核酸比の迅速な探索のための最適化されたマウス胚性幹細胞ベースのリバースポリトランスフェクション技術(英語)

要約

本プロトコルは、2iおよびLIF培地による培養中のマウス胚性幹細胞の逆ポリトランスフェクションの方法を記述する。この分析法は、従来のフォワードトランスフェクションプロトコルよりも高い生存率と効率をもたらすと同時に、プラスミド比のワンポット最適化も可能にします。

要約

哺乳類細胞株の核酸による一過性トランスフェクションは、その比較的簡便さと使いやすさから、生物医学研究の主力となっています。最も広く使用されている細胞株には、接着性二次元培養におけるトランスフェクションのための堅牢なプロトコルがありますが、これらのプロトコルは、あまり研究されていない細胞株や、非定型でトランスフェクションが困難な形態を持つ細胞株にはうまく変換されないことがよくあります。この分析法は、再生医療に広く使用されている培養モデルである2i/LIF培地で増殖させたマウス多能性幹細胞を用いて、より高いトランスフェクション効率を達成できる最適化された迅速なリバーストランスフェクションプロトコルの概要を示しています。このプロトコルを活用して、3プラスミドのポリトランスフェクションを行い、プラスミド送達の通常よりも高い効率を利用して、より広い範囲のプラスミド化学量論を研究します。このリバースポリトランスフェクションプロトコルにより、ワンポット実験法が可能になり、複数のコトランスフェクションではなく、単一のウェルでプラスミド比を最適化できます。このプロトコルは、送達された遺伝子回路の全面的な機能に対するDNA化学量論の効果の急速な調査を促進することによって、胚性幹細胞のtransfectionの時間そして費用を最小にする。

概要

哺乳類細胞へのDNAとRNAの送達は、生物医学研究の中核的な柱として機能します¹。外因性核酸(NA)を哺乳類細胞に導入する一般的な方法は、一過性トランスフェクション^2,3です。この技術は、NAをレシピエント細胞に送達できる市販のトランスフェクション試薬と混合することに依存しています。通常、NAはフォワードトランスフェクションを介して送達され、2次元表面に接着した細胞がトランスフェクション複合体を受け取ります。最も一般的な確立された細胞株のフォワードトランスフェクションは頑健であり、プロトコルは十分に公開されていますが、非単層形態のよりニッチな細胞タイプではトランスフェクションが容易ではなく、送達できるNAの量とそれを受け取る細胞の数が制限されます。

多能性幹細胞(PSC)は、無限に分裂し、あらゆる種類の体細胞を産生する能力があるため、発生を理解するための魅力的なモデルとして、また再生医療のツールとして機能します。マウスPSC(mPSC)の場合、2つの阻害剤とLIF(2i/LIF)を用いたルーチンのin vitro培養条件では、ドーム状のコロニー形態が維持され、フォワードトランスフェクションに曝露される細胞の数が直接制限されます

プロトコル

1. mPSC培養用試薬の調製

1. N2サプリメントを準備します。
   1. 非滅菌状態で、以下の原液(ステップ1.1.1.1)を化学的安全ドラフトで調製します。各化学物質の固体粉末を、事前に計量した50 mLのコニカルチューブに加えます。粉末を添加した後、各チューブの重量を量り、適切な量の溶媒を加えて以下の濃度にします。メディアの 1 バッチについては、記載されている最小量を準備します。
      注:以下の試薬は危険であり、地域の化学物質安全ガイドラインに従って取り扱う必要があります。取り扱いの際は適切なPPEを確保し、吸入を防ぐために、これらの化学物質の固体粉末形態のみを化学ヒュームフードで使用してください。
      1. 0.518 mg/mL の水に 0.05 mL 以上の亜セレン酸ナトリウム、160 mg/mL の水に 0.5 mL のプトレシン、0.6 mg/mL の 100% エタノール中のプロゲステロン 0.165 mL ( 材料表を参照)。
      2. 溶液は-20°Cで最長2年間保存してください。
   2. バイオセーフティキャビネット(BSC)で、58.035 mLのDMEM-F12に以下を添加します。
      1. 0.518 mg / mL亜セレン酸ナトリウム溶液0.05 mL、160 mg / mLプトレシン溶液0.5 mL、0.6 mg / mLプロゲステロン溶液0.....

ディスカッション

トランスフェクションプロトコルが広く採用されている主な理由は、その再現性とアクセス性です。ただし、これらのプロトコルには、実験コンテキスト全体での最適化が必要です。上記には記載されていませんが、新しい細胞株を初めてトランスフェクションしようとするときに必要な標準的な試験です。まず、市販の試薬は万能ではなく、NA送達の効率は細胞タイプによって異なるため?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056