сравнение патологии P0-GGFβ3 PNs и MPNST и P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST к их человеческим аналогам. Многие из этих методологий могут быть обобщены на другие модели неоплазии нервной системы GEM. Кроме того, некоторые из этих методологий более широко применимы к моделям GEM, в которых новообразования возникают в других органах. Следовательно, здесь мы приводим подробное описание этих методологий.

протокол

Процедуры, описанные здесь, были одобрены IACUC Медицинского университета Южной Каролины и выполнялись надлежащим образом обученным персоналом в соответствии с Руководством NIH по уходу и использованию лабораторных животных и рекомендациями MUSC по уходу за животными.

1. Определение пенетрантности и выживаемости опухоли у мышей P 0-GGFβ3 и идентификация опухолей у этих животных для дальнейшей характеристики

  1. Создать когорту мышей, которые будут оцениваться на предмет онкогенеза. Необходимое количество мышей зависит от пенетрантности фенотипа опухоли. Чтобы компенсировать такие потери, начните с когорты, которая на 10-15% превышает желаемое конечное количество животных.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы определили пенетрантность опухоли у мышей P 0-GGFβ3 эмпирически в исходной когорте из 50 мышей (шесть из которых были потеряны по причинам, не связанным с неоплазией (например, борьба))25.
  2. Оценивайте состояние здоровья животных три раза в неделю и записывайте показатели упитанности, включая вес, и изменения в поведении при каждом осмотре. Уничтожать мышей с опухолью или умирающими мышами (см. примечание ниже) с помощью эвтаназии углекислым газом с последующим вывихом шейки матки. Рекордный возраст на момент смерти в днях. Если опухоль видна снаружи, запишите размеры опухоли (длину, ширину и высоту).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы животным не разрешалось выходить за пределы максимально допустимого размера опухоли и/или гуманной конечной точки, одобренной IACUC.
  3. Используя возраст на момент смерти, постройте кривую выживаемости Каплана-Мейера, чтобы определить средний возраст на момент смерти и диапазон выживаемости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средний возраст мышей P 0-GGFβ3 на момент смерти составил 261,5 дня с диапазоном 74-533 дня; У 91% нашей когорты были множественные нейрофибромы и у 71% были МПНСТ21.
  4. Определите, присутствуют ли грубо видимые опухоли, и, если они есть, препарируют их в стерильных условиях, чтобы установить, связана ли опухоль с периферическим нервом, а затем иссекают опухоль. В P 0-GGFβ3 и P0-GGFβ3; У мышей Trp53+/- опухоли оболочки периферических нервов чаще всего обнаруживаются в тройничном и седалищном нервах. Даже если не видно видимых опухолей в связи с этими нервами, зафиксируйте и внедрите эти нервы, как описано ниже, чтобы их можно было исследовать на наличие микроопухолей. Микроопухоли обычно возникают в ганглиях, связанных с этими нервами.
  5. Грубо видимые опухоли разрезать на три части (рис. 1А). Используйте часть 1 для гистологии (парафиновые срезы, иммуногистохимия и гистохимия). Используйте деталь 2 для создания культур раннего пассажа. Моментально-заморозить деталь 3 (с использованием жидкого азота) для возможных будущих экспериментов (например, иммуноблоты, выделение РНК и ДНК).
  6. Зафиксируйте кусочек 1 в 4% параформальдегиде в фосфатно-солевом буфере (PBS) на ночь при 4 °C. Зафиксируйте оставшуюся часть тела животного, погрузив в 4% параформальдегид на ночь при 4 °C.

