טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.

Abstract

בשל פשטותו היחסית וקלות השימוש בו, טרנספקציה חולפת של קווי תאי יונקים עם חומצות גרעין הפכה לעמוד התווך במחקר הביו-רפואי. בעוד שלרוב קווי התאים הנפוצים ביותר יש פרוטוקולים חזקים לטרנספקציה בתרבית דו-ממדית דבקה, פרוטוקולים אלה לעתים קרובות אינם מתורגמים היטב לקווים פחות נחקרים או לאלה עם מורפולוגיות לא טיפוסיות וקשות להעברה. באמצעות שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים של עכברים הגדלים במדיה 2i/LIF, מודל תרבית נפוץ לרפואה רגנרטיבית, שיטה זו מתווה פרוטוקול אופטימלי ומהיר של טרנספקציה הפוכה המסוגל להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. תוך מינוף פרוטוקול זה, מבוצעת פולי-טרנספקציה של שלושה פלסמידים, תוך ניצול היעילות הגבוהה מהרגיל במסירת פלסמיד כדי לחקור טווח מורחב של סטויכיומטריית פלסמיד. פרוטוקול פולי-טרנספקציה הפוך זה מאפשר שיטה ניסיונית של סיר אחד, המאפשר למשתמשים למטב את יחסי הפלסמיד בבאר אחת, במקום על פני מספר טרנספקציות משותפות. על ידי הקלת החקירה המהירה של ההשפעה של סטויכיומטריית DNA על התפקוד הכולל של מעגלים גנטיים מועברים, פרוטוקול זה ממזער את הזמן והעלות של טרנספקציה של תאי גזע עובריים.

Introduction

העברת דנ"א ורנ"א לתאי יונקים משמשת עמוד תווך מרכזי במחקר הביו-רפואי¹. שיטה נפוצה להחדרת חומצות גרעין אקסוגניות (NA) לתאי יונקים היא באמצעות טרנספקציה חולפת ^2,3. טכניקה זו מסתמכת על ערבוב NA עם ריאגנטים טרנספקציה זמינים מסחרית המסוגלים להעביר אותם לתוך התאים המקבלים. בדרך כלל, NA מועבר באמצעות טרנספקציה קדמית, שבה תאים הנצמדים למשטח דו-ממדי מקבלים את קומפלקס הטרנספקציה. בעוד שטרנספקציה קדימה עבור קווי התאים המבוססים הנפוצים ביותר היא חזקה והפרוטוקולים מפורסמים היטב, סוגי תאים נישתיים יותר עם מורפולוגיות לא חד-שכבתיות אינם עוברים בקלות, ומגבילים את כמות ה-NA שניתן להעביר ואת מספר התאים שמקבלים אותה.

תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) משמשים מודל אטרקטיבי להבנת ההתפתחות וככלי לרפואה רגנרטיבית, בהתחשב ביכולתם להתחלק ללא הגבלת זמן ולייצר כל סוג של תא גוף. עבור PSCs של עכברים (mPSCs), תנאי תרבית חוץ גופית שגרתיים עם 2 מעכבים ו-LIF (2i/LIF) שומרים על מורפולוגיה דמוית מושבה דמוית כיפה, ומגבילים ישירות את מספר התאים החשופים להתמרה קדמית ^4,5,6. כדי לטפל בכך, ניתן לבצע טרנספקציה הפוכה: תאים מתווספים לצלחת המכילה מדיה ומגיב טרנספקציה, במקום להוסיף מגיב טרנספקציה לתאים דבקים⁷. בעוד שזה מגדיל את מספר התאים שנחשפו למגיב, זה גם דורש את התאים לעבור ולהדביק בו זמנית.

מעבר לטרנספקציות פשוטות של אנ-איי יחיד, חוקרים שואפים לעתים קרובות להעביר מספר מבנים של אנ-איי לאוכלוסיית תאים במבחנה. זה מושג בדרך כלל באמצעות טרנספקציה משותפת, שבה NAs מעורבבים ביחס נתון (1:1, 9:1, וכו ') ולאחר מכן משולבים עם מגיב transfection שנבחר⁸. זה מניב תערובת של NAs וריאגנט המשמר את היחס המקורי של NAs זה לזה - בעוד תאים בטיפול עשויים לקבל כמויות שונות של תערובת זו, כולם מקבלים את אותו יחס⁹. אמנם זה יתרון כאשר היחס הרצוי של חלקים ידוע, קביעת יחס זה מראש יכול להיות עבודה אינטנסיבית, כאשר כל יחס מהווה תנאי אחר. חלופה אחת היא לבצע "פולי-טרנספקציה", שבה NAs בודדים מעורבבים עם מגיב הטרנספקציה בנפרד זה מזה⁹. על ידי שילוב קומפלקסים של טרנספקציה המכילים NAs בודדים (במקום שילוב NAs לפני יצירת המכלולים), חוקרים יכולים לחקור מגוון רחב של סטויכיומטריה של NA בניסוי טרנספקציה יחיד⁹. זה חשוב במיוחד במקרים שבהם המוצרים של מספר NAs צפויים לקיים אינטראקציה זה עם זה, כגון עם מערכות שעתוק אינדוקטיבי או מערכות עם משוב מובנה 1,10,11. עם זאת, כדי לעשות זאת ביעילות, נדרשת יעילות העברה גבוהה. ואכן, ככל שמספר ה-NAs הייחודיים הנגועים גדל, ההסתברות שתא נתון יקבל את כל ה-NAs הרצויים פוחתת באופן אקספוננציאלי ^9,12.

הדו"ח הבא מתאר פרוטוקול טרנספקציה הפוכה עבור mPSCs באמצעות מגיב טרנספקציה קטיוני מבוסס שומנים, שבו תאים נחשפים לתערובת מגיב-NA למשך 5 דקות לכל היותר כדי למקסם את הכדאיות ולמזער את הזמן מחוץ לתנאי תרבית טיפוסיים. השוואת פרוטוקול זה לטרנספקציה הקדמית הסטנדרטית של תאים אלה מדגימה יעילות טרנספקציה גבוהה יותר ועלייה במספר הכולל של תאים נגועים ששרדו. על ידי שילוב של טרנספקציה הפוכה זו עם פולי-טרנספקציה תלת-פלסמידית הכוללת כתבים פלואורסצנטיים פשוטים, מודגם פוטנציאל מורחב לסינון יחסי NA עם יעילות טרנספקציה גבוהה.

Protocol

1. הכנת ריאגנטים לתרבית mPSC

1. הכינו תוסף N2.
   1. בתנאים לא סטריליים, הכינו את תמיסות המלאי הבאות (שלב 1.1.1.1) במכסה אדים בטיחותי כימי. מוסיפים את האבקה המוצקה של כל כימיקל לצינור חרוטי במשקל 50 מ"ל במשקל מראש. שקלו כל צינורית לאחר הוספת האבקה והוסיפו כמות מתאימה של ממס כדי להשיג את הריכוזים הבאים. עבור אצווה אחת של מדיה, הכן את הסכום המינימלי הרשום.
      הערה: הריאגנטים הבאים מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם להנחיות בטיחות כימיות מקומיות. ודא PPE תקין בעת הטיפול, ועבוד רק עם צורות האבקה המוצקה של כימיקלים אלה במכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה.
      1. מינימום של 0.05 מ"ל נתרן סלניט במים ב 0.518 מ"ג / מ"ל, 0.5 מ"ל של putrescine במים ב 160 מ"ג / מ"ל, 0.165 מ"ל של פרוגסטרון ב 100% אתנול ב 0.6 מ"ג / מ"ל (ראה טבלה של חומרים).
      2. אחסן פתרונות בטמפרטורה של -20°C למשך עד שנתיים.
   2. בארון בטיחות ביולוגית (BSC), הוסף את הפרטים הבאים ל- 58.035 מ"ל של DMEM-F12.
      1. 0.05 מ"ל של תמיסת נתרן סלניט 0.518 מ"ג/מ"ל, 0.5 מ"ל של תמיסת פוטרסין 160 מ"ג/מ"ל, 0.165 מ"ל של תמיסת פרוגסטרון 0.6 מ"ג/מ"ל.
      2. סנן לעקר את התערובת לעיל עם מסנן 0.22 מיקרומטר.
   3. עדיין BSC, להכין פתרון 100 מ"ג / מ"ל של apotransferrin.
      1. הוסף 5 מ"ל של DMEM-F12 ל 500 מ"ג של apotransferrin (ראה טבלה של חומרים). לאט resuspend ולשטוף את המיכל, הימנעות בועות.
      2. לאחר השעיה מחדש והסרה ככל האפשר עם 5 מ"ל, להוסיף אותו לתמיסת סלניט / פוטרסין / פרוגסטרון. קח יותר של הפתרון הקודם לשטוף את בקבוק apotransferrin, מקבל כמה שיותר ממנו החוצה.
   4. הוסף 5 מ"ל של 7.5% BSA חלק V (ראה טבלת חומרים) לתמיסה.
   5. מערבבים ו aliquot 6.875 מ"ל לכל צינור. אחסן aliquots ב -80 ° C למשך עד 1 שנה.
   6. בעת שימוש ב- aliquots N2 לעיל לייצור מדיה N2B27, להפשיר את aliquot הרצוי ולהוסיף 3.125 מ"ל של תמיסת אינסולין 4 מ"ג / מ"ל (ראה טבלה של חומרים) ל 6.875 N2 עבור 10 מ"ל של 100x N2.
2. הכן מדיה בסיסית N2B27.
   1. הפשירו תוספי N2 ו-B27 במקרר בטמפרטורה של 4°C למשך מספר שעות או למשך הלילה.
   2. ב-BSC, יש לערבב 484.5 מ"ל של DMEM-F12 ו-484.5 מ"ל של מדיה נוירובזאלית (ראו טבלת חומרים) בבקבוק סטרילי של 1 ליטר.
   3. הוסף 10 מ"ל של B27 ו 10 מ"ל של תוספת N2 למדיה.
   4. הוסף 1 מ"ל של 55 מ"מ בטא-מרקפטואתנול (ראה טבלת חומרים). הוסף 10 מ"ל של 100x glutamax. מערבבים במרץ על ידי ערבול הבקבוק.
   5. Aliquot את הנפח הרצוי לכל aliquot (בדרך כלל 100 מ"ל) ולאחסן ב -80 ° C עד 1 שנה. יש לאחסן בשימוש לאחר ההפשרה בטמפרטורה של 4°C למשך עד 3 שבועות.
3. הכן מדיה NBiL.
   1. הפשירו אליציטוט של 100 מ"ל של מדיה בזאלית N2B27 מ -80 °C במקרר 4 °C.
   2. ב-BSC, הוסיפו LIF (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/ליטר.
   3. הוסף CHIR99021 (3 מיקרומטר סופי) ו- PD0325901 (1 מיקרומטר סופי) (ראה טבלת חומרים). מערבבים היטב עם פיפטה סרולוגית 50 מ"ל. יש לאחסן ב-4°C למשך עד שבועיים.
4. הכינו תמיסת ג'לטין 0.2%.
   1. מעבירים 500 מ"ל של H₂O מזוקק כפול לבקבוק זכוכית 1 ליטר.
   2. מדדו 1 גרם ג'לטין (ראו טבלת חומרים) והוסיפו אותו למים. מערבבים על ידי ניעור הבקבוק עד שהוא מומס ברובו.
   3. Autoclave תערובת ג'לטין ומים ב 15 psi, 121 ° C במשך 35 דקות. לאחר הקירור, סנן לעקר אותו עם מסנן 0.22 מיקרומטר ב BSC. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.
5. הכינו את אמצעי הכביסה.
   1. ב-BSC, יש לערבב 160 μL של 7.5% BSA לכל 10 מ"ל של DMEM-F12.
   2. הרחב את האמור לעיל והתכונן בכמויות גדולות לשימוש עתידי קל (למשל 8 מ"ל של 7.5% BSA עד 500 מ"ל של DMEM-F12). יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C.

