Оптимизированный метод обратной политрансфекции на основе эмбриональных стволовых клеток мыши для быстрого исследования соотношения нуклеиновых кислот

Резюме

В настоящем протоколе описан метод обратной политрансфекции эмбриональных стволовых клеток мыши при культивировании средами 2i и LIF. Этот метод обеспечивает более высокую жизнеспособность и эффективность, чем традиционные протоколы прямой трансфекции, а также позволяет оптимизировать соотношение плазмид в одном горшке.

Аннотация

Благодаря своей относительной простоте и легкости использования, транзиторная трансфекция клеточных линий млекопитающих нуклеиновыми кислотами стала основой биомедицинских исследований. В то время как наиболее широко используемые клеточные линии имеют надежные протоколы трансфекции в адгезивной двумерной культуре, эти протоколы часто плохо переводятся на менее изученные линии или линии с нетипичной, трудно трансфицируемой морфологией. Используя мышиные плюрипотентные стволовые клетки, выращенные в среде 2i/LIF, широко используемой модели культуры для регенеративной медицины, этот метод описывает оптимизированный, быстрый протокол обратной трансфекции, способный достичь более высокой эффективности трансфекции. Используя этот протокол, выполняется трехплазмидная политрансфекция, использующая более высокую, чем обычно, эффективность доставки плазмид для изучения расширенного диапазона стехиометрии плазмид. Этот протокол обратной политрансфекции позволяет использовать экспериментальный метод с одним горшком, что позволяет пользователям оптимизировать соотношение плазмид в одной лунке, а не в нескольких котрансфекциях. Способствуя быстрому изучению влияния стехиометрии ДНК на общую функцию доставляемых генетических цепей, этот протокол сводит к минимуму время и стоимость трансфекции эмбриональных стволовых клеток.

Введение

Доставка ДНК и РНК в клетки млекопитающих служит основой биомедицинских^{исследований1}. Распространенным методом введения экзогенных нуклеиновых кислот (НК) в клетки млекопитающих является транзиторная трансфекция ^2,3. Этот метод основан на смешивании НК с коммерчески доступными реагентами для трансфекции, способными доставить их в клетки-реципиенты. Как правило, НК доставляется путем прямой трансфекции, при которой клетки, прилипшие к двумерной поверхности, получают трансфекционный комплекс. В то время как прямая трансфекция для наиболее распространенных установленных клеточных линий надежна, а протоколы хорошо опубликованы, более нишевые типы клеток с немонослойной морфологией не трансфицируются легко, что ограничивает количество NA, которое может быть доставлено, и количество клеток, которые его получают.

Плюрипотентные стволовые клетки (ПСК) служат привлекательной моделью для понимания развития и инструментом регенеративной медицины, учитывая их способность делиться неограниченное количество клеток и производить любой тип клеток организма. Для мышиных ПСК (мПСК) рутинные условия культивирования in vitro с 2 ингибиторами и LIF (2i/LIF) поддерживают куполообразную морфологию колонии, непосредственно ограничивая количество клеток, подвергающихся прямой трансфекции ^4,5,6. Для решения этой проблемы можно выполнить обратную трансфекцию: клетки добавляют в чашку, содержащую среду и трансфекционный реагент, вместо того, чтобы добавлять трансфекционный реагент к адгезивным клеткам⁷. Несмотря на то, что это увеличивает количество клеток, подвергающихся воздействию реагента, это также требует одновременного пассажа и трансфекции клеток.

Выходя за рамки простой трансфекции одной НК, исследователи часто стремятся доставить несколько конструкций НК в популяцию клеток in vitro. Обычно это достигается с помощью котрансфекции, при которой НК смешиваются в заданном соотношении (1:1, 9:1 и т.д.), а затем соединяются с выбранным реагентом для трансфекции⁸. В результате получается смесь НК и реагента, которая сохраняет исходное соотношение НК друг к другу - в то время как клетки при лечении могут получать разное количество этой смеси, все они получают одинаковое соотношение⁹. Хотя это выгодно, когда известно желаемое соотношение частей, заблаговременное определение этого соотношения может быть трудоемким, поскольку каждое соотношение представляет собой отдельное условие. Одной из альтернатив является проведение «политрансфекции», при которой отдельные НК смешиваются с трансфекционным реагентом независимо друг^{от друга.} Комбинируя трансфекционные комплексы, содержащие отдельные НК (вместо того, чтобы объединять НК до создания комплексов), исследователи могут исследовать широкий спектр стехиометрий НК в одном эксперименте по трансфекции⁹. Это особенно ценно в тех случаях, когда предполагается, что продукты нескольких СА будут взаимодействовать друг с другом, например, с индуцируемыми транскрипционными системами или системами с обратной связью, встроенными в ^1,10,11. Однако для того, чтобы сделать это эффективно, необходима высокая эффективность трансфекции. Действительно, по мере увеличения числа уникальных трансфицируемых НК вероятность того, что данная клетка получит все желаемые НС, экспоненциально уменьшается ^9,12.

В следующем отчете описывается протокол обратной трансфекции мПСК с использованием реагента для трансфекции на основе катионных липидов, при котором клетки подвергаются воздействию смеси реагента и NA в течение максимум 5 мин для обеспечения максимальной жизнеспособности и минимизации времени вне типичных условий культивирования. Сравнение этого протокола со стандартной прямой трансфекцией этих клеток демонстрирует более высокую эффективность трансфекции и увеличение общего числа выживших трансфицированных клеток. Комбинируя эту обратную трансфекцию с трехплазмидной политрансфекцией с участием простых флуоресцентных репортеров, демонстрируется расширенный потенциал скрининга соотношений NA с высокой эффективностью трансфекции.

протокол

1. Приготовление реагентов для культивирования мПСК

1. Приготовьте добавку N2.
   1. В нестерильных условиях приготовьте следующие исходные растворы (шаг 1.1.1.1) в вытяжном шкафу химической безопасности. Добавьте твердый порошок каждого химического вещества в предварительно взвешенную коническую пробирку объемом 50 мл. Взвесьте каждую пробирку после добавления порошка и добавьте соответствующее количество растворителя, чтобы достичь приведенных ниже концентраций. Для одной партии носителя подготовьте указанное минимальное количество.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие реагенты являются опасными и должны обрабатываться в соответствии с местными правилами химической безопасности. Обеспечьте надлежащие СИЗ при обращении и работайте только с твердыми порошкообразными формами этих химических веществ в химическом вытяжном шкафу, чтобы предотвратить вдыхание.
      1. Минимум 0,05 мл селенита натрия в воде в дозе 0,518 мг/мл, 0,5 мл путресцина в воде в дозе 160 мг/мл, 0,165 мл прогестерона в 100% этаноле в дозе 0,6 мг/мл (см. таблицу материалов).
      2. Хранить растворы при температуре -20 °C до 2 лет.
   2. В шкафу биобезопасности (BSC) добавьте следующее к 58,035 мл DMEM-F12.
      1. 0,05 мл 0,518 мг/мл раствора селенита натрия, 0,5 мл раствора путресцина 160 мг/мл, 0,165 мл 0,6 мг/мл раствора прогестерона.
      2. Фильтр стерилизуют вышеуказанную смесь фильтром 0,22 мкм.
   3. Еще в БСК приготовьте раствор апотрансферрина в концентрации 100 мг/мл.
      1. Добавьте 5 мл DMEM-F12 к 500 мг апотрансферрина (см. таблицу материалов). Медленно суспендируйте и вымойте контейнер, избегая пузырьков.
      2. После ресуспендирования и удаления как можно большего количества 5 мл добавьте его в раствор селенита/путресцина/прогестерона. Возьмите еще больше предыдущего раствора и вымойте флакон с апотрансферрином, выдавливая как можно больше из него.
   4. Добавьте в раствор 5 мл 7,5% фракции БСА V (см. таблицу материалов).
   5. Смешать и аликвотировать 6,875 мл на пробирку. Хранить аликвоты при -80 °C до 1 года.
   6. При использовании вышеуказанных аликвот N2 для получения среды N2B27 разморозьте желаемую аликвоту и добавьте 3,125 мл раствора инсулина 4 мг/мл (см. таблицу материалов) к 6,875 N2 для 10 мл 100x N2.
2. Приготовьте базальную среду N2B27.
   1. Разморозьте добавки N2 и B27 в холодильнике при температуре 4 °C в течение нескольких часов или на ночь.
   2. В БСК смешайте 484,5 мл DMEM-F12 и 484,5 мл нейробазальной среды (см. таблицу материалов) в стерильном флаконе объемом 1 л.
   3. Добавьте в среду 10 мл витамина B27 и 10 мл добавки N2.
   4. Добавьте 1 мл 55 мМ бета-меркаптоэтанола (см. таблицу материалов). Добавьте 10 мл 100-кратного глутамакса. Энергично перемешайте, вкручивая бутылку.
   5. Прибавьте желаемый объем на аликвоту (обычно 100 мл) и храните при -80 °C до 1 года. Хранить после размораживания при температуре 4 °C до 3 недель.
3. Подготовьте носитель NBiL.
   1. Разморозьте 100 мл аликвоты базальной среды N2B27 от -80 °C в холодильнике с температурой 4 °C.
   2. В BSC добавьте LIF (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 10 мкг/л.
   3. Добавьте CHIR99021 (3 мкМ окончательный) и PD0325901 (1 мкМ конечный) (см. Таблицу материалов). Хорошо перемешайте серологической пипеткой объемом 50 мл. Хранить при температуре 4 °C до 2 недель.
4. Приготовьте 0,2% раствор желатина.
   1. Перелейте 500 мл H_2Oдвойной дистилляции в стеклянную бутылку объемом 1 л.
   2. Отмерьте 1 г желатина (см. Таблицу материалов) и добавьте его в воду. Перемешайте, встряхивая бутылку до полного растворения.
   3. Автоклавируйте смесь желатина и воды при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм, 121 °C в течение 35 мин. После охлаждения фильтр стерилизует его фильтром 0,22 мкм в BSC. Хранить при температуре 4 °C.
5. Подготовьте промывочные средства.
   1. В БСК смешайте 160 мкл 7,5% БСА на 10 мл DMEM-F12.
   2. Масштабируйте вышеперечисленное и приготовьте в больших количествах для удобства использования в будущем (например, 8 мл 7,5% BSA на 500 мл DMEM-F12). Хранить при температуре 4 °C.

2. Приготовление реагентов для политрансфекции мПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие значения приведены для одной лунки 24-луночного планшета. Значения можно масштабировать соответствующим образом. Последовательности всех ДНК/плазмид подробно описаны в Дополнительном файле 1.

1. Рассчитайте объем раствора ДНК, необходимый для одной процедуры.
   1. Подготовьте 500 нг ДНК на лунку/условие.
      1. При трансфекции одной плазмиды раствором ДНК 100 нг/мкл приготовьте одну пробирку с 5 мкл ДНК.
      2. При трансфекции двух плазмид по 100 нг/мкл каждая подготовьте две пробирки по 2,5 мкл в каждой, по одной для каждой плазмиды.
2. В ССП выполните следующие действия: На каждые 500 нг трансфекционной обработки (см. Таблицу материалов) наливайте 25 мкл OptiMEM в пробирку объемом 1,5 мл.
   1. Для приведенного выше примера подготовьте две пробирки, каждая из которых содержит 250 нг ДНК (2,5 мкл) и 12,5 мкл OptiMEM.
3. Добавьте необходимый объем ДНК для этой обработки в OptiMEM в пробирке.
4. Для каждой пробирки с 500 нг ДНК и OptiMEM создайте соответствующую пробирку с еще 25 мкл OptiMEM и 1 мкл реагента для трансфекции на основе катионных липидов.
   1. Опять же, эти значения должны быть соответствующим образом масштабированы. Для приведенного выше примера подготовьте две пробирки, каждая из которых содержит 12,5 мкл реагента OptiMEM и 0,5 мкл реагента для трансфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При масштабировании значений используйте массу добавленной ДНК, а не объем, необходимый для этого количества ДНК. Реакции с трансфекционным реагентом и ДНК могут быть масштабированы (например, если 5 лунок должны быть трансфицированы одной и той же ДНК). Соотношения реагентов остаются прежними, но масштабируются соответствующим образом (например, 1000 нг ДНК: 50 мкл OptiMEM: 2 мкл трансфекционный реагент: 50 мкл OptiMEM).

3. Подготовка мПСК к трансфекции

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обратной трансфекции подготовьте сосуд для культивирования и проведите мПСК непосредственно перед добавлением реагентов для трансфекции. Для прямой трансфекции пассаж и пластинирование клеток за 12-18 ч до трансфекции, чтобы клетки могли прилипнуть к пластине.

1. Подготовьте сосуд для культивирования клеток, покрытый 0,2% желатином.
   1. Спланируйте количество лунок, необходимых для трансфекции (одна лунка из 24-луночной пластины на обработку/группу).
   2. Добавьте 200 мкл 0,2% раствора желатина в каждую из желаемых лунок в 24-луночной планшете.
   3. Аккуратно встряхните тарелку, чтобы равномерно распределить раствор, убедившись, что он покрывает все дно лунки.
   4. Дайте лункам покрыться не менее 15 минут при комнатной температуре.
   5. Используя вакуумный аспиратор, осторожно удалите остатки желатина из лунок (наклоните пластину, чтобы обеспечить удаление всей жидкости, не соскребая слой желатина).
   6. Добавьте 0,5 мл среды NBiL (шаг 1,3) в каждую лунку и оставьте планшет в инкубаторе для культуры тканей для предварительного нагревания.
2. Пассаж мПСК.
   1. Аликвоту 30 мл промывочного материала (шаг 1,5) в коническую пробирку объемом 50 мл.
   2. Аспирируйте старую среду из чашки для тканевых культур мЭСК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Допустимо использовать несколько техник аспирации. Какой бы метод вы ни выбрали, следите за тем, чтобы клетки не оставались сухими в течение длительного времени (не более 30 с).
   3. Добавьте необходимое количество имеющейся в продаже среды для удаления клеток (1,5 мл для чашки диаметром 10 см, масштаб соответственно, см. Таблицу материалов).
   4. Подождите 3-5 минут, прежде чем пипетировать вверх и вниз 15-20 раз с помощью пипетки P1000 для получения одноклеточной суспензии. Рассмотрите клетки под микроскопом, чтобы убедиться в одноклеточной суспензии.
   5. Переложите ячейки из детачментной среды в пробирку объемом 50 мл, содержащую промывочную среду.
   6. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Отсасывайте промывочный материал, следя за тем, чтобы в пробирке не оставалось остатков жидкости.
   7. Ресуспендируйте гранулу в небольшом объеме промывочного материала (~300 мкл). Подсчитайте клеточную суспензию с помощью гемоцитометра, чтобы получить плотность клеток.

4. Обратная трансфекция мПСК

1. Приготовьте политрансфекционные реагенты в соответствии с шагом 2.
2. Подготовьте сосуд для клеточной культуры и пассажные мПСК в соответствии с шагом 3.
3. Аликвота 200 мкл среды NBiL на пробирки по 1,5 мл, по одной на каждую процедуру.
4. Добавьте 26 мкл смеси реагентов OptiMEM:transfection к смеси DNA:OptiMEM. Быстро и энергично перемешайте реагенты, пипетируя примерно 10 раз. Дайте смеси настояться при комнатной температуре в течение 5 минут.
5. В зависимости от плотности клеток перенесите необходимый объем клеток из суспензии клеток объемом 300 мкл в пробирки NBiL объемом 200 мкл, чтобы получить 25 000 клеток в пробирке.
6. После 5 мин инкубации смеси Липофектамина 2000 (L2K, реагент для трансфекции) и ДНК добавьте его в пробирку клеток объемом 1,5 мл и хорошо перемешайте пипетированием. Дайте клеткам инкубироваться с реагентом в течение 5 минут при комнатной температуре.
7. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин при комнатной температуре. Пипеткой вылейте жидкость, оставив примерно 50 мкл.
8. Ресуспендируйте клеточную гранулу со 100 мкл среды NBiL. Перенесите клетки на тарелку и поместите пластину в инкубатор. Замените носитель через 24 часа на свежий носитель NBiL.

5. Прямая трансфекция мПСК

1. За 12-18 ч до трансфекции подготовьте сосуд для клеточной культуры и пассаж мПСК в соответствии с шагом 3.
2. В зависимости от плотности клеток перенесите необходимый объем клеток из смеси клеток объемом 300 мкл в затравку 25 000 клеток на лунку. Поместите тарелку в инкубатор.
3. За 1 ч до трансфекции отсасывайте среду из всех лунок и замените ее 0,5 мл среды NBiL. Поместите тарелку в инкубатор.
4. Во время трансфекции подготовьте политрансфекционные реагенты mPSC в соответствии с шагом 2.
5. Добавьте 26 мкл смеси реагентов OptiMEM:transfection к смеси DNA:OptiMEM. Быстро и энергично перемешайте реагенты, пипетируя примерно 10 раз. Дайте смешанной смеси настояться при комнатной температуре в течение 5 минут.
6. Добавьте смешанную смесь в лунки по каплям. Поместите тарелку в инкубатор. Замените носитель через 24 часа.

6. Проточная цитометрия

1. Аспирировать среду из трансфицированной 24-луночной планшета через 48 ч после трансфекции.
2. Добавьте 200 мкл трипсина в каждую лунку, перемешайте и инкубируйте в течение 30 секунд при 37 °C. Постучите по стенкам планшета и добавьте 200 мкл ледяного буфера FACS (2% FBS в PBS).
3. Откройте и наклейте этикетку на 96-луночную пластину с V-образным дном, начиная с A1. Смешайте содержимое каждой лунки на трансфицируемой пластине, чтобы сместить клетки и сделать одноклеточные растворы с помощью пипетки P200. Перенесите 200 мкл из каждой лунки в соответствующую лунку на 96-луночном планшете.
4. Добавьте 15 мл буфера FACS в резервуар с реагентом объемом 50 мл. Центрифугируйте планшет при 300 x g в течение 5 минут при комнатной температуре. Выбросьте надосадочную жидкость, быстро и плавно перевернув 96-луночную пластину в раковину.
5. Используйте многоканальную пипетку для ресуспендирования гранул на 96-луночном планшете в 150 мкл буфера FACS из резервуара с реагентом. Повторите шаги 6.4-6.5 дважды. Поместите 96-луночную тарелку в наполненный льдом ящик, защищенный от света.
6. Пропустите образцы через проточный цитометр, чтобы получить распределение популяции флуоресцентных репортеров.
   1. Убедитесь, что цитометр подходит с точки зрения комбинации лазера и фильтра для проводимого эксперимента (например, не используйте инфракрасный репортер, если невозможно возбудить или обнаружить в дальнем красном спектре).
   2. Включите дополнительные образцы для стандартизации шариков, чтобы обеспечить преобразование данных MEFL во время анализа. Убедиться в том, что в каждой пробе собрано достаточное количество клеток для соответствующего статистического анализа⁹.
7. Преобразуйте флуоресцентные единицы из необработанных файлов цитометра и анализируйте данные с помощью любого из нескольких методов, таких как конвейеры на основе Python или MATLAB или коммерчески доступное программное обеспечение ^9,13.

Результаты

Как прямая, так и обратная трансфекция основаны на взаимодействии между клеточной мембраной и входящими комплексами трансфекционного реагента-ДНК, что позволяет доставлять НК клеткам-реципиентам. В чем эти методы различаются, так это в состоянии клетки при доставке - в то время как ДНК...

Обсуждение

Основной причиной широкого распространения протоколов трансфекции является их воспроизводимость и доступность; Тем не менее, эти протоколы требуют оптимизации в экспериментальных контекстах. Выше не упоминается стандартное тестирование, необходимое при попытке трансфекции новой к?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056