2. Парафиноизование грубо видимых опухолей и подготовка окрашенных гематоксилином и эозином срезов для первичной диагностической оценки

  1. Парафиновое внедрение грубо заметных опухолей
    1. После фиксации 1 части опухоли на ночь в 4% параформальдегиде промыть ткань, поместив ее в объем PBS, по крайней мере, в 10 раз превышающий объем ткани, на 15 мин; Используйте один и тот же объем для всех последующих полосканий. Повторите еще два 15-минутных полоскания PBS, используя свежий объем PBS для каждого полоскания.
    2. Перенесите опухоль кусочка 1 на 70% этанол. Выдержите ткань в 70% этаноле в течение 24 ч при 4 °C. При желании ткань можно хранить в этих условиях длительное время.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги с 2.1.1 по 2.1.7 предназначены для исследователей, у которых нет доступа к коммерческому оборудованию для обработки тканей. Если у исследователя есть доступ к тканевому процессору, ткань будет обработана с помощью дифференцированных этанолов и ксилолов в соответствии с запрограммированным протоколом прибора.
    3. Перенесите кусочек опухоли 1 на 80% этанол в течение 30 мин при комнатной температуре. Повторите инкубацию еще 30 мин в свежем объеме 80% этилового спирта.
    4. Перенесите кусочек опухоли 1 в 95% этанол на 75 мин при комнатной температуре. Повторите инкубацию еще дважды, каждый раз в течение дополнительных 75 мин в свежем объеме 95% этилового спирта.
    5. Переложите опухоль из кусочка 1 в 100% этанол и инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре. Повторите 60-минутную инкубацию еще дважды, каждый раз используя свежий объем 100% этанола.
    6. Опухоль 1 переносят в растворитель на основе d-лимонена и инкубируют 30-60 мин при комнатной температуре. Опухоль 1 переложить в свежий объем растворителя на основе d-лимонена и инкубировать еще 30-60 мин при комнатной температуре.
    7. Переложите опухоль 1 в растворитель на основе парафина/d-лимонена в соотношении 1:1 в течение 1 ч при 60 °С. Выбросьте растворитель на основе парафина/d-лимонена 1:1 и перенесите опухолевый кусочек 1 в парафин 60 °С и инкубируйте в течение 20 мин при 60 °С. Повторите инкубацию в свежем объеме парафина 60 °С еще раз в течение 20 мин. Инкубируйте опухоль 1 шт. в парафине в течение ночи при 60 оС.
    8. Налейте базовый слой парафина в стальную гистологическую форму и дайте ему застыть. Перенесите опухоль 1 на поверхность базового парафина и сразу после позиционирования покройте ткань парафином 60 oC и поместите тканевую кассету поверх расплавленного парафина и соприкасайтесь с ним. Перенесите форму на холодную сторону станции закладки и дайте ей затвердеть в течение 10-15 минут.
    9. Извлеките парафиновый блок с прикрепленной кассетой для ткани из формы. Используйте прилагаемую кассету для ткани, чтобы зажать блок в микротоме во время секционирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Парафиновый блок теперь можно хранить неограниченное время при комнатной температуре.
  2. Подготавливают окрашенные гематоксилином и эозином срезы грубо видимых опухолей.
    1. С помощью микротома вырезать срезы опухолевой ткани размером 4-5 мкм и закрепить их на положительно заряженных предметных стеклах.
    2. Для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) депарафинизируют срезы тканей путем инкубации предметных стекол в растворителе на основе d-лимонена в течение 10 мин при комнатной температуре. Инкубацию повторяют в свежем объеме растворителя на основе d-лимонена в течение 10 мин.
    3. Переложите предметные стекла в 100% этанол и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Переложите предметные стекла в свежий объем 100% этилового спирта и инкубируйте еще 5 минут при комнатной температуре.
    4. Переведите предметные стекла в 95% этиловый спирт и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре. Переложите предметные стекла в свежий объем 95% этилового спирта и инкубируйте еще 5 минут при комнатной температуре.
    5. Переведите предметные стекла в 70% этиловый спирт и инкубируйте 5 мин при комнатной температуре. Затем переложить в 50% этиловый спирт и инкубировать 5 мин при комнатной температуре.
    6. Переложите предметные стекла в дистиллированную воду и выдержите 5 минут при комнатной температуре.
    7. Окрасьте предметные стекла, погрузив их в гематоксилин на 5 минут при комнатной температуре. Промыть проточной водой из-под крана в течение 1-2 минут. Дифференциация путем погружения предметных стекол 2-5 раз в 0,5% соляной кислоты в 70% этаноле. Смойте на проточной водяной бане в течение 1-2 минут. Поместите предметные стекла в 95% этанол с 0,5% уксусной кислотой на 10 с.
    8. Окрасьте предметные стекла эозином-Y в течение 30 с при комнатной температуре, а затем перенесите предметные стекла в 100% этанол на 5 мин. Очистите образцы в растворителе на основе d-лимонена в течение 5 мин.
    9. Монтируйте покровные стекла с помощью монтажной среды на основе ксилола, пока предметное стекло еще влажно растворителем на основе d-лимонена. Дайте монтажному материалу застыть в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте монтажную среду на водной основе.
  3. Подготовка тканей без грубо видимых опухолей для выявления плексиформных нейрофибром и микро-МПНСТ. Закапывают ткани в парафин, подготавливают гистологические срезы и окрашивают эти срезы гематоксилином и эозином.
    1. Удалите внутренние органы и поместите репрезентативные части каждого органа в парафин, чтобы подготовить окрашенные H&E-срезы, которые будут исследованы на наличие микроскопических признаков опухолей (рис. 1B). Удалите голову, передние конечности, задние конечности и хвост (рисунок 1C). Для обследования спинного мозга и нервных корешков in situ на наличие опухолей нервных корешков проводят декальцинацию позвоночного столба и связанных с ним ребер и мягких тканей путем погружения в 0,3 М ЭДТА/4% параформальдеги (рН 8,0) в течение 48-72 ч при 4 оС; затем промойте образцы 1x PBS. В конце декальцинации убедитесь, что декальцинация завершена, попытавшись проколоть позвоночный столб иглой. Декальцинация проходит успешно, если игла легко проникает в кость, не хрустя.
    2. Разрежьте декальцинированный позвоночный столб и связанные с ним структуры на блоки, которые поместятся в тканевую кассету. Обезвоживание с помощью дифференцированного этанола с последующим использованием растворителя на основе d-лимонена, как описано в шагах 2.1.2-2.1.7. Вставьте парафин и подготовьте срезы размером 4-5 мкм, как описано в шагах 2.1.7-2.2.1. Выполните окрашивание H&E, как описано в шагах 2.2.2-2.2.9; Дайте монтажному материалу застыть в течение ночи.

3. Выявить потенциальные плексиформные нейрофибромы и выполнить специальные окрашивания для подтверждения диагноза

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы настоятельно рекомендуем привлекать опытного человека или ветеринарного патологоанатома к оценке H&E и специальных красителей срезов опухоли GEM.

  1. Изучите окрашенные H&E-стекла, подготовленные, как описано выше, с помощью светлопольной микроскопии для выявления потенциальных опухолей оболочки периферических нервов. Поскольку нейрофибромы и МПНСТ возникают в периферических нервах, важно определить, связаны ли микроскопические опухоли с периферическим нервом. Идентификация блокад с потенциальными опухолями оболочки периферических нервов, чтобы можно было выполнить иммуноокрашивание и другие специальные окрашивания для подтверждения или опровержения диагноза.
  2. Дифференцировать потенциальные ПН от МПНСТ/других новообразований высокой степени злокачественности на основе гистологических признаков, наблюдаемых при исследовании светлопольных срезов, окрашенных H&E. ПП человека представляют собой слабо гиперклеточные новообразования, преимущественно состоящие из клеток с удлиненными, часто волнистыми ядрами. Во многих областях клетки неплотно упакованы и могут быть разделены миксоидным внеклеточным материалом; ПН у мышей P 0-GGFβ3 имеют сходный внешний вид. Митозы, как правило, отсутствуют; если это так, и опухоль умеренно или сильно гиперклеточная, опухоль является МПНСТ или другим типом высокодифференцированного новообразования (см. ниже).
  3. ПН состоят из смеси опухолевых шванновских клеток и других неопухолевых типов клеток, таких как тучные клетки. Для подтверждения идентичности ПП проводят иммуноокрашивание на шванновские клеточные маркеры S100β и Sox10 и маркер тучных клеток CD117 (c-Kit) на срезах блоков, содержащих потенциальные ПН, выявленные при обследовании H&E (альтернативные варианты окрашивания тучными клетками см. раздел 3.4). Выполните иммуноокрашивание Ki67 для подтверждения низкой скорости пролиферации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В таблице 1 перечислены антигенные маркеры, используемые для рутинной идентификации плексиформных нейрофибром GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), диагностики MPNST и для полной оценки других типов клеток, присутствующих в нейрофибромах; мы окрашиваем эти последние антигены только при первом описании новой модели GEM. Обратитесь к техническому описанию производителя антител для получения информации о рекомендуемых условиях. Обратите внимание, рекомендует ли вкладыш производителя антитела извлечение антигена; Не все антигены требуют извлечения для обнаружения.
    1. Из отобранных парафиновых блоков подготовьте срезы 4-5 мкм и закрепите их на положительно заряженных предметных стеклах. Депарафинизируйте секции, как описано в шагах 2.2.2-2.2.6.
    2. Промойте участки 1x PBS в течение 3-5 минут.
    3. Если производитель антител рекомендует забор антигена, приготовьте цитратный буфер. Соедините 9 мл раствора лимонной кислоты (10,5 г лимонной кислоты на 500 мл дистиллированной воды) и 41 мл раствора цитрата натрия (14,7 г цитрата натрия на 500 мл дистиллированной воды).
    4. Выполните извлечение антигена, поместив предметные стекла в цитратный буфер на 20 минут в нагретую рисоварку.
    5. Перенесите предметные стекла в 3% перекись водорода/1x PBS на 10 мин для устранения активности пероксидазы в тканях.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый раз делайте этот раствор свежим и не используйте стоковый раствор перекиси водорода, если он старше 3-4 месяцев.
    6. Промойте участки в 1x PBS.
    7. Блокируйте секции с помощью блокирующего буфера (2% BSA, 0,1% Triton X-100 в 1x PBS) в течение 1 ч. Кратковременно промойте слайды в 1x PBS.
    8. Добавьте первичные антитела в срезы тканей. Первичные антитела готовят в разбавленном блокирующем буфере. Инкубируют предметные стекла в течение 2 ч при 37 °С или в течение ночи при 4 °С.
    9. Промыть предметные стекла в 1 PBS в течение 5 мин. Повторить 3 раза.
    10. Инкубируют ткань с биотинилированными вторичными антителами в течение 1-2 ч.
    11. Приготовьте раствор диаминобензидина (DAB) в соответствии с протоколом производителя и погрузите предметные стекла в раствор на 2-10 мин. Промойте горки в воде в течение 5 минут.
    12. Контрокрасьте участки, погрузив их в гематоксилин на 10-15 мин. Подвергайте воздействию проточной воды, пока она не станет прозрачной. Быстро окуните предметные стекла в спирт и промойте их в воде.
    13. Обезвоживайте предметные стекла в сортированных этанолах путем быстрого погружения предметных стекол, 4-5 раз на раствор, в 70% этаноле, 95% этаноле, а затем в 100% этаноле. Инкубируйте предметные стекла в растворителе на основе d-лимонена в течение 2 мин. Инкубируют предметные стекла во второй партии растворителя на основе d-лимонена в течение 2 мин.
    14. Крепление направляющих с помощью монтажного носителя на основе ксилола.
    15. Исследуйте предметные стекла с помощью светлопольной микроскопии.
    16. Для иммунофлюоресценции опустите шаги 3.3.10-3.3.15. Вместо этого инкубируют ткань с видоспецифичными вторичными антителами, разведенными в блокирующем буфере, в течение 1-2 ч.
    17. Промывайте предметные стекла в 1x PBS в течение 5 мин. Повторите 3 раза.
    18. Монтируйте слайды с помощью 1x PBS/глицерина.
    19. Исследуйте предметные стекла с помощью флуоресцентной микроскопии.
  4. Альтернативный метод окрашивания тучных клеток: окрашивание толуидиновым синим
    1. Приготовьте исходный раствор толуидина синего, растворив 1 г толуидина синего О в 100 мл 70% этилового спирта.
    2. Приготовьте 1% раствор хлорида натрия (NaCl), растворив 0,5 г NaCl в 50 мл дистиллированной воды. Перемешать до полного растворения. Отрегулируйте рН примерно до 2,0-2,5 с помощью HCl.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот раствор NaCl необходимо делать свежим каждый раз, когда выполняется окрашивание.
    3. Приготовьте рабочий раствор толуидина синего, добавив 5 мл исходного раствора толуидина синего к 45 мл 1% раствора NaCl. Хорошо перемешайте и убедитесь, что pH составляет примерно 2,3.
      ПРИМЕЧАНИЕ: pH выше 2,5 приведет к окрашиванию с меньшей метахромазией. Делайте этот раствор свежим каждый раз, когда выполняется окрашивание.
    4. Депарафинизируйте секции размером 4-5 мкм, установленные на положительно заряженных предметных стеклах, как описано в шагах 2.2.2-2.2.6. Депарафинизированные срезы промыть в проточной воде в течение 2 минут.
    5. Окрашивают срезы в рабочем растворе толуидинового синего в течение 2-3 мин. Промыть в дистиллированной воде 2 мин.
    6. Обезвоживайте срезы, погружая 10-кратное погружение в 95% этанол. Окуните горки в 100% этанол 10x. Окуните горки в свежий 100% этанол еще 10 раз.
    7. Инкубируйте предметные стекла в растворителе на основе d-лимонена в течение 2 мин. Инкубируют предметные стекла во второй партии растворителя на основе d-лимонена в течение 2 мин.
    8. Монтаж покровных стекол осуществляется с помощью монтажной среды на основе ксилола, пока предметное стекло еще влажно с растворителем на основе d-лимонена.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте монтажную среду на водной основе.
    9. Исследуйте предметные стекла с помощью светлопольной микроскопии. Идентификацию тучных клеток можно по наличию темно-фиолетовых гранул в их цитоплазме. Другие типы клеток окрашены в светло-голубой цвет.

4. Специальные красители для диагностики МПНСТ и исключения альтернативных диагнозов

  1. Гистологический вид МПНСТ человека очень вариабелен, и несколько различных типов опухолей имеют внешний вид, сходный с МПНСТ28. Поскольку MPNST происходят из линии шванновских клеток, определите, возникает ли опухоль из периферического нерва или в пределах существующей доброкачественной ПН, путем грубого исследования или светлопольного микроскопического исследования срезов, окрашенных H&E. Несмотря на то, что МПНСТ иногда обнаруживаются не в связи с периферическим нервом или ПП (обычно из-за непреднамеренного отделения от нерва во время диссекции, разрушения ранее существовавшей ПП из-за чрезмерного роста МПНСТ или из-за метастатического поражения), ищите связь опухоли с нервом или ПП, поскольку диагноз менее вероятен, если опухоль не связана с нервом или ПП.
  2. Подготовьте секции размером 4-5 мкм из парафиновых блоков, содержащих потенциальные MPNST, и установите их на положительно заряженные предметные стекла, как описано в шаге 2.2.1. Депарафинизируйте секции, как описано в шагах 2.2.2-2.2.6.
  3. Проведите иммуногистохимическое исследование с помощью панели антител, указанной в таблице 2 , как описано в шагах 3.3.1-3.3.15.
  4. Исследуйте иммуноокрашивание с помощью светлопольной микроскопии. Поскольку MPNST демонстрируют шваннианскую дифференцировку, ищите однородную или неоднородную иммунореактивность для S100β, нестина и Sox10. Если опухоли не являются положительными по этим трем маркерам, обратитесь к таблице 2 для установления диагноза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: MPNST человека и мыши могут демонстрировать дивергентную дифференциацию. Например, некоторые МПНСТ человека демонстрируют фокальную рабдомиобластическую дифференцировку (эти варианты известны как злокачественные опухоли Тритона); Хотя эти новообразования будут окрашиваться по шваннианским маркерам, они также экспрессируют мышечные маркеры, такие как десмин, MyoD1 и миогенин. Иммунореактивность к этим последним маркерам не должна отпугивать исследователей от постановки диагноза опухоли как МПНСТ. Несмотря на то, что было установлено несколько мышиных моделей, условно экспрессирующих ген слияния SS18-SSX, для моделирования патогенеза синовиальной саркомы29, насколько нам известно, модели синовиальной саркомы, которые спонтанно генерируют эквивалентный транскрипт слияния, неизвестны. Следовательно, мы не ищем транскрипты слияния SS18-SSX в опухолях GEM, а полагаемся на иммуногистохимические профили.

5. Классификация МПНСТ

  1. Определите, присутствует ли некроз опухоли, отличительный признак МПНСТ IV степени по классификации ВОЗ. Для MPNST IV степени следует обратить внимание на выраженную гиперцеллюлярность, быструю митотическую активность (≥4 митозов на 10 полей высокой мощности (40x)) и цитологическую атипию.
    1. Если некроз отсутствует, оцените опухоль, чтобы определить, присутствует ли гиперцеллюлярность, быстрая митотическая активность и цитологическая атипия. Если все эти признаки присутствуют при отсутствии некроза, опухоль классифицируется как МПНСТ III степени по классификации ВОЗ.
    2. Опухоли II степени по классификации ВОЗ характеризуются повышенной клеточностью, но в меньшей степени, чем опухоли III и IV степени по классификации ВОЗ. Ядра опухолевых клеток при МПНСТ II степени по классификации ВОЗ демонстрируют увеличение размеров (более чем в 3 раза больше размера ядер опухолевых клеток при нейрофибромах) и гиперхромазию. Повышенная митотическая активность (<4 митозов на 10 полей высокой мощности) связана с опухолями II степени тяжести, но не является их обязательным требованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку опухоли более высокой степени злокачественности, как правило, прогрессируют из опухолей более низкой степени злокачественности, низкодифференцированные и высокодифференцированные области могут присутствовать в одном и том же MPNST. В этом случае степень опухоли определяется по наличию области с самой высокой степенью злокачественности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среди патологоанатомов существуют разногласия относительно того, является ли описанная выше система классификации ВОЗ прогностической для исходов пациентов, и некоторые из этих патологоанатомов предпочитают вместо этого просто классифицировать MPNST как низкодифференцированные или высокодифференцированные. В соответствии с этой схемой, высокодифференцированные MPNST имеют выраженную цитологическую атипию, оживленную митотическую активность (>5 митозов на 10 полей высокой мощности) и выраженную гиперцеллюлярность с некрозом или без него. Низкодифференцированные МПНСТ не обладают некрозом, но демонстрируют митотическую активность, цитологическую атипию и клеточность, которые являются промежуточными между МПНСТ высокой степени злокачественности и атипичным нейрофиброматозным новообразованием с неизвестным биологическим потенциалом (ANNUBP). Мы предпочитаем систему, описанную выше, потому что различение между ANNUBP и MPNST низкого качества может быть сложной задачей для исследователей, которые не имеют большого опыта работы с этими сущностями.

