A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.
בשל פשטותו היחסית וקלות השימוש בו, טרנספקציה חולפת של קווי תאי יונקים עם חומצות גרעין הפכה לעמוד התווך במחקר הביו-רפואי. בעוד שלרוב קווי התאים הנפוצים ביותר יש פרוטוקולים חזקים לטרנספקציה בתרבית דו-ממדית דבקה, פרוטוקולים אלה לעתים קרובות אינם מתורגמים היטב לקווים פחות נחקרים או לאלה עם מורפולוגיות לא טיפוסיות וקשות להעברה. באמצעות שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים של עכברים הגדלים במדיה 2i/LIF, מודל תרבית נפוץ לרפואה רגנרטיבית, שיטה זו מתווה פרוטוקול אופטימלי ומהיר של טרנספקציה הפוכה המסוגל להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. תוך מינוף פרוטוקול זה, מבוצעת פולי-טרנספקציה של שלושה פלסמידים, תוך ניצול היעילות הגבוהה מהרגיל במסירת פלסמיד כדי לחקור טווח מורחב של סטויכיומטריית פלסמיד. פרוטוקול פולי-טרנספקציה הפוך זה מאפשר שיטה ניסיונית של סיר אחד, המאפשר למשתמשים למטב את יחסי הפלסמיד בבאר אחת, במקום על פני מספר טרנספקציות משותפות. על ידי הקלת החקירה המהירה של ההשפעה של סטויכיומטריית DNA על התפקוד הכולל של מעגלים גנטיים מועברים, פרוטוקול זה ממזער את הזמן והעלות של טרנספקציה של תאי גזע עובריים.
העברת דנ"א ורנ"א לתאי יונקים משמשת עמוד תווך מרכזי במחקר הביו-רפואי1. שיטה נפוצה להחדרת חומצות גרעין אקסוגניות (NA) לתאי יונקים היא באמצעות טרנספקציה חולפת 2,3. טכניקה זו מסתמכת על ערבוב NA עם ריאגנטים טרנספקציה זמינים מסחרית המסוגלים להעביר אותם לתוך התאים המקבלים. בדרך כלל, NA מועבר באמצעות טרנספקציה קדמית, שבה תאים הנצמדים למשטח דו-ממדי מקבלים את קומפלקס הטרנספקציה. בעוד שטרנספקציה קדימה עבור קווי התאים המבוססים הנפוצים ביותר היא חזקה והפרוטוקולים מפורסמים היטב, סוגי תאים נישתיים יותר עם מורפולוגיות לא חד-שכבתיות אינם עוברים בקלות, ומגבילים את כמות ה-NA שניתן לה....
1. הכנת ריאגנטים לתרבית mPSC
הן טרנספקציות קדימה והן טרנספקציה לאחור מסתמכות על האינטראקציה בין קרום התא לבין קומפלקסים של מגיב-דנ"א טרנספקציה נכנסים, המאפשרים העברה של NA לתאים המקבלים. ההבדל בין טכניקות אלה הוא מצב התא בעת הלידה - בעוד שהדנ"א מועבר בדרך כלל לחד-שכבות של תאים דבקים בטרנספקציה קדמית מסורתית, טרנספקציה ?.......
סיבה מרכזית לאימוץ הנרחב של פרוטוקולי טרנספקציה היא יכולת השחזור והנגישות שלהם; עם זאת, פרוטוקולים אלה דורשים אופטימיזציה על פני הקשרים ניסיוניים. לא הוזכרה לעיל הבדיקה הסטנדרטית הנדרשת כאשר מנסים לבצע טרנספורמציה של קו תאים חדש בפעם הראשונה. ראשית, הבחירה בריאגנטים טרנספקציה היא המפתח, .......
המחברים אינם מדווחים על ניגודי עניינים.
המחברים מבקשים להודות על התרומות הרבות לתחום שלא צוינו בעבודה זו בשל מגבלות מקום, כמו גם על סוכנויות המימון שסיפקו הזדמנות זו. המחברים מודים על מימון ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (NSERC) ומהמכונים הקנדיים לחקר הבריאות (CIHR), שתמכו בעבודה זו. ק.מ. זכה במלגת CGS-M מטעם NSERC ובמלגת קילאם לדוקטורט מאוניברסיטת קולומביה הבריטית. נ.ס. זכה בפרס Michael Smith Health Research BC Scholar Award.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Accutase | MilliporeSigma | SCR005 | |
Apotransferrin | MilliporeSigma | T1147-500MG | |
B27 supplement | ThermoFisher Scientific | 17504044 | |
Beta-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | 21985023 | |
BSA fraction V (7.5%) | Gibco | 15260-037 | |
CHIR99021 | MilliporeSigma | SML1046-25MG | |
DMEM-F12 | MilliporeSigma | D6421-24X500ML | |
Flow cytometry standardization beads | Spherotech | URCP-38-2K | |
Gelatin | MilliporeSigma | G1890 | |
GlutaMAX supplement | ThermoFisher Scientific | 35050061 | |
Insulin | Gibco | 12585-0014 | |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | Transfection reagent |
Neurobasal media | ThermoFisher Scientific | 21103049 | |
OptiMEM | Invitrogen | 31985-070 | |
PD0325901 | MilliporeSigma | PZ0162-25MG | |
Progesterone | MilliporeSigma | P8783 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
Putrescine | MilliporeSigma | P6780 | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
Recombinant mLIF | BioTechne | 8878-LF-500/CF | |
Sodium selenite | MilliporeSigma | S5261-25G | Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood |
Trypsin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 25200056 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved