טכניקת פולי-טרנספקציה הפוכה אופטימלית מבוססת תאי גזע עובריים של עכבר לחקירה מהירה של יחסי חומצות גרעין

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה לפולי-טרנספקציה הפוכה של תאי גזע עובריים של עכברים במהלך תרבית עם מדיה 2i ו-LIF. שיטה זו מניבה כדאיות ויעילות גבוהות יותר מאשר פרוטוקולי העברה קדימה מסורתיים, תוך שהיא מאפשרת גם אופטימיזציה של יחסי פלסמיד בסיר אחד.

Abstract

בשל פשטותו היחסית וקלות השימוש בו, טרנספקציה חולפת של קווי תאי יונקים עם חומצות גרעין הפכה לעמוד התווך במחקר הביו-רפואי. בעוד שלרוב קווי התאים הנפוצים ביותר יש פרוטוקולים חזקים לטרנספקציה בתרבית דו-ממדית דבקה, פרוטוקולים אלה לעתים קרובות אינם מתורגמים היטב לקווים פחות נחקרים או לאלה עם מורפולוגיות לא טיפוסיות וקשות להעברה. באמצעות שימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים של עכברים הגדלים במדיה 2i/LIF, מודל תרבית נפוץ לרפואה רגנרטיבית, שיטה זו מתווה פרוטוקול אופטימלי ומהיר של טרנספקציה הפוכה המסוגל להשיג יעילות טרנספקציה גבוהה יותר. תוך מינוף פרוטוקול זה, מבוצעת פולי-טרנספקציה של שלושה פלסמידים, תוך ניצול היעילות הגבוהה מהרגיל במסירת פלסמיד כדי לחקור טווח מורחב של סטויכיומטריית פלסמיד. פרוטוקול פולי-טרנספקציה הפוך זה מאפשר שיטה ניסיונית של סיר אחד, המאפשר למשתמשים למטב את יחסי הפלסמיד בבאר אחת, במקום על פני מספר טרנספקציות משותפות. על ידי הקלת החקירה המהירה של ההשפעה של סטויכיומטריית DNA על התפקוד הכולל של מעגלים גנטיים מועברים, פרוטוקול זה ממזער את הזמן והעלות של טרנספקציה של תאי גזע עובריים.

Introduction

העברת דנ"א ורנ"א לתאי יונקים משמשת עמוד תווך מרכזי במחקר הביו-רפואי¹. שיטה נפוצה להחדרת חומצות גרעין אקסוגניות (NA) לתאי יונקים היא באמצעות טרנספקציה חולפת ^2,3. טכניקה זו מסתמכת על ערבוב NA עם ריאגנטים טרנספקציה זמינים מסחרית המסוגלים להעביר אותם לתוך התאים המקבלים. בדרך כלל, NA מועבר באמצעות טרנספקציה קדמית, שבה תאים הנצמדים למשטח דו-ממדי מקבלים את קומפלקס הטרנספקציה. בעוד שטרנספקציה קדימה עבור קווי התאים המבוססים הנפוצים ביותר היא חזקה והפרוטוקולים מפורסמים היטב, סוגי תאים נישתיים יותר עם מורפולוגיות לא חד-שכבתיות אינם עוברים בקלות, ומגבילים את כמות ה-NA שניתן לה....

Protocol

1. הכנת ריאגנטים לתרבית mPSC

1. הכינו תוסף N2.
   1. בתנאים לא סטריליים, הכינו את תמיסות המלאי הבאות (שלב 1.1.1.1) במכסה אדים בטיחותי כימי. מוסיפים את האבקה המוצקה של כל כימיקל לצינור חרוטי במשקל 50 מ"ל במשקל מראש. שקלו כל צינורית לאחר הוספת האבקה והוסיפו כמות מתאימה של ממס כדי להשיג את הריכוזים הבאים. עבור אצווה אחת של מדיה, הכן את הסכום המינימלי הרשום.
      הערה: הריאגנטים הבאים מסוכנים ויש לטפל בהם בהתאם להנחיות בטיחות כימיות מקומיות. ודא PPE תקין בעת הטיפול, ועבוד רק עם צורות האבקה המוצקה של כימיקלים אלה במכסה אדים כימי כדי למנוע שאיפה.
      1. מינימום של 0.05 מ"ל נתרן סלניט במים ב 0.518 מ"ג / מ"ל, 0.5 מ"ל של putrescine במים ב 160 מ"ג / מ"ל, ....

תוצאות

הן טרנספקציות קדימה והן טרנספקציה לאחור מסתמכות על האינטראקציה בין קרום התא לבין קומפלקסים של מגיב-דנ"א טרנספקציה נכנסים, המאפשרים העברה של NA לתאים המקבלים. ההבדל בין טכניקות אלה הוא מצב התא בעת הלידה - בעוד שהדנ"א מועבר בדרך כלל לחד-שכבות של תאים דבקים בטרנספקציה קדמית מסורתית, טרנספקציה ?.......

Discussion

סיבה מרכזית לאימוץ הנרחב של פרוטוקולי טרנספקציה היא יכולת השחזור והנגישות שלהם; עם זאת, פרוטוקולים אלה דורשים אופטימיזציה על פני הקשרים ניסיוניים. לא הוזכרה לעיל הבדיקה הסטנדרטית הנדרשת כאשר מנסים לבצע טרנספורמציה של קו תאים חדש בפעם הראשונה. ראשית, הבחירה בריאגנטים טרנספקציה היא המפתח, .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056