تقنية نقل عكسي عكسية قائمة على الخلايا الجذعية الجنينية للفأر للاستكشاف السريع لنسب الحمض النووي

Summary

يصف هذا البروتوكول طريقة للنقل العكسي المتعدد للخلايا الجذعية الجنينية للفأر أثناء الزراعة باستخدام وسائط 2i و LIF. تنتج هذه الطريقة قابلية وكفاءة أعلى من بروتوكولات النقل الأمامية التقليدية ، مع تمكين تحسين نسب البلازميد في وعاء واحد.

Abstract

نظرا لبساطته النسبية وسهولة استخدامه ، أصبح النقل العابر لخطوط خلايا الثدييات بالأحماض النووية دعامة أساسية في البحوث الطبية الحيوية. في حين أن معظم خطوط الخلايا المستخدمة على نطاق واسع لديها بروتوكولات قوية للانتقال في ثقافة ثنائية الأبعاد ملتصقة ، فإن هذه البروتوكولات غالبا لا تترجم جيدا إلى خطوط أقل دراسة أو تلك التي تحتوي على أشكال غير نمطية يصعب نقلها. باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات للفأر المزروعة في وسائط 2i / LIF ، وهو نموذج استزراع يستخدم على نطاق واسع للطب التجديدي ، تحدد هذه الطريقة بروتوكول نقل عكسي محسن وسريع قادر على تحقيق كفاءة نقل أعلى. بالاستفادة من هذا البروتوكول ، يتم إجراء نقل متعدد ثلاثي البلازميد ، مع الاستفادة من الكفاءة الأعلى من المعتاد في توصيل البلازميد لدراسة نطاق موسع من القياس الكيميائي للبلازميد. يسمح بروتوكول النقل المتعدد العكسي هذا بطريقة تجريبية ذات وعاء واحد ، مما يمكن المستخدمين من تحسين نسب البلازميد في بئر واحد ، بدلا من العديد من عمليات النقل المشتركة. من خلال تسهيل الاستكشاف السريع لتأثير القياس الكيميائي للحمض النووي على الوظيفة العامة للدوائر الجينية المسلمة ، يقلل هذا البروتوكول من وقت وتكلفة نقل الخلايا الجذعية الجنينية.

Introduction

يعد توصيل الحمض النووي والحمض النووي الريبي إلى خلايا الثدييات بمثابة ركيزة أساسية للبحوث الطبية الحيوية¹. طريقة شائعة لإدخال الأحماض النووية الخارجية (NA) في خلايا الثدييات هي من خلال النقل العابر ^2,3. تعتمد هذه التقنية على خلط NA مع كواشف النقل المتاحة تجاريا القادرة على توصيلها إلى الخلايا المتلقية. عادة ، يتم تسليم NA عن طريق النقل الأمامي ، حيث تتلقى الخلايا الملتصقة بسطح ثنائي الأبعاد مجمع النقل. في حين أن النقل الأمامي لخطوط الخلايا الراسخة الأكثر شيوعا قوي والبروتوكولات منشورة جيدا ، فإن أنواع الخلايا الأكثر تخصصا ذات الأشكال غير أحادية الطبقة لا تنتقل بسهو....

Protocol

1. إعداد الكواشف لثقافة mPSC

1. تحضير ملحق N2.
   1. في الظروف غير المعقمة، قم بإعداد محاليل المخزون التالية (الخطوة 1.1.1.1) في غطاء دخان السلامة الكيميائية. أضف المسحوق الصلب لكل مادة كيميائية إلى أنبوب مخروطي الوزن مسبقا سعة 50 مل. وزن كل أنبوب بعد إضافة المسحوق وإضافة كمية مناسبة من المذيب لتحقيق التركيزات أدناه. بالنسبة لدفعة واحدة من الوسائط ، قم بإعداد الحد الأدنى للمبلغ المدرج.
      ملاحظة: الكواشف التالية خطرة ويجب التعامل معها وفقا لإرشادات السلامة الكيميائية المحلية. تأكد من معدات الوقاية الشخصية المناسبة عند المناولة ، واعمل فقط مع أشكال المسحوق الصلب لهذه المواد الكيميائية في غطاء دخان كيميائي لمنع الاستنشاق.
      1. الحد الأدنى من 0....

النتائج

تعتمد كل من عمليات النقل الأمامية والعكسية على التفاعل بين غشاء الخلية ومجمعات كاشف الحمض النووي الوارد ، مما يسمح بتوصيل NA إلى الخلايا المستقبلة. حيث تختلف هذه التقنيات هي حالة الخلية عند الولادة - بينما يتم تسليم الحمض النووي عادة إلى أحاديات الخلايا الملتصقة في النقل الأمامي التقليدي ?.......

Discussion

ومن الأسباب الرئيسية لاعتماد بروتوكولات النقل على نطاق واسع إمكانية استنساخها وإمكانية الوصول إليها؛ ومع ذلك ، تتطلب هذه البروتوكولات التحسين عبر السياقات التجريبية. لم يذكر أعلاه هو الاختبار القياسي المطلوب عند محاولة نقل خط خلية جديد لأول مرة. أولا ، يعد اختيار كاشف النقل أمرا أساسيا ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056