6. Подготовка культур клеток раннего пассажа P 0-GGFβ3 MPNST

  1. Культивирование опухолевых клеток раннего пассажа P 0-GGFβ3 из свежего куска опухоли 2 (шаг 1.5, рис. 1A). С этого момента поддерживайте стерильные условия.
    1. Диссоциируют опухоль, разрезая ее на мелкие (2-4 мм) кусочки и измельчая в DMEM10 (минимальная эссенциальная среда Dulbecco), содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мкмоль/л форсколин и 10 нмоль/л нейрегулина 1β (NRG1β) в 100-миллиметровых чашках для культивирования тканей.
    2. Дайте клеткам вырасти из измельченных фрагментов тканей при 37 °C в 5%CO2 до слияния пластин. Меняйте носитель каждые 3-4 дня.
    3. Расщепить клеточную культуру. Удалите фильтрующий материал из 100-миллиметровой чашки и промойте ячейки с помощью PBS; Достаньте и выбросьте измельченную ткань. Удалите PBS и добавьте 1 мл 0,25% трипсина в течение 2-5 минут при комнатной температуре. Чтобы способствовать отслоению клеток, осторожно постучите по пластине и проверьте наличие отслоения с помощью светового микроскопа; При необходимости продлевайте инкубацию трипсина.
    4. Нейтрализуйте трипсин, добавив 2 мл DMEM10. Переложите клеточную суспензию в центрифужную пробирку и грануляторы при 500 × г в течение 5 мин. Удалите фильтрующий материал и добавьте 5 мл свежего DMEM10 в гранулу.
    5. Распределите клеточную суспензию по двумя-четырем чашкам диаметром 100 мм, содержащим DMEM10. Не разделяйте клетки более чем на пять проходов (шаги 6.1.3 и 6.1.4) и поддерживайте их в DMEM без форсколина и NRG1β. Не забудьте заморозить ячейки в проходе 2 для дальнейшего использования.

7. Проверка идентичности клеток раннего пассажа МПНСТ методом иммуноцитохимии

  1. Поместите стерильные стеклянные покровные стекла 18 мм #1,5 в лунки 6-луночных стерильных чашек для культивирования тканей.
    1. Раствор поли-L-лизина/ламинина помещают в лунки в объеме, достаточном для покрытия покровного стекла. Закройте пластину полиэтиленовой пленкой, чтобы свести к минимуму испарение. Выдерживают при температуре 4 °C в течение ночи. На следующее утро промойте покровные стекла 3 раза стерильным ПБС.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы попытались нанести клетки MPNST с ранним пассажем на непокрытые покровные стекла и обнаружили, что клетки плохо прилипают к поли-L-лизину/ламининовому покрытию.
    2. Нанесите 10 000 клеток на покровное стекло, осторожно добавив 2 мл клеточной суспензии в питательной среде в каждую лунку, содержащую покровное стекло. Инкубируйте планшеты в течение ночи при 37 °C с 5%CO2 в инкубаторе для тканевых культур.
    3. На следующее утро промойте покровные стекла в течение 2 x 5 минут PBS.
    4. Зафиксируйте клетки с 4% параформальдегидом в PBS в течение 18 мин при комнатной температуре.
    5. Промывайте покровные стекла 3 x 5 мин с помощью PBS. При желании запечатайте пластину полиэтиленовой пленкой и храните ее при температуре 4 °C.
    6. Приготовьте свежий 50 мМ NH4Cl в PBS. Гасят альдегиды инкубацией покровных стекол в 50 мМ NH4Cl в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре.
    7. Пермеабилизацию клеток путем инкубации покровных стекол в 0,3% Triton X-100 в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Постирайте покровные стекла в течение 3 x 5 минут с помощью PBS.
    8. Блокируют неспецифическое связывание путем инкубации покровных стекол в блокирующем буфере (1x PBS, содержащий 1% бычьего сывороточного альбумина, 0,2% обезжиренного сухого молока и 0,3% Triton X-100) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    9. Удалите блокирующий буфер и добавьте первичные антитела, распознающие маркеры MPNST, присутствующие в родительской опухоли (обычно S100β, Nestin и Sox10), разбавленные до заданного оптимального разведения в блокирующем буфере. Оберните планшет полиэтиленовой пленкой и выдержите при температуре 4 °C в течение ночи в увлажненной камере.
    10. Промывайте 3 x 5 мин PBS для удаления несвязанных первичных антител. Добавляют флуоресцентно меченные вторичные антитела, разведенные в блокирующем буфере, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре. Беречь от света.
    11. Стирайте 3 x 5 мин с помощью PBS. Инкубируют покровные стекла в 1-5 мкг красителя Hoechst в течение 10 мин. Продолжайте защищать от света.
    12. Промыть покровные листы с помощью PBS в течение 5 минут. Монтируйте слайды с помощью 1:1 1x PBS/глицерина. Изображение с помощью флуоресцентного микроскопа.

