Identificazione, diagnosi e classificazione dei tumori maligni della guaina dei nervi periferici in modelli murini geneticamente modificati

Riepilogo

Abbiamo sviluppato una metodologia per valutare se le neoplasie del sistema nervoso nei topi geneticamente modificati ricapitolano accuratamente la patologia delle loro controparti umane. Qui, applichiamo queste tecniche istologiche, i criteri patologici definiti e le metodologie di coltura ai neurofibromi e ai tumori maligni della guaina dei nervi periferici che insorgono nel modello murino P 0-GGFβ3.

Abstract

I pazienti con la sindrome da suscettibilità al tumore autosomico dominante neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) sviluppano comunemente neurofibromi plessiformi (PN) che successivamente si trasformano in tumori maligni altamente aggressivi della guaina dei nervi periferici (MPNST). La comprensione del processo attraverso il quale un PN si trasforma in un MPNST sarebbe facilitata dalla disponibilità di modelli murini geneticamente modificati (GEM) che replicano accuratamente la progressione PN-MPNST osservata negli esseri umani con NF1. Sfortunatamente, i modelli GEM con ablazione di Nf1 non ricapitolano completamente questo processo. Questo ci ha portato a sviluppare topi P 0-GGFβ3, un modello GEM in cui la sovraespressione del mitogeno delle cellule di Schwann neuregulin-1 (NRG1) nelle cellule di Schwann provoca lo sviluppo di PN che progrediscono fino a diventare MPNST ad alta frequenza. Tuttavia, per determinare se la tumorigenesi e la progressione neoplastica nei topi P 0-GGFβ3 modellano accuratamente i processi osservati nei pazienti NF1, abbiamo dovuto prima dimostrare che la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica P_0-GGFβ3 ricapitola la patologia delle loro controparti umane.

In questo articolo, descriviamo le metodologie specializzate utilizzate per diagnosticare e classificare accuratamente le neoplasie del sistema nervoso periferico in modelli GEM, utilizzando P 0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3; Trp53^+/- topi come esempio. Descriviamo i metodi istologici, immunoistochimici e istochimici utilizzati per diagnosticare PN e MPNST, come distinguere queste neoplasie da altri tipi di tumore che ne imitano la patologia e come classificare queste neoplasie. Discutiamo la creazione di colture di passaggio precoce da MPNST GEM, come caratterizzare queste colture utilizzando l'immunocitochimica e come verificare la loro tumorigenicità stabilendo allotrapianti. Collettivamente, queste tecniche caratterizzano la patologia dei PN e degli MPNST che insorgono nei modelli GEM e confrontano criticamente la patologia di questi tumori murini con le loro controparti umane.

Introduzione

Negli ultimi tre decenni, numerosi laboratori hanno tentato di creare modelli murini di tumori umani introducendo mutazioni associate al cancro umano nel genoma del topo o sovraesprimendo un prodotto genico che è sovraespresso nei tumori umani. I modelli murini geneticamente modificati (GEM) risultanti possono essere utilizzati per una varietà di scopi, come stabilire che la modifica genomica di nuova introduzione avvia la tumorigenesi, identificare altri cambiamenti genetici o epigenetici che si verificano successivamente che contribuiscono alla progressione del tumore e definire le vie di segnalazione chiave che guidano l'inizio e la progressione del tumore. A diffe....

Protocollo

Le procedure qui descritte sono state approvate dall'IACUC dell'Università di Medicina della Carolina del Sud e sono state eseguite da personale adeguatamente addestrato in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.

1. Determinazione della penetranza e della sopravvivenza del tumore nei topi P 0-GGFβ3 e identificazione dei tumori in questi animali per un'ulteriore caratterizzazione

1. Generare la coorte di topi che saranno valutati per la tumorigenesi. Il numero di topi necessari dipende dalla penetranza de....

Discussione

I metodi istologici e biochimici qui presentati forniscono un quadro di riferimento per la diagnosi e la caratterizzazione di modelli GEM di neurofibroma e patogenesi MPNST. Nel corso degli anni, abbiamo trovato queste metodologie molto utili per valutare la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica che insorgono nei modelli GEM 21,25,26. Tuttavia, mentre i protocolli qui delineati sono utili per determinare l'accurat.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31