Una técnica optimizada de politransfección inversa basada en células madre embrionarias de ratón para la exploración rápida de las proporciones de ácidos nucleicos

Resumen

El presente protocolo describe un método para la poli-transfección inversa de células madre embrionarias de ratón durante el cultivo con medios 2i y LIF. Este método produce una mayor viabilidad y eficiencia que los protocolos tradicionales de transfección directa, al tiempo que permite la optimización de las proporciones de plásmidos en un solo recipiente.

Resumen

Debido a su relativa simplicidad y facilidad de uso, la transfección transitoria de líneas celulares de mamíferos con ácidos nucleicos se ha convertido en un pilar de la investigación biomédica. Si bien la mayoría de las líneas celulares ampliamente utilizadas tienen protocolos sólidos para la transfección en cultivos bidimensionales adherentes, estos protocolos a menudo no se traducen bien a líneas menos estudiadas o con morfologías atípicas y difíciles de transfectar. Utilizando células madre pluripotentes de ratón cultivadas en medios 2i/LIF, un modelo de cultivo ampliamente utilizado para la medicina regenerativa, este método describe un protocolo de transfección inversa rápido y optimizado capaz de lograr una mayor eficiencia de transfección. Aprovechando este protocolo, se realiza una politransfección de tres plásmidos, aprovechando la eficiencia más alta de lo normal en la administración de plásmidos para estudiar un rango ampliado de estequiometría de plásmidos. Este protocolo de poli-transfección inversa permite un método experimental de un solo recipiente, lo que permite a los usuarios optimizar las proporciones de plásmidos en un solo pocillo, en lugar de en varias co-transfecciones. Al facilitar la exploración rápida del efecto de la estequiometría del ADN en la función general de los circuitos genéticos administrados, este protocolo minimiza el tiempo y el costo de la transfección de células madre embrionarias.

Introducción

La entrega de ADN y ARN a las células de mamíferos es un pilar fundamental^{de la investigación} biomédica. Un método común para introducir ácidos nucleicos exógenos (NA) en células de mamíferos es a través de la transfección transitoria ^2,3. Esta técnica se basa en la mezcla de NA con reactivos de transfección disponibles en el mercado capaces de administrarlos en las células receptoras. Normalmente, la NA se administra a través de la transfección directa, en la que las células que se adhieren a una superficie bidimensional reciben el complejo de transfección. Si bie....

Protocolo

1. Preparación de reactivos para cultivo de mPSC

1. Prepara el suplemento de N2.
   1. En condiciones no estériles, prepare las siguientes soluciones madre (paso 1.1.1.1) en una campana de seguridad química. Agregue el polvo sólido de cada producto químico a un tubo cónico de 50 ml previamente pesado. Pesa cada tubo después de agregar el polvo y agrega una cantidad adecuada de solvente para lograr las concentraciones a continuación. Para un lote de medios, prepare la cantidad mínima indicada.
      NOTA: Los siguientes reactivos son peligrosos y deben manipularse de acuerdo con las pautas locales de seguridad química. Asegúrese de que el EPP sea ....

Discusión

Una razón clave para la adopción generalizada de protocolos de transfección es su reproducibilidad y accesibilidad; Sin embargo, estos protocolos requieren optimización en todos los contextos experimentales. No se mencionó anteriormente la prueba estándar requerida cuando se intenta transfectar una nueva línea celular por primera vez. En primer lugar, la elección del reactivo de transfección es clave, ya que los reactivos disponibles en el mercado no son iguales para todos y variará en la eficiencia de la viabi.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056