8. Аллотрансплантат опухолевых клеток раннего пассажа для демонстрации опухолегенности

  1. Выращивание клеток P 0-GGFβ3 MPNST с ранним пассажем в DMEM10 до 80% слияния. Промойте клетки один раз сбалансированным солевым раствором Хэнкса комнатной температуры (HBSS). Обрабатывают клетки в течение 30 с - 1 мин раствором для неферментативной диссоциации клеток, чтобы удалить их из субстрата. Добавьте 5 мл DMEM10 на 1 мл неферментативного реагента для диссоциации клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная диссоциация может занять гораздо больше времени, до 10-20 минут. Пожалуйста, обратитесь к протоколу производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не выращивайте клетки до слияния, так как это снизит эффективность трансплантата.
    1. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Отжим клетки при 5 × г в течение 5 мин и ресуспендировать их в концентрации 1-2 × 106 клеток на 100 мкл DMEM10. Держите клетки на льду до тех пор, пока они не будут готовы к инъекции.
    2. Обезболить мышей NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) в индукционной камере испарителя изофлурана. Положите животное на живот и простерилизуйте место инъекции 70% этанолом. Дайте этому месту высохнуть на воздухе перед инъекцией. Перед инъекцией дайте клеткам нагреться до комнатной температуры.
    3. Вводят 1-2 x 106 клеток подкожно в правый бок. Поместите мышь одну в клетку без подстилки и дайте ей восстановиться. Следите за тем, чтобы на грелке находилась только часть клетки, чтобы не допустить переохлаждения. Это обеспечивает зону, в которую мышь может переместиться в случае перегрева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мы прививаем минимум трех мышей с каждой культурой раннего пассажа, так как некоторые трансплантаты могут не прижиться.
    4. Дайте привою порасти в течение 15-60 дней; Оценивайте состояние здоровья животных 3 раза в неделю и записывайте показатели упитанности, включая вес, и изменения в поведении при каждом осмотре. Мышей, достигших максимально допустимого размера трансплантата, или умирающих мышей с помощью эвтаназии углекислым газом с последующим вывихом шейки матки. Рекордный возраст на момент смерти в днях. По мере того, как опухоли становятся видимыми снаружи, записывайте размеры опухоли (длину, ширину и высоту).
      ПРИМЕЧАНИЕ: По нашему опыту, различные культуры раннего пассажа MPNST прививаются с разной эффективностью и различаются по времени, необходимому для роста прививки. Животным не должно быть позволено выходить за пределы максимально допустимого размера опухоли и/или гуманной конечной точки, одобренной IACUC.
  2. Соберите опухоль, зафиксируйте ее в 4% параформальдегиде, поместите в парафин и выполните окрашивание H&E, как описано в разделах 2.1-2.2.9, чтобы убедиться, что аллотрансплантат является опухолью, а не реактивной тканью. При необходимости проводят иммуноокраску трансплантата на маркеры, которые присутствовали в родительской опухоли.

Результаты

На рисунке 2 показаны примеры ярко выраженных новообразований, возникающих у мышей P 0-GGFβ3. Опухоли, которые легко идентифицировать невооруженным глазом, могут быть видны как образования, расширяющие области тела, как показано на рисунке 2А (стрелка)...

Обсуждение

Представленные здесь гистологические и биохимические методы обеспечивают основу для диагностики и характеристики GEM-моделей нейрофибромы и патогенеза MPNST. На протяжении многих лет мы обнаружили, что эти методики весьма полезны для оценки патологии опухолей оболочки периферических н?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института неврологических заболеваний и инсульта (R01 NS048353 и R01 NS109655 S.L.C.; R01 NS109655-03S1 в D.P.J.), Национальный институт рака (R01 CA122804 в S.L.C.) и Министерство обороны (X81XWH-09-1-0086 и W81XWH-12-1-0164 в S.L.C.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

Ссылки

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620 (2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834 (2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096 (2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690 (2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al., Louis, D. N., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. , 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588 (2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE207

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены