Uma técnica otimizada de politransfecção reversa baseada em células-tronco embrionárias de camundongo para rápida exploração de proporções de ácidos nucleicos

Resumo

O presente protocolo descreve um método de politransfecção reversa de células-tronco embrionárias de camundongos durante o cultivo com meios 2i e LIP. Este método produz maior viabilidade e eficiência do que os protocolos tradicionais de transfecção direta, ao mesmo tempo em que permite a otimização one-pot das proporções plasmidiais.

Resumo

Devido à sua relativa simplicidade e facilidade de uso, a transfecção transitória de linhagens celulares de mamíferos com ácidos nucléicos tornou-se um pilar na pesquisa biomédica. Embora as linhagens celulares mais utilizadas possuam protocolos robustos para transfecção em cultura bidimensional aderente, esses protocolos muitas vezes não se traduzem bem para linhagens menos estudadas ou com morfologias atípicas e difíceis de transfectar. Usando células-tronco pluripotentes de camundongos cultivadas em meios 2i/LIF, um modelo de cultura amplamente utilizado para medicina regenerativa, este método delineia um protocolo de transfecção reversa rápido e otimizado capaz de alcançar maior eficiência de transfecção. Aproveitando este protocolo, uma politransfecção de três plasmídeos é realizada, aproveitando a eficiência maior do que o normal na entrega de plasmídeos para estudar uma gama expandida de estequiometria de plasmídeos. Este protocolo de politransfecção reversa permite um método experimental de um pote, permitindo que os usuários otimizem as proporções de plasmídeos em um único poço, em vez de em várias cotransfecções. Ao facilitar a rápida exploração do efeito da estequiometria do DNA na função global dos circuitos genéticos liberados, este protocolo minimiza o tempo e o custo da transfecção de células-tronco embrionárias.

Introdução

A entrega de DNA e RNA em células de mamíferos serve como um pilar central da pesquisa biomédica¹. Um método comum para a introdução de ácidos nucléicos (NA) exógenos em células de mamíferos é por transfecção transitória ^2,3. Essa técnica baseia-se na mistura de NA com reagentes de transfecção disponíveis comercialmente, capazes de entregá-los nas células receptoras. Normalmente, o NA é liberado via transfecção anterior, onde as células aderidas a uma superfície bidimensional recebem o complexo de transfecção. Enquanto a transfecção direta para as linhagens celular....

Protocolo

1. Preparação de reagentes para cultura mPSC

1. Preparar suplemento N2.
   1. Em condições não estéreis, preparar as seguintes soluções-mãe (passo 1.1.1.1) num exaustor de segurança química. Adicione o pó sólido de cada produto químico a um tubo cônico de 50 mL pré-pesado. Pesar cada tubo após a adição do pó e adicionar uma quantidade adequada de solvente para atingir as concentrações abaixo. Para um lote de mídia, prepare a quantidade mínima listada.
      NOTA: Os reagentes a seguir são perigosos e devem ser manuseados de acordo com as diretrizes locais de segurança química. Certifique-se de EPI adequado ao manusear e trabalhe apenas com as for....

Discussão

Uma das principais razões para a ampla adoção de protocolos de transfecção é sua reprodutibilidade e acessibilidade; no entanto, esses protocolos requerem otimização em contextos experimentais. Não mencionado acima é o teste padrão exigido ao tentar transfectar uma nova linhagem celular pela primeira vez. Primeiro, a escolha do reagente de transfecção é fundamental, pois os reagentes comercialmente disponíveis não são únicos e variam na eficiência da viabilidade da entrega de NA entre os tipos celulare.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056