2. הכנת ריאגנטים לפולי-טרנספקציה mPSC

הערה: הערכים הבאים מסופקים עבור באר אחת של צלחת 24 בארות. ניתן לשנות את קנה המידה של ערכים בהתאם. הרצפים של כל הדנ"א/פלסמידים מפורטים בקובץ משלים 1.

1. חשב את נפח תמיסת ה- DNA הדרושה לכל טיפול.
   1. הכינו 500 ננוגרם של דנ"א לכל באר/מצב.
      1. אם מדביקים פלסמיד יחיד בתמיסת DNA של 100 ננוגרם/μL, הכינו צינור אחד עם 5 מיקרוליטר DNA.
      2. אם אתם מדביקים שני פלסמידים ב-100 ננוגרם/מיקרוליטר כל אחד, הכינו שני צינורות עם 2.5 מיקרוליטר בכל אחד, אחד לכל פלסמיד.
2. ב- BSC, בצע את הפעולות הבאות: עבור כל טיפול טרנספקציה של 500 ng (ראה טבלת חומרים), aliquot 25 μL של OptiMEM לתוך צינור 1.5 מ"ל.
   1. קנה מידה זה בהתאם - לדוגמה לעיל, הכן שני צינורות, כל אחד עם 250 ng של DNA (2.5 μL) ו 12.5 μL של OptiMEM.
3. הוסף את נפח הדנ"א הדרוש לטיפול זה ל-OptiMEM שבצינור.
4. עבור כל צינור עם 500 ng DNA ו-OptiMEM, צור צינור תואם עם עוד 25 μL של OptiMEM ו-1 μL של מגיב טרנספקציה קטיוני מבוסס שומנים.
   1. שוב, יש לשנות את קנה המידה של ערכים אלה בהתאם. עבור הדוגמה לעיל, להכין שני צינורות, כל אחד עם 12.5 μL של OptiMEM ו 0.5 μL של מגיב transfection.
      הערה: בעת שינוי קנה מידה של ערכים, השתמש במסת הדנ"א שנוספה ולא בנפח הדרוש לכמות זו של DNA. תגובות עם מגיב טרנספקציה ודנ"א ניתנות לשינוי קנה מידה (למשל, אם 5 בארות אמורות להיות נגועות באותו דנ"א). שמור על יחסי ריאגנטים זהים, אך קנה מידה בהתאם (לדוגמה, 1000 ng DNA: 50 μL OptiMEM: 2 μL מגיב טרנספקציה: 50 μL OptiMEM).

3. הכנת mPSCs עבור transfection

הערה: עבור טרנספקציה הפוכה, הכן את כלי התרבית והעבר את mPSCs ישירות לפני הוספת ריאגנטים transfection. עבור טרנספקציה קדימה, מעבר צלחת את התאים 12-18 שעות לפני transfection כדי לאפשר לתאים להיצמד לצלחת.

1. הכינו כלי תרבית תאים מצופה ג'לטין 0.2%.
   1. תכננו את מספר הבארות הדרושות לטרנספקציה (באר אחת מתוך צלחת של 24 בארות לכל טיפול/קבוצה).
   2. הוסף 200 μL של תמיסת ג'לטין 0.2% לכל אחת מהבארות הרצויות בצלחת 24 הקידוחים.
   3. נערו בעדינות את הצלחת כדי לפזר את התמיסה באופן שווה, וודאו שהיא מכסה את כל תחתית הבאר.
   4. אפשר לצפות את הבארות לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   5. בעזרת שואב ואקום, הסר בזהירות את שאריות הג'לטין מהבארות (הטה את הצלחת כדי להבטיח הסרת כל הנוזלים מבלי לגרד את שכבת הג'לטין).
   6. הוסיפו 0.5 מ"ל של מדיה NBiL (שלב 1.3) לכל באר והשאירו את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לחימום מוקדם.
2. מעבר mPSCs.
   1. Aliquot 30 מ"ל של מדיה לשטוף (שלב 1.5) לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
   2. שאפו את המדיה הישנה מצלחת תרבית הרקמה של mESCs.
      הערה: מספר טכניקות שאיפה מותרות. לא משנה באיזו טכניקה נבחרת, ודא שהתאים אינם נשארים יבשים לפרקי זמן ממושכים (כ -30 שניות לכל היותר).
   3. הוסף את הכמות הנדרשת של אמצעי ניתוק תאים זמין מסחרית (1.5 מ"ל עבור צלחת של 10 ס"מ, קנה מידה בהתאם, ראה טבלת חומרים).
   4. המתינו 3-5 דקות לפני שתעלו וירדו 15-20 פעמים עם פיפטה P1000 כדי לקבל מתלה חד-תאי. הצג תאים תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח השעיה של תא יחיד.
   5. מעבירים את התאים בתווך הניתוק לצינור 50 מ"ל המכיל אמצעי שטיפה.
   6. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. יש לשאוף לשטיפת מדיה, כדי להבטיח שלא יישארו שאריות נוזל בצינור.
   7. השהה מחדש את הגלולה בנפח קטן של אמצעי כביסה (~ 300 μL). ספור את תרחיף התא באמצעות המוציטומטר כדי לקבל את צפיפות התא.

4. טרנספקציה הפוכה של mPSCs

1. הכן ריאגנטים poly-transfection על פי שלב 2.
2. הכינו את כלי תרבית התאים והעבירו קליפות קדם-גזעיות (mPSC) לפי שלב 3.
3. Aliquot 200 μL של מדיה NBiL לצינורות 1.5 מ"ל, אחד לכל טיפול.
4. הוסף 26 μL של תערובת מגיב OptiMEM:transfection לתערובת DNA:OptiMEM. מערבבים את הריאגנטים במהירות ובמרץ על ידי פיפטינג כ-10 פעמים. תנו לתערובת לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
5. בהתבסס על צפיפות התא, העבר את נפח התאים הנדרש מתרחיף התאים של 300 μL לצינורות NBiL של 200 μL כדי לקבל 25,000 תאים לכל צינור.
6. לאחר 5 דקות של דגירה של Lipofectamine 2000 (L2K, מגיב transfection) ותערובת DNA, להוסיף אותו צינור 1.5 מ"ל של תאים ולערבב היטב על ידי pipetting. אפשר לתאים לדגור עם מגיב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
7. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה החוצה את הנוזל, משאיר כ 50 μL.
8. להשעות מחדש את גלולת התא עם 100 μL של מדיה NBiL. מעבירים את התאים לצלחת ומניחים את הצלחת באינקובטור. שנה את המדיה 24 שעות מאוחר יותר עם מדיה NBiL טרייה.

5. העברה קדימה של mPSCs

1. 12-18 שעות לפני הטרנספקציה, הכינו את כלי תרבית התאים ועברו mPSCs לפי שלב 3.
2. בהתבסס על צפיפות התא, להעביר את נפח התאים הנדרש מתערובת תאים 300 μL לזרע 25,000 תאים לכל באר. מניחים את הצלחת באינקובטור.
3. 1 שעה לפני transfection, לשאוף את התקשורת מכל הבארות ולהחליף אותו עם 0.5 מ"ל של מדיה NBiL. מניחים את הצלחת באינקובטור.
4. בזמן הטרנספקציה, הכינו ריאגנטים פולי-טרנספקציה mPSC לפי שלב 2.
5. הוסף 26 μL של תערובת מגיב OptiMEM:transfection לתערובת DNA:OptiMEM. מערבבים את הריאגנטים במהירות ובמרץ על ידי פיפטינג כ-10 פעמים. תנו לתערובת המשולבת לדגור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
6. מוסיפים את התערובת המשולבת לבארות טיפתית. מניחים את הצלחת באינקובטור. שנה את המדיה 24 שעות מאוחר יותר.

6. ציטומטריית זרימה

1. לשאוף את התקשורת מן צלחת 24-באר transfected 48 שעות לאחר transfection.
2. הוסיפו 200 מיקרוליטר טריפסין לכל באר, ערבלו ודגרו במשך 30 שניות ב-37°C. הקש על דפנות הצלחת והוסף 200 μL של מאגר FACS קר כקרח (2% FBS ב- PBS).
3. פתח ותייג צלחת V תחתונה של 96 בארות, החל מ- A1. ערבבו את התוכן של כל באר על הצלחת הנגועה כדי לעקור תאים וליצור תמיסות חד-תאיות עם פיפטה P200. מעבירים 200 μL מכל באר לבאר המתאימה על צלחת 96 בארות.
4. הוסף 15 מ"ל של מאגר FACS למאגר מגיבים של 50 מ"ל. צנטריפוגה את הצלחת ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט על ידי היפוך צלחת 96 הבארות לתוך הכיור בתנועה מהירה וחלקה.
5. השתמש פיפטה רב ערוצית כדי להשעות מחדש את הכדוריות על צלחת 96 באר ב 150 μL של חיץ FACS מן המאגר מגיב. חזור על שלבים 6.4-6.5 פעמיים. הניחו את הצלחת בת 96 הבארות בקופסה מלאה בקרח המוגנת מפני אור.
6. הפעל את הדגימות דרך ציטומטר זרימה כדי לקבל את התפלגות האוכלוסייה של כתבי הפלואורסצנט.
   1. ודא שהציטומטר מתאים מבחינת שילובי לייזר ומסנן לביצוע הניסוי (למשל, אל תשתמש בכתב אינפרא אדום אם לא ניתן לעורר או לזהות בספקטרום האדום הרחוק).
   2. כלול דוגמאות נוספות לחרוזי תקינה כדי לאפשר המרת נתונים באמצעות MEFL במהלך הניתוח. ודא כי מספיק תאים נאספים לכל מדגם לניתוח סטטיסטי מתאים⁹.
7. המר יחידות פלואורסצנטיות מקבצי הציטומטר הגולמי ונתח את הנתונים באמצעות כל אחת מכמה שיטות, כגון צינורות מבוססי Python או MATLAB או תוכנה זמינה מסחרית ^9,13.

תוצאות

הן טרנספקציות קדימה והן טרנספקציה לאחור מסתמכות על האינטראקציה בין קרום התא לבין קומפלקסים של מגיב-דנ"א טרנספקציה נכנסים, המאפשרים העברה של NA לתאים המקבלים. ההבדל בין טכניקות אלה הוא מצב התא בעת הלידה - בעוד שהדנ"א מועבר בדרך כלל לחד-שכבות של תאים דבקים בטרנספקציה קדמית מסורתית, טרנספקציה ?...

Discussion

סיבה מרכזית לאימוץ הנרחב של פרוטוקולי טרנספקציה היא יכולת השחזור והנגישות שלהם; עם זאת, פרוטוקולים אלה דורשים אופטימיזציה על פני הקשרים ניסיוניים. לא הוזכרה לעיל הבדיקה הסטנדרטית הנדרשת כאשר מנסים לבצע טרנספורמציה של קו תאים חדש בפעם הראשונה. ראשית, הבחירה בריאגנטים טרנספקציה היא המפתח, ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056