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Resumo

Desenvolvemos uma metodologia para avaliar se neoplasias do sistema nervoso em camundongos geneticamente modificados recapitulam com precisão a patologia de suas contrapartes humanas. Aqui, aplicamos essas técnicas histológicas, critérios patológicos definidos e metodologias de cultura para neurofibromas e tumores malignos da bainha de nervos periféricos que surgem no modelo de camundongos P 0-GGFβ3.

Resumo

Pacientes com a síndrome de suscetibilidade tumoral autossômica dominante neurofibromatose tipo 1 (NF1) comumente desenvolvem neurofibromas plexiformes (NPs) que posteriormente se transformam em tumores malignos altamente agressivos da bainha do nervo periférico (MPNSTs). A compreensão do processo pelo qual um PN se transforma em um MPNST seria facilitada pela disponibilidade de modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) que replicam com precisão a progressão PN-MPNST observada em humanos com NF1. Infelizmente, os modelos de GEM com ablação de Nf1 não recapitulam totalmente esse processo. Isso nos levou a desenvolver camundongos P 0-GGFβ3, um modelo de GEM no qual a superexpressão da neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) em células de Schwann resulta no desenvolvimento de PNs que progridem para se tornarem MPNSTs com alta frequência. No entanto, para determinar se a tumorigênese e a progressão neoplásica em camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos observados em pacientes com NF1, tivemos que primeiro provar que a patologia dos tumores da bainha do nervo periférico P0-GGFβ3 recapitula a patologia de seus homólogos humanos.

Aqui, descrevemos as metodologias especializadas usadas para diagnosticar e graduar com precisão neoplasias do sistema nervoso periférico em modelos de GEM, usando P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Ratos Trp53+/- como exemplo. Descrevemos os métodos histológicos, imuno-histoquímicos e histoquímicos utilizados para diagnosticar NPs e MPNSTs, como distinguir essas neoplasias de outros tipos de tumores que mimetizam sua patologia e como graduar essas neoplasias. Discutimos o estabelecimento de culturas de passagem precoce a partir de MPNSTs GEM, como caracterizar essas culturas por imunocitoquímica e como verificar sua tumorigenicidade através do estabelecimento de aloenxertos. Coletivamente, essas técnicas caracterizam a patologia de NPs e MPNSTs que surgem em modelos de GEM e comparam criticamente a patologia desses tumores murinos com seus homólogos humanos.

Introdução

Nas últimas três décadas, vários laboratórios tentaram criar modelos de camundongos de cânceres humanos introduzindo mutações associadas ao câncer humano no genoma de camundongos ou superexpressando um produto genético que é superexpresso em cânceres humanos. Os modelos de camundongos geneticamente modificados (GEM) resultantes podem ser usados para uma variedade de propósitos, como estabelecer que a modificação genômica recém-introduzida inicia a tumorigênese, identificar outras alterações genéticas ou epigenéticas que ocorrem subsequentemente que contribuem para a progressão do tumor e definir as principais vias de sinalização que impulsionam a iniciação e a progressão do tumor. Ao contrário dos modelos de xenoenxerto ortotópico, que dependem do uso de camundongos imunodeficientes, os modelos de câncer GEM têm um sistema imunológico totalmente funcional e, portanto, modelam com mais precisão as respostas aos agentes terapêuticos candidatos. No entanto, ao usar modelos de câncer de GEM para fins como esses, é essencial que os investigadores confirmem que as observações feitas com neoplasias de GEM são relevantes para seus homólogos humanos. Essa validação deve incluir uma avaliação completa da patologia das neoplasias do GEM e determinar se as características patológicas das neoplasias do GEM recapitulam a patologia do tipo de tumor humano correspondente.

A síndrome de suscetibilidade tumoral neurofibromatose tipo 1 (NF1) é a doença genética mais comum que acomete o sistema nervoso humano, ocorrendo em aproximadamente 1 em cada 3.000-3.500 nascidos vivos1,2,3. Indivíduos acometidos por NF1 desenvolvem múltiplos tumores benignos da bainha dos nervos periféricos, conhecidos como neurofibromas, na pele (neurofibromas dérmicos) e em grandes nervos e plexos nervosos (neurofibromas plexiformes). Enquanto os neurofibromas dérmicos e plexiformes pioram a qualidade de vida do paciente por produzirem prejuízo físico, comportamental e/ou social, os neurofibromas plexiformes (NPs) são particularmente perigosos 4,5. Isso ocorre porque os RNPT frequentemente se transformam em tumores malignos da bainha do nervo periférico (MPNSTs), que são neoplasias agressivas de células fusiformes com sobrevida excepcionalmentebaixa1,2. Em grande parte, essa baixa sobrevida deve-se à ineficácia dos regimes radioterápicos e quimioterápicos atualmente utilizados para o tratamento dos MPNSTs. No entanto, o desenvolvimento de novas terapias mais eficazes tem sido um desafio. Isso porque, apesar da frequência com que as MPNSTs ocorrem em pacientes com NF1, ainda são neoplasias raras. Como resultado, é muito difícil obter um grande número de tumores humanos para estudo; também é um desafio recrutar pacientes suficientes com MPNSTs para ensaios clínicos. Para superar essas limitações, vários modelos de GEM foram gerados com o objetivo de obter mais informações sobre as anormalidades que conduzem a patogênese do neurofibroma e a progressão do PN-MPNST e facilitar ensaios pré-clínicos com candidatos a agentes terapêuticos.

Pacientes com NF1 apresentam mutações inativadoras em uma cópia do gene NF1. A patogênese do neurofibroma é desencadeada quando uma mutação inativadora no gene NF1 funcional remanescente ocorre em uma célula da linhagem celular de Schwann. Surpreendentemente, no entanto, quando camundongos foram gerados com mutações Nf1 inativadoras da linhagem germinativa, eles não desenvolveram neurofibromas 6,7. A demonstração subsequente de que camundongos com células de Schwann Nf1-nulas e haploinsuficiência Nf1 em todos os outros tipos celulares (Krox20-Cre;Nf1flox/- camundongos) desenvolveram neurofibromas plexiformes sugerindo que a dosagem reduzida do gene Nf1 em tipos celulares adicionais era necessária para a patogênese do neurofibroma8. Mesmo assim, os neurofibromas plexiformes em Krox20-Cre; Nf1flox/- camundongos não progrediram para se tornarem MPNSTs e, portanto, apenas parcialmente imitaram a biologia de seus homólogos humanos. A patogênese do MPNST ocorreu quando mutações Nf1 foram associadas a mutações em genes supressores de tumor adicionais, como Trp539 ou Cdkn2a10, mas os MPNSTs nesses modelos GEM se desenvolveram de novo ou a partir de neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incerto (ANNUBPs)11,12, em vez de neurofibromas plexiformes benignos preexistentes (ver13,14 para excelentes revisões desses modelos, bem como de outros modelos introduzindo mutações adicionais associadas à perda de função do MPNST em genes como Suz12 e Pten15).

Esses modelos em camundongos têm sido inestimáveis para estabelecer o papel que genes como NF1, TP53 e CDKN2A desempenham na patogênese de neoplasias do sistema nervoso periférico associadas à NF1 e para ensaios pré-clínicos testando candidatos a agentes terapêuticos. No entanto, ainda temos uma compreensão incompleta do processo pelo qual os neurofibromas plexiformes progridem para se tornarem neoplasias neurofibromatosas atípicas de potencial biológico incerto (ANNUBPs16) e, em seguida, MPNSTs. Recentemente, alguns progressos foram feitos na compreensão desse processo com o recente relatório de que camundongos com exclusões em Nf1 e Arf desenvolvem ANNUBPs que progridem para se tornarem MPNSTs11. No entanto, modelos de camundongos baseados em mutação Nf1 que recapitulam completamente o processo de progressão plexiforme do neurofibroma-MPNST observado em humanos ainda não existem. Além disso, não está claro se existem múltiplas vias distintas que levam ao desenvolvimento de MPNSTs. Diante disso, é possível que os GEMs descritos acima modelem apenas um subconjunto de várias vias diferentes que levam à progressão do neurofibroma-MPNST e patogênese do MPNST. Esse ponto é enfatizado pelo fato de que as MPNSTs também ocorrem esporadicamente e que algumas MPNSTs esporádicas aparentemente não apresentam mutações naNF117,18.

Embora este último ponto tenha sido contestado pela recente sugestão de Magollon-Lorenz e col. de que pelo menos alguns MPNSTs esporádicos sem mutações na NF1 são melanomas ou um tipo diferente desarcoma19, recentemente relatamos um MPNST esporádico e uma linhagem celular derivada desse tumor (células 2XSB) que era NF1 selvagem-tipo20. Durante a caracterização do tumor de origem e da linhagem celular 2XSB, sistematicamente descartamos possibilidades diagnósticas alternativas, incluindo melanoma e os múltiplos outros tipos de sarcoma que são rotineiramente considerados no diagnóstico diferencial de um tumor esporádico maligno de bainha de nervoperiférico20. Além disso, observamos que Magollon-Lorenz e col. reconheceram que seus achados nas três linhagens esporádicas de MPNST que estudaram não puderam ser generalizados para indicar que todos os tumores identificados como MPNSTs esporádicos não são MPNSTs.

Para construir um modelo de GEM no qual o neurofibroma e a patogênese do MPNST não fossem necessariamente dependentes de mutações específicas no gene supressor de tumor, geramos camundongos transgênicos nos quais a superexpressão da potente neuregulina-1 mitógena de células de Schwann (NRG1) foi impulsionada pelo promotor zero (P0) da proteína mielina específica da célula de Schwann (camundongos P 0-GGFβ3)21. Demonstramos anteriormente que neurofibromas humanos, MPNSTs e linhagens celulares MPNST expressam várias isoformas de NRG1 juntamente com as tirosina quinases do receptor erbB (erbB2, erbB3 e erbB4) que medeiam a sinalização NRG1 e que esses receptores erbB são constitutivamente ativados22. Também demonstramos que os inibidores farmacológicos das quinases erbB inibem potentemente a proliferação do MPNST22, a sobrevivência23 e a migração24. De acordo com nossas observações em humanos, camundongos P 0-GGFβ3 desenvolvem neurofibromas plexiformes25 que progridem para se tornarem MPNSTs em alta frequência21,25. Demonstramos que MPNSTs P 0-GGFβ3, assim como seus homólogos humanos, comumente desenvolvem mutações de Trp53 e Cdkn2a, bem como inúmeras outras anormalidades genômicas que potencialmente contribuem para a tumorigênese25. MPNSTs que surgem em camundongos P 0-GGFβ3 não apresentam mutações Nf1 inativadoras. Entretanto, utilizando complementação genética, mostramos que NRG1 promove tumorigênese em camundongos P 0-GGFβ3 predominantemente através das mesmas cascatas de sinalização que são alteradas pela perda de Nf1 26; esta conclusão é baseada em nosso achado de que a substituição da superexpressão de NRG1 pela perda de Nf1 na presença de haploinsuficiência de Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- camundongos) produz animais nos quais MPNSTs se desenvolvem de novo, como é visto em cis-Nf1+/-; Ratos Trp53+/- 27.

Para obter essas e outras informações que demonstrem que camundongos P 0-GGFβ3 modelam com precisão os processos de patogênese do neurofibroma e progressão do neurofibroma-MPNST observados em humanos com NF1, desenvolvemos metodologias especializadas para o processamento de tecidos desses animais, diagnosticando com precisão seus tumores, classificando os MPNSTs surgidos nesses camundongos, estabelecendo e caracterizando P0-GGFβ3 e P0-GGFβ3 de passagem precoce; Culturas de Trp53+/- MPNST e comparação crítica da patologia de P 0-GGFβ3 PNs e MPNSTs e P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNSTs ao de seus homólogos humanos. Muitas dessas metodologias são generalizáveis para outros modelos de GEM de neoplasia do sistema nervoso. Além disso, várias dessas metodologias são mais amplamente aplicáveis a modelos de GEM, nos quais neoplasias surgem em outros sítios orgânicos. Consequentemente, apresentamos aqui uma descrição detalhada dessas metodologias.

Protocolo

Os procedimentos aqui descritos foram aprovados pela IACUC da Medical University of South Carolina e foram realizados por pessoal devidamente treinado, de acordo com o NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals e as diretrizes institucionais de cuidados com animais do MUSC.

1. Determinação da penetrância e sobrevivência tumoral em camundongos P 0-GGFβ3 e identificação de tumores nestes animais para posterior caracterização

  1. Gerar a coorte de camundongos que será avaliada quanto à tumorigênese. O número de camundongos necessários depende da penetrância do fenótipo tumoral. Para compensar perdas como essas, comece com uma coorte que seja 10-15% maior do que o número final desejado de animais.
    NOTA: Determinamos a penetrância tumoral em camundongos P 0-GGFβ3 empiricamente em uma coorte inicial de 50 camundongos (seis dos quais foram perdidos por razões não relacionadas à neoplasia (por exemplo, luta))25.
  2. Avaliar a saúde dos animais três vezes por semana e registrar os escores de condição corporal, incluindo peso, e mudanças de comportamento em cada exame. Terminar os ratinhos portadores de tumor ou moribundos (ver nota abaixo) utilizando eutanásia com dióxido de carbono seguida de luxação cervical. Registre a idade ao óbito em dias. Se os tumores forem visíveis externamente, registre as dimensões do tumor (comprimento, largura e altura).
    NOTA: É essencial que os animais não sejam autorizados a ultrapassar o tamanho máximo permitido do tumor e/ou o desfecho humano aprovado pela IACUC.
  3. Usando a idade ao óbito, estabeleça uma curva de sobrevida de Kaplan-Meier para determinar a idade média ao óbito e a amplitude de sobrevida.
    NOTA: Camundongos P 0-GGFβ3 tiveram uma idade média ao morrer de 261,5 dias, com uma variação de 74-533 dias; 91% de nossa coorte tinha neurofibromas múltiplos e 71% tinham MPNSTs21.
  4. Determinar se tumores grosseiramente visíveis estão presentes e, se estiverem, dissecá-los em condições estéreis para estabelecer se o tumor está associado a um nervo periférico e, em seguida, excisar o tumor. Em P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Camundongos Trp53+/- e tumores da bainha de nervos periféricos são mais comumente encontrados nos nervos trigêmeo e ciático. Mesmo que tumores grosseiramente visíveis não sejam vistos em associação com esses nervos, fixe e incorpore esses nervos conforme descrito abaixo para que possam ser examinados quanto à presença de microtumores. Microtumores tipicamente ocorrem dentro dos gânglios associados a esses nervos.
  5. Cortar os tumores grosseiramente visíveis em três pedaços (Figura 1A). Use a peça 1 para histologia (cortes em parafina, imuno-histoquímica e histoquímica). Use a peça 2 para estabelecer culturas de passagem precoce. Snap-freeze peça 3 (usando nitrogênio líquido) para possíveis experimentos futuros (por exemplo, immunoblots, isolamento de RNA e DNA).
  6. Fixar a peça 1 em paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante a noite a 4 oC. Fixar o restante do corpo do animal por imersão em paraformaldeído a 4% durante a noite a 4 °C.

2. Inclusão em parafina de tumores grosseiramente visíveis e preparação de cortes corados com hematoxilina e eosina para avaliação diagnóstica inicial

  1. Inclusão de parafina em tumores grosseiramente visíveis
    1. Depois de fixar o pedaço do tumor 1 durante a noite em paraformaldeído a 4%, enxaguar o tecido colocando-o em um volume de PBS que seja pelo menos 10x maior do que o volume do tecido por 15 min; Use o mesmo volume para todas as lavagens subsequentes. Repita mais dois enxaguamentos de PBS de 15 minutos, usando um volume fresco de PBS para cada enxágue.
    2. Transfira o pedaço tumoral de 1 para 70% de etanol. Segurar o tecido em etanol a 70% durante 24 h a 4 °C. Se desejar, armazene o tecido a longo prazo nessas condições.
      NOTA: As etapas 2.1.1 a 2.1.7 são fornecidas em benefício dos investigadores que não têm acesso a uma máquina comercial de processamento de tecidos. Se o investigador tiver acesso a um processador de tecidos, o tecido será processado através de etanol e xilenos graduados de acordo com o protocolo do instrumento programado.
    3. Transfira o pedaço do tumor de 1 a 80% de etanol por 30 min à temperatura ambiente. Repetir a incubação por mais 30 min em um volume fresco de etanol 80%.
    4. Transfira o pedaço do tumor de 1 a 95% de etanol por 75 min à temperatura ambiente. Repetir a incubação mais duas vezes, cada vez por mais 75 min em um volume fresco de etanol 95%.
    5. Transfira o pedaço do tumor de 1 para 100% de etanol e incube por 60 min à temperatura ambiente. Repetir os 60 min de incubação mais duas vezes, cada vez usando um novo volume de etanol 100%.
    6. Transfira o pedaço 1 do tumor para um solvente à base de d-limoneno e incube por 30-60 min à temperatura ambiente. Transfira a peça tumoral 1 para um volume fresco do solvente à base de d-limoneno e incube por mais 30-60 min à temperatura ambiente.
    7. Transfira a peça tumoral 1 para o solvente à base de parafina/d-limoneno 1:1 por 1 h a 60 oC. Descarte o solvente à base de parafina/d-limoneno 1:1 e transfira a peça tumoral de 1 a60 o C de parafina e incube por 20 min a 60 oC. Repita a incubação em um novo volume de parafina de 60 oC mais uma vez por 20 min. Incubar o pedaço 1 do tumor em parafina durante a noite a 60 oC.
    8. Despeje uma camada base de parafina em um molde de histologia de aço e deixe solidificar. Transfira o pedaço 1 do tumor para a superfície da parafina da base e, imediatamente após o posicionamento, cubra o tecido com parafina a 60 oC e coloque o de tecido sobre e em contato com a parafina fundida. Transfira o molde para o lado frio da estação de incorporação e deixe-o solidificar por 10-15 min.
    9. Retire o bloco de parafina com o de tecido anexado do molde. Use o de tecido anexado para prender o bloco no micrótomo durante a secção.
      NOTA: O bloco de parafina agora pode ser armazenado indefinidamente à temperatura ambiente.
  2. Preparar cortes corados com hematoxilina e eosina de tumores grosseiramente visíveis.
    1. Cortar cortes de 4-5 μm de tecido tumoral usando um micrótomo e montá-los em lâminas de vidro carregadas positivamente.
    2. Para realizar a coloração de hematoxilina e eosina (H&E), desparafinize os cortes teciduais incubando as lâminas em um solvente à base de d-limoneno por 10 min à temperatura ambiente. Repetir a incubação num volume fresco de solvente à base de d-limoneno durante 10 minutos.
    3. Transfira as lâminas para etanol 100% e incube por 5 min à temperatura ambiente. Transfira as lâminas para um novo volume de etanol 100% e incube por mais 5 min à temperatura ambiente.
    4. Transfira as lâminas para etanol 95% e incube por 5 min à temperatura ambiente. Transfira as lâminas para um volume fresco de etanol 95% e incube por mais 5 min à temperatura ambiente.
    5. Transferir as lâminas para etanol 70% e incubar por 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, transferir para etanol 50% e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
    6. Transfira as lâminas para água destilada e incube por 5 min à temperatura ambiente.
    7. Manchar as lâminas imergindo-as em hematoxilina por 5 min à temperatura ambiente. Enxágue com água corrente da torneira por 1-2 min. Diferenciar mergulhando lâminas 2-5x em ácido clorídrico 0,5% em etanol 70%. Enxágue em banho-maria corrente por 1-2 min. Colocar as lâminas em etanol 95% com ácido acético 0,5% por 10 s.
    8. Manchar as lâminas com eosina-Y por 30 s à temperatura ambiente e, em seguida, transferir as lâminas para etanol 100% por 5 min. Limpe as amostras num solvente à base de d-limoneno durante 5 minutos.
    9. Monte as lamínulas usando um meio de montagem à base de xileno enquanto a lâmina ainda está molhada com o solvente à base de d-limoneno. Deixe o meio de montagem definir durante a noite.
      NOTA: Não utilize um meio de montagem à base de água.
  3. Preparar tecidos sem tumores grosseiramente visíveis para identificar neurofibromas plexiformes e micro-MPNSTs. Embutir os tecidos em parafina, preparar cortes histológicos e corar esses cortes com hematoxilina e eosina.
    1. Remover os órgãos internos e incorporar porções representativas de cada órgão em parafina para preparar cortes corados com H&E que serão examinados para evidência microscópica de tumores (Figura 1B). Remova a cabeça, os membros toráceos, os membros posteriores e a cauda (Figura 1C). Examinar a medula espinhal e as raízes nervosas in situ em busca de evidências de tumores de raízes nervosas, descalcificar a coluna vertebral e as costelas e tecidos moles associados por imersão em paraformaldeído 0,3 M EDTA/4% (pH 8,0) por 48-72 h a 4 oC; em seguida, enxaguar as amostras com 1x PBS. No final da descalcificação, certifique-se de que a descalcificação está completa tentando perfurar a coluna vertebral com uma agulha. A descalcificação é bem-sucedida se a agulha penetrar facilmente no osso sem triturar.
    2. Corte a coluna vertebral descalcificada e as estruturas associadas em blocos que se encaixarão em um de tecido. Desidratar através de etanol graduado seguido de um solvente à base de d-limoneno, conforme descrito nas etapas 2.1.2-2.1.7. Incorporar em parafina e preparar secções de 4-5 μm conforme descrito nos passos 2.1.7-2.2.1. Realizar as colorações de H&E conforme descrito nos passos 2.2.2-2.2.9; Deixe o meio de montagem definir durante a noite.

3. Identificar potenciais neurofibromas plexiformes e realizar colorações especiais para confirmar diagnósticos

NOTA: Recomendamos fortemente a inclusão de um patologista humano ou veterinário experiente na avaliação de H&E e colorações especiais de cortes de tumor GEM.

  1. Examine as lâminas coradas por H&E preparadas conforme descrito acima usando microscopia de campo claro para identificar possíveis tumores da bainha do nervo periférico. Uma vez que neurofibromas e MPNSTs surgem dentro de nervos periféricos, é importante determinar se tumores microscópicos estão associados a um nervo periférico. Identificar bloqueios com potenciais tumores da bainha do nervo periférico para que imunocolorações e outras colorações especiais possam ser realizadas para confirmar ou refutar diagnósticos.
  2. Distinguir potenciais NPs de MPNSTs/outras neoplasias de alto grau com base nas características histológicas observadas durante o exame de campo claro de cortes corados com H&E. Os NPs humanos são neoplasias levemente hipercelulares predominantemente compostas por células com núcleos alongados, muitas vezes ondulados. Em muitas áreas, as células são frouxamente embaladas e podem ser separadas por material extracelular mixoide; PNs em camundongos P 0-GGFβ3 têm uma aparência semelhante. As mitoses normalmente não estão presentes; se forem e o tumor for moderadamente a altamente hipercelular, o tumor é um MPNST ou outro tipo de neoplasia de alto grau (veja abaixo).
  3. Os NPs são compostos por uma mistura de células de Schwann neoplásicas e outros tipos de células não neoplásicas, como os mastócitos. Para confirmar a identidade de um NP, realizar imunocolorações para os marcadores de células de Schwann S100β e Sox10 e o marcador de mastócitos CD117 (c-Kit) em secções de blocos contendo potenciais NP identificados no exame de H&E (ver secção 3.4 para opções alternativas de coloração de marcadores de mastócitos). Realizar imunocolorações Ki67 para confirmar baixas taxas de proliferação.
    NOTA: A Tabela 1 lista os marcadores antigênicos utilizados para a identificação rotineira de neurofibromas plexiformes GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), o diagnóstico de MPNSTs e para uma avaliação completa de outros tipos celulares presentes em neurofibromas; coramos para estes últimos antígenos apenas quando descrevemos um novo modelo de GEM. Consulte a ficha técnica do fabricante do anticorpo para obter as condições recomendadas. Observe se a bula do fabricante do anticorpo recomenda a recuperação de antígeno; Nem todos os antígenos necessitam de recuperação para serem detectáveis.
    1. Prepare seções de 4-5 μm a partir dos blocos de parafina selecionados e monte-os em lâminas carregadas positivamente. Desparafinizar as secções conforme descrito nos passos 2.2.2-2.2.6.
    2. Enxágue as seções com 1x PBS por 3-5 min.
    3. Se o fabricante do anticorpo recomendar a recuperação de antígeno, prepare o tampão citrato. Combinar 9 ml de solução de ácido cítrico (10,5 g de ácido cítrico em 500 ml de água destilada) e 41 ml de solução de citrato de sódio (14,7 g de citrato de sódio em 500 ml de água destilada).
    4. Realizar a recuperação do antígeno colocando lâminas em tampão citrato por 20 min em uma panela de arroz aquecida.
    5. Transfira as lâminas para peróxido de hidrogênio a 3%/1x PBS por 10 min para eliminar a atividade da peroxidase no tecido.
      NOTA: Tornar esta solução fresca de cada vez e não use a solução estoque de peróxido de hidrogênio se for mais velho do que 3-4 meses.
    6. Enxágue as seções em 1x PBS.
    7. Bloquear seções usando buffer de bloqueio (2% BSA, 0,1% Triton X-100 em 1x PBS) por 1 h. Enxágue as lâminas brevemente em 1x PBS.
    8. Adicionar anticorpos primários aos cortes de tecido. Preparar anticorpos primários em tampão de bloqueio diluído. Incubar lâminas por 2 h a 37 oC ou durante a noite a 4 oC.
    9. Lave as lâminas em 1x PBS por 5 min.
    10. Incubar o tecido com anticorpo secundário biotinilado por 1-2 h.
    11. Preparar a solução de diaminobenzidina (DAB) com base no protocolo do fabricante e imergir as lâminas na solução por 2-10 min. Lave as lâminas em água por 5 min.
    12. Cortes de contracoloração imergindo-os em hematoxilina por 10-15 min. Exponha à água corrente até que fique clara. Mergulhe rapidamente as lâminas em álcool e enxágue as lâminas em água.
    13. Desidratar lâminas em etanol graduado mergulhando rapidamente lâminas, 4-5x por solução, em etanol 70%, etanol 95% e, em seguida, etanol 100%. Incubar lâminas em um solvente à base de d-limoneno por 2 min. Incubar lâminas em um segundo lote de solvente à base de d-limoneno por 2 min.
    14. Monte corrediças com um meio de montagem à base de xileno.
    15. Examine as lâminas por microscopia de campo claro.
    16. Para imunofluorescência, omitir os passos 3.3.10-3.3.15. Em vez disso, incubar o tecido com anticorpo secundário espécie-específico diluído em tampão de bloqueio por 1-2 h.
    17. Enxágue as lâminas em 1x PBS por 5 min.
    18. Monte lâminas usando 1x PBS/glicerol.
    19. Examinar lâminas usando microscopia de fluorescência.
  4. Método alternativo para coloração de mastócitos: coloração com azul de toluidina
    1. Preparar a solução-mãe de azul de toluidina dissolvendo 1 g de azul de toluidina O em 100 ml de etanol a 70%.
    2. Preparar uma solução de cloreto de sódio (NaCl) a 1% dissolvendo 0,5 g de NaCl em 50 ml de água destilada. Misture para dissolver. Ajuste o pH para aproximadamente 2,0-2,5 usando HCl.
      NOTA: Esta solução de NaCl deve ser renovada cada vez que as manchas são realizadas.
    3. Preparar a solução de trabalho de azul de toluidina adicionando 5 ml de solução-mãe de azul de toluidina a 45 ml da solução de NaCl a 1%. Misture bem e certifique-se de que o pH é de aproximadamente 2,3.
      NOTA: Um pH maior que 2,5 resultará em coloração com menos metacromasia. Torne esta solução fresca sempre que a coloração for realizada.
    4. Desparafinizar seções de 4-5 μm montadas em lâminas com carga positiva, conforme descrito nas etapas 2.2.2-2.2.6. Lavar seções desparafinizadas em água corrente por 2 min.
    5. Cortes de coloração em solução de trabalho de azul de toluidina por 2-3 min. Lave em água destilada por 2 min.
    6. Desidratar seções mergulhando 10x em etanol 95%. Mergulhe em lâminas de imersão em etanol 100% 10x. Mergulhe em lâminas frescas 100% etanol mais 10 vezes.
    7. Incubar lâminas em um solvente à base de d-limoneno por 2 min. Incubar lâminas em um segundo lote de solvente à base de d-limoneno por 2 min.
    8. Monte as lamínulas usando um meio de montagem à base de xileno enquanto a lâmina ainda está molhada com um solvente à base de d-limoneno.
      NOTA: Não utilize um meio de montagem à base de água.
    9. Examine as lâminas por microscopia de campo claro. Identificar mastócitos pela presença de grânulos roxos escuros em seu citoplasma. Outros tipos de células são corados de azul claro.

4. Colorações especiais para diagnosticar MPNSTs e descartar diagnósticos alternativos

  1. A aparência histológica dos MPNSTs humanos é muito variável e vários tipos diferentes de tumores têm uma aparência semelhante à dos MPNSTs28. Uma vez que os MPNSTs são derivados da linhagem celular de Schwann, determinar se o tumor surge de um nervo periférico ou dentro de um NP benigno existente por exame macroscópico ou exame microscópico de campo claro de cortes corados com H&E. Embora os NMPs sejam ocasionalmente encontrados não em associação com um nervo periférico ou NP (geralmente devido à separação inadvertida do nervo durante a dissecção, destruição do NP pré-existente via supercrescimento do MPNST ou porque a lesão é metastática), procure a associação do tumor com um nervo ou NP, pois o diagnóstico é menos provável se o tumor não estiver associado a um nervo ou NP.
  2. Preparar secções de 4-5 μm a partir de blocos de parafina contendo potenciais MPNSTs e montá-los em lâminas com carga positiva, conforme descrito no passo 2.2.1. Desparafinizar as secções conforme descrito nos passos 2.2.2-2.2.6.
  3. Realizar imunohistoquímica com o painel de anticorpos indicado na Tabela 2 conforme descrito nos passos 3.3.1-3.3.15.
  4. Examinar as imunocolorações por microscopia de campo claro. Como os MPNSTs demonstram diferenciação schwanniana, procure imunorreatividade uniforme ou irregular para S100β, nestina e Sox10. Se os tumores não forem positivos para esses três marcadores, consulte a Tabela 2 para estabelecer o diagnóstico.
    NOTA: MPNSTs humanos e de camundongos podem demonstrar diferenciação divergente. Por exemplo, alguns MPNSTs humanos demonstram diferenciação rabdomiobllástica focal (essas variantes são conhecidas como tumores Triton malignos); embora essas neoplasias corem para os marcadores de Schwanniano, elas também expressam marcadores musculares como desmina, MyoD1 e miogenina. A imunorreatividade para esses últimos marcadores não deve dissuadir os pesquisadores de diagnosticar o tumor como um MPNST. Embora vários modelos de camundongos expressando condicionalmente o gene de fusão SS18-SSX tenham sido estabelecidos para modelar a patogênese do sarcoma sinovial29, até onde sabemos, modelos de sarcoma sinovial que geram espontaneamente o transcrito de fusão equivalente não são conhecidos. Consequentemente, não procuramos transcritos de fusão SS18-SSX em tumores GEM e confiamos em perfis imuno-histoquímicos.

5. Classificação dos MPNSTs

  1. Determinar se a necrose tumoral, uma característica das MPNSTs grau IV da OMS, está presente. Para MPNSTs de Grau IV, procure hipercelularidade proeminente, atividade mitótica rápida (≥4 mitoses por 10 campos de alta potência (40x)) e atipias citológicas.
    1. Se a necrose não estiver presente, avaliar o tumor para determinar se hipercelularidade, atividade mitótica rápida e atipia citológica estão presentes. Se todas essas características estiverem presentes na ausência de necrose, classifique o tumor como MPNST grau III da OMS.
    2. Os tumores grau II da OMS são caracterizados por celularidade aumentada, mas em menor grau do que os MPNSTs graus III e IV da OMS. Os núcleos das células tumorais em um MPNST grau II da OMS demonstram tamanho aumentado (mais de 3x o tamanho dos núcleos de células tumorais em neurofibromas) e hipercromasia. O aumento da atividade mitótica (<4 mitoses por 10 campos de alta potência) está associado, mas não é um requisito para tumores grau II da OMS.
      NOTA: Como os tumores de alto grau geralmente progridem de graus mais baixos, regiões de baixo e alto grau podem estar presentes no mesmo MPNST. Nessa circunstância, o grau do tumor é determinado pela região de maior grau presente.
      NOTA: Há controvérsia entre os patologistas humanos sobre se o sistema de classificação da OMS descrito acima é preditivo dos resultados dos pacientes e alguns desses patologistas preferem simplesmente classificar os MPNSTs como baixo ou alto grau. Sob esse esquema, MPNSTs de alto grau têm atipia citológica proeminente, atividade mitótica rápida (>5 mitoses por 10 campos de alta potência) e hipercelularidade acentuada com ou sem necrose. Os MPNSTs de baixo grau não possuem necrose, mas mostram atividade mitótica, atipia citológica e celularidade intermediária entre um MPNST de alto grau e uma neoplasia neurofibromatosa atípica com potencial biológico desconhecido (ANNUBP). Preferimos o sistema descrito acima porque a distinção entre um ANNUBP e um MPNST de baixo grau pode ser um desafio para investigadores que não têm longa experiência com essas entidades.

6. Preparação de culturas de células P 0-GGFβ3 MPNST de passagem precoce

  1. Cultura de células tumorais P 0-GGFβ3 de passagem precoce a partir de fragmento tumoral fresco 2 (passo 1.5, Figura 1A). Mantenha as condições estéreis a partir deste ponto.
    1. Dissociar o tumor cortando-o em pedaços pequenos (2-4 mm) e picando em DMEM10 (meio essencial mínimo de Dulbecco) contendo 10% de soro fetal de bezerro, 2 μmol/L de forskolina, e 10 nmol/L de neuregulina 1β (NRG1β) em placas de cultura de tecidos de 100 mm.
    2. Permitir que as células cresçam a partir dos fragmentos de tecido picados a 37 oC em 5% de CO2 até que as placas sejam confluentes. Troque de mídia a cada 3-4 dias.
    3. Divida a cultura celular. Retire o meio da placa de 100 mm e lave as células com PBS; Remova e descarte o tecido picado. Remover PBS e adicionar 1 mL de tripsina a 0,25% por 2-5 min à temperatura ambiente. Para promover o descolamento celular, bata suavemente na placa e verifique se há descolamento usando um microscópio de luz; estender a incubação de tripsina conforme necessário.
    4. Neutralizar a tripsina adicionando 2 mL de DMEM10. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga e células de pellet a 500 × g por 5 min. Retire o meio e adicione 5 mL de DMEM10 fresco ao pellet.
    5. Distribuir a suspensão celular em duas a quatro placas de 100 mm contendo DMEM10. Não dividir as células durante mais de cinco passagens (passos 6.1.3 e 6.1.4) e mantê-las em DMEM sem forskolina e NRG1β. Lembre-se de congelar as células na passagem 2 para uso futuro.

7. Verificação da identidade de células MPNST de passagem precoce por imunocitoquímica

  1. Coloque tampas de vidro redondas estéreis de 18 mm #1,5 nos poços de placas de cultura de tecidos estéreis de 6 poços.
    1. Coloque a solução de poli-L-lisina/laminina nos poços num volume suficiente para cobrir a lamínula. Sele a placa com filme plástico para minimizar a evaporação. Incubar a 4 °C durante a noite. Na manhã seguinte, lave as tampas 3x com PBS estéril.
      NOTA: Tentamos plaquear células MPNST de passagem precoce em lamínulas não revestidas e descobrimos que as células não aderem bem na ausência de revestimento de poli-L-lisina/laminina.
    2. Colocar 10.000 células na lamínula adicionando suavemente 2 mL da suspensão celular em meio de crescimento em cada poço contendo a lamínula. Incubar as placas durante a noite a 37 °C com 5% de CO2 em uma incubadora de cultura de tecidos.
    3. Na manhã seguinte, lave as lamínulas por 2 x 5 min com PBS.
    4. Fixar as células com paraformaldeído a 4% em PBS por 18 min à temperatura ambiente.
    5. Enxágue as lamínulas 3 x 5 min com PBS. Se desejar, sele a placa com filme plástico e guarde-a a 4 °C neste ponto.
    6. Faça 50 mM NH4Cl fresco em PBS. Temperar aldeídos incubando lamínulas em 50 mM NH4Cl em PBS por 10 min à temperatura ambiente.
    7. Permeabilizar as células incubando lamínulas em Triton X-100 0,3% em PBS por 15 min à temperatura ambiente. Lave as tampas por 3 x 5 min com PBS.
    8. Bloquear a ligação inespecífica incubando lamínulas em tampão de bloqueio (1x PBS contendo 1% de albumina de soro bovino, 0,2% de leite em pó desnatado e 0,3% de Triton X-100) por 1 h à temperatura ambiente.
    9. Remova o tampão de bloqueio e adicione anticorpos primários reconhecendo os marcadores MPNST presentes no tumor de origem (tipicamente S100β, Nestin e Sox10) diluídos na diluição ideal predeterminada no tampão de bloqueio. Embrulhe a placa com filme plástico e incube a 4 °C durante a noite numa câmara umedecida.
    10. Lave 3 x 5 minutos com PBS para remover o anticorpo primário não ligado. Adicionar anticorpo secundário fluorescentemente marcado diluído em tampão de bloqueio e incubar por 1 h à temperatura ambiente. Proteger da luz.
    11. Lave 3 x 5 min com PBS. Incubar lamínulas em 1-5 μg de corante Hoechst durante 10 min. Continue a proteger da luz.
    12. Lave as tampas com PBS por 5 min. Monte lâminas usando 1:1 1x PBS/glicerol. Imagem com microscópio fluorescente.

8. Aloenxerto de células tumorais de passagem precoce para demonstrar tumorigenicidade

  1. Crescer células P 0-GGFβ3 MPNST de passagem precoce em DMEM10 até 80% de confluência. Enxaguar as células uma vez com solução salina balanceada de Hanks à temperatura ambiente (HBSS). Tratar as células por 30 s a 1 min com uma solução de dissociação celular não enzimática para removê-las do substrato. Adicionar 5 mL de DMEM10 por 1 mL de um reagente de dissociação celular não enzimática.
    NOTA: A dissociação celular pode demorar muito mais tempo, até 10-20 min. Consulte o protocolo do fabricante.
    NOTA: Não cresça células até a confluência, pois isso reduzirá a eficácia do enxerto.
    1. Conte células usando um hemocitômetro. Spin cells para baixo a 5 × g por 5 min e ressuspendê-los a uma concentração de 1-2 × 106 células por 100 μL de DMEM10. Mantenha as células congeladas até estarem prontas para a injeção.
    2. Anestesiar camundongos NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) na câmara de indução de um vaporizador de isoflurano. Coloque o animal de bruços e esterilize o local da injeção com etanol 70%. Deixe o local secar ao ar antes da injeção. Antes da injeção, permita que as células cheguem à temperatura ambiente.
    3. Injetar 1-2 x 106 células por via subcutânea no flanco direito. Coloque o rato sozinho numa gaiola sem roupa de cama e deixe-o recuperar. Certifique-se de que apenas parte da gaiola esteja em uma almofada de aquecimento para evitar a hipotermia. Isso fornece uma zona para a qual o mouse pode se mover se ficar superaquecido.
      NOTA: Nós enxertamos um mínimo de três camundongos com cada cultura de passagem precoce, pois alguns enxertos podem não levar.
    4. Deixar o enxerto crescer por 15-60 dias; Avalie a saúde animal 3x por semana e registre os escores de condição corporal, incluindo peso, e mudanças de comportamento em cada exame. Terminar camundongos que atingiram o tamanho máximo permitido do enxerto ou camundongos moribundos usando eutanásia de dióxido de carbono seguida de luxação cervical. Registre a idade ao óbito em dias. À medida que os tumores se tornam visíveis externamente, registre as dimensões do tumor (comprimento, largura e altura).
      NOTA: Em nossa experiência, diferentes culturas de MPNST de passagem precoce enxertam com eficiência variável e diferem no tempo necessário para o crescimento do enxerto. Os animais não devem ser autorizados a ultrapassar o tamanho máximo admissível do tumor e/ou o parâmetro de avaliação humano aprovado pela IACUC.
  2. Retirar o tumor, fixá-lo em paraformaldeído a 4%, incorporá-lo em parafina e realizar as colorações de H&E conforme descrito nas seções 2.1-2.2.9 para verificar se o aloenxerto é um tumor e não um tecido reativo. Se necessário, imunomanchar o enxerto para os marcadores que estavam presentes no tumor de origem.

Resultados

A Figura 2 ilustra exemplos de neoplasias grosseiramente evidentes surgindo em camundongos P 0-GGFβ3. Tumores facilmente identificáveis a olho nu podem ser vistos como massas distendendo regiões do corpo, como mostra a Figura 2A (seta). Ao determinar se a neoplasia é potencialmente um tumor da bainha do nervo periférico, é essencial estabelecer que o tumor está associado a um nervo periférico. Neste caso, a ressonância magnética (

Discussão

Os métodos histológicos e bioquímicos aqui apresentados fornecem uma estrutura para diagnosticar e caracterizar modelos de GEMs na patogênese do neurofibroma e do MPNST. Ao longo dos anos, essas metodologias têm sido bastante úteis para avaliar a patologia dos tumores da bainha dos nervos periféricos que surgem em modelos deGEM21,25,26. No entanto, embora os protocolos aqui descritos sejam úteis para determinar com que p...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por bolsas do National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 para S.L.C.; R01 NS109655-03S1 para D.P.J.), o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA122804 para S.L.C.) e o Departamento de Defesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 para S.L.C.).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
Acetic AcidFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Bovine Serum AlbuminFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Cell ScraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)Decon Laboratories5989-27-5
Critic AcidFisher ScientificA104-500
CytokeratinABCAM C-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Fetal Calf SerumOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
Hydrochloric AcidFisher ScientificA144-212
Hydrogen PeroxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluranePiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Liquid Nitrogen
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtome
NestinMillipore Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaIn houseMade by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
NeurofibrominSanta Cruz Biotechnology sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceJackson Laboratory5557
Nonfat Dry MilkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 miceIn house
Paraffin WaxLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isoflurance MachineVetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (now GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Sodium ChlorideFisher ScientificS640
Sodium Citrate (Dihydrate)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Cell Signaling (CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlueACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TrypsinCorning25-051-31

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