A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.

Abstract

בשל פשטותו היחסית וקלות השימוש בו, טרנספקציה חולפת של קווי תאי יונקים עם חומצות גרעין הפכה לעמוד התווך במחקר הביו-רפואי. בעוד שלרוב קווי התאים הנפוצים ביותר יש פרוטוקולים חזקים לטרנספקציה בתרבית דו-ממדית דבקה, פרוטוקולים אלה לעתים קרובות אינם מתורגמים היטב לקווים פחות נחקרים או לאלה עם מורפולוגיות לא טיפוסיות וקשות להעברה. באמצעות שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים של עכברים הגדלים במדיה 2i/LIF, מודל תרבית נפוץ לרפואה רגנרטיבית, שיטה זו מתווה פרוטוקול אופטימלי ומהיר של טרנספקציה הפוכה המסוגל להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. תוך מינוף פרוטוקול זה, מבוצעת פולי-טרנספקציה של שלושה פלסמידים, תוך ניצול היעילות הגבוהה מהרגיל במסירת פלסמיד כדי לחקור טווח מורחב של סטויכיומטריית פלסמיד. פרוטוקול פולי-טרנספקציה הפוך זה מאפשר שיטה ניסיונית של סיר אחד, המאפשר למשתמשים למטב את יחסי הפלסמיד בבאר אחת, במקום על פני מספר טרנספקציות משותפות. על ידי הקלת החקירה המהירה של ההשפעה של סטויכיומטריית DNA על התפקוד הכולל של מעגלים גנטיים מועברים, פרוטוקול זה ממזער את הזמן והעלות של טרנספקציה של תאי גזע עובריים.

Introduction

העברת דנ"א ורנ"א לתאי יונקים משמשת עמוד תווך מרכזי במחקר הביו-רפואי1. שיטה נפוצה להחדרת חומצות גרעין אקסוגניות (NA) לתאי יונקים היא באמצעות טרנספקציה חולפת 2,3. טכניקה זו מסתמכת על ערבוב NA עם ריאגנטים טרנספקציה זמינים מסחרית המסוגלים להעביר אותם לתוך התאים המקבלים. בדרך כלל, NA מועבר באמצעות טרנספקציה קדמית, שבה תאים הנצמדים למשטח דו-ממדי מקבלים את קומפלקס הטרנספקציה. בעוד שטרנספקציה קדימה עבור קווי התאים המבוססים הנפוצים ביותר היא חזקה והפרוטוקולים מפורסמים היטב, סוגי תאים נישתיים יותר עם מורפולוגיות לא חד-שכבתיות אינם עוברים בקלות, ומגבילים את כמות ה-NA שניתן לה....

Protocol

1. הכנת ריאגנטים לתרבית mPSC

  1. הכינו תוסף N2.
    1. בתנאים לא סטריליים, הכינו את תמיסות המלאי הבאות (שלב 1.1.1.1) במכסה אדים בטיחותי כימי. מוסיפים את האבקה המוצקה של כל כימיקל לצינור חרוטי במשקל 50 מ"ל במשקל מראש. שקלו כל צינורית לאחר הוספת האבקה והוסיפו כמות מתאימה של ממס כדי להשיג את הריכוזים הבאים. עבור אצווה אחת של מדיה, הכן את הסכום המינימלי הרשום.
      הערה: הריאגנטים הבאים מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם להנחיות בטיחות כימיות מקומיות. ודא PPE תקין בעת הטיפול, ועבוד רק עם צורות האבקה המוצקה של כימיקלים אלה במכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה.
      1. מינימום של 0.05 מ"ל נתרן סלניט במים ב 0.518 מ"ג / מ"ל, 0.5 מ"ל של putrescine במים ב 160 מ"ג / מ"ל, ....

תוצאות

הן טרנספקציות קדימה והן טרנספקציה לאחור מסתמכות על האינטראקציה בין קרום התא לבין קומפלקסים של מגיב-דנ"א טרנספקציה נכנסים, המאפשרים העברה של NA לתאים המקבלים. ההבדל בין טכניקות אלה הוא מצב התא בעת הלידה - בעוד שהדנ"א מועבר בדרך כלל לחד-שכבות של תאים דבקים בטרנספקציה קדמית מסורתית, טרנספקציה ?.......

Discussion

סיבה מרכזית לאימוץ הנרחב של פרוטוקולי טרנספקציה היא יכולת השחזור והנגישות שלהם; עם זאת, פרוטוקולים אלה דורשים אופטימיזציה על פני הקשרים ניסיוניים. לא הוזכרה לעיל הבדיקה הסטנדרטית הנדרשת כאשר מנסים לבצע טרנספורמציה של קו תאים חדש בפעם הראשונה. ראשית, הבחירה בריאגנטים טרנספקציה היא המפתח, .......

Disclosures

המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות על התרומות הרבות לתחום שלא צוינו בעבודה זו בשל מגבלות מקום, כמו גם על סוכנויות המימון שסיפקו הזדמנות זו. המחברים מודים על מימון ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ומהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), שתמכו בעבודה זו. ק.מ. זכה במלגת CGS-M מטעם NSERC ובמלגת קילאם לדוקטורט מאוניברסיטת קולומביה הבריטית. נ.ס. זכה בפרס Michael Smith Health Research BC Scholar Award.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Accutase MilliporeSigmaSCR005
Apotransferrin MilliporeSigmaT1147-500MG
B27 supplement ThermoFisher Scientific 17504044
Beta-mercaptoethanolThermoFisher Scientific 21985023
BSA fraction V (7.5%)Gibco15260-037
CHIR99021 MilliporeSigmaSML1046-25MG
DMEM-F12MilliporeSigmaD6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beadsSpherotechURCP-38-2K
Gelatin MilliporeSigmaG1890
GlutaMAX supplement ThermoFisher Scientific 35050061
Insulin Gibco12585-0014
Lipofectamine 2000 Invitrogen11668-019Transfection reagent
Neurobasal mediaThermoFisher Scientific 21103049
OptiMEM Invitrogen31985-070
PD0325901 MilliporeSigmaPZ0162-25MG
ProgesteroneMilliporeSigmaP8783Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
PutrescineMilliporeSigmaP6780Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF BioTechne8878-LF-500/CF
Sodium selenite MilliporeSigmaS5261-25GChemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTAThermoFisher Scientific 25200056

References

  1. Shakiba, N., Jones, R. D., Weiss, R., Del Vecchio, D. Context-aware synthetic biology by controller design: Engineering the mammalian cell. Cell Systems. 12 (6), 561-592 (2021).
  2. Fus-Kujawa, A., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

202

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved