Una técnica optimizada de politransfección inversa basada en células madre embrionarias de ratón para la exploración rápida de las proporciones de ácidos nucleicos

Resumen

El presente protocolo describe un método para la poli-transfección inversa de células madre embrionarias de ratón durante el cultivo con medios 2i y LIF. Este método produce una mayor viabilidad y eficiencia que los protocolos tradicionales de transfección directa, al tiempo que permite la optimización de las proporciones de plásmidos en un solo recipiente.

Resumen

Debido a su relativa simplicidad y facilidad de uso, la transfección transitoria de líneas celulares de mamíferos con ácidos nucleicos se ha convertido en un pilar de la investigación biomédica. Si bien la mayoría de las líneas celulares ampliamente utilizadas tienen protocolos sólidos para la transfección en cultivos bidimensionales adherentes, estos protocolos a menudo no se traducen bien a líneas menos estudiadas o con morfologías atípicas y difíciles de transfectar. Utilizando células madre pluripotentes de ratón cultivadas en medios 2i/LIF, un modelo de cultivo ampliamente utilizado para la medicina regenerativa, este método describe un protocolo de transfección inversa rápido y optimizado capaz de lograr una mayor eficiencia de transfección. Aprovechando este protocolo, se realiza una politransfección de tres plásmidos, aprovechando la eficiencia más alta de lo normal en la administración de plásmidos para estudiar un rango ampliado de estequiometría de plásmidos. Este protocolo de poli-transfección inversa permite un método experimental de un solo recipiente, lo que permite a los usuarios optimizar las proporciones de plásmidos en un solo pocillo, en lugar de en varias co-transfecciones. Al facilitar la exploración rápida del efecto de la estequiometría del ADN en la función general de los circuitos genéticos administrados, este protocolo minimiza el tiempo y el costo de la transfección de células madre embrionarias.

Introducción

La entrega de ADN y ARN a las células de mamíferos es un pilar fundamental^{de la investigación} biomédica. Un método común para introducir ácidos nucleicos exógenos (NA) en células de mamíferos es a través de la transfección transitoria ^2,3. Esta técnica se basa en la mezcla de NA con reactivos de transfección disponibles en el mercado capaces de administrarlos en las células receptoras. Normalmente, la NA se administra a través de la transfección directa, en la que las células que se adhieren a una superficie bidimensional reciben el complejo de transfección. Si bien la transfección directa para las líneas celulares establecidas más comunes es robusta y los protocolos están bien publicados, los tipos de células más nicho con morfologías no monocapa no transfectan fácilmente, lo que limita la cantidad de NA que se puede administrar y el número de células que la reciben.

Las células madre pluripotentes (PSC) sirven como un modelo atractivo para comprender el desarrollo y como herramienta para la medicina regenerativa, dada su capacidad para dividirse indefinidamente y producir cualquier tipo de célula corporal. En el caso de las PSC de ratón (mPSC), las condiciones de cultivo in vitro de rutina con 2 inhibidores y LIF (2i/LIF) mantienen una morfología de colonia en forma de cúpula, lo que limita directamente el número de células expuestas a una transfección directa ^4,5,6. Para abordar esto, se puede realizar una transfección inversa: las células se agregan a una placa que contiene medios y reactivo de transfección, en lugar de agregar reactivo de transfección a las células adherentes⁷. Si bien esto aumenta el número de células expuestas al reactivo, también requiere que las células pasen y transfecten simultáneamente.

Más allá de las simples transfecciones de NA únicas, los investigadores a menudo tienen como objetivo administrar varias construcciones de NA en una población de células in vitro. Por lo general, esto se logra a través de una co-transfección, donde los NA se mezclan en una proporción determinada (1:1, 9:1, etc.) y luego se combinan con el reactivo de transfección elegido⁸. Esto produce una mezcla de NA y reactivo que conserva la proporción original de NA entre sí: si bien las células en el tratamiento pueden recibir diferentes cantidades de esta mezcla, todas reciben la misma proporción⁹. Si bien esto es ventajoso cuando se conoce la proporción deseada de piezas, determinar esta relación con anticipación puede requerir mucha mano de obra, ya que cada proporción constituye una condición diferente. Una alternativa es realizar una "poli-transfección", en la que los NA individuales se mezclan con el reactivo de transfección de forma independiente entre sí⁹. Al combinar complejos de transfección que contienen NA individuales (en lugar de combinar NA antes de crear los complejos), los investigadores pueden explorar una amplia gama de estequiometrías de NA en un solo experimento de transfección⁹. Esto es particularmente valioso en los casos en los que se espera que los productos de varios NA interactúen entre sí, como en el caso de los sistemas de transcripción inducibles o los sistemas con retroalimentación incorporada en ^1,10,11. Sin embargo, para hacerlo de manera efectiva, se necesita una alta eficiencia de transfección. De hecho, a medida que aumenta el número de NA transfectadas únicas, la probabilidad de que una célula dada reciba todas las NA deseadas disminuye exponencialmente ^9,12.

El siguiente informe describe un protocolo de transfección inversa para mPSC utilizando un reactivo de transfección basado en lípidos catiónicos, en el que las células se exponen a la mezcla de reactivo y NA durante un máximo de 5 minutos para maximizar la viabilidad y minimizar el tiempo fuera de las condiciones típicas de cultivo. La comparación de este protocolo con la transfección directa estándar de estas células demuestra una mayor eficiencia de transfección y un aumento en el número total de células transfectadas supervivientes. Al combinar esta transfección inversa con una politransfección de tres plásmidos que involucra reporteros fluorescentes simples, se demuestra un potencial ampliado para detectar proporciones de NA con alta eficiencia de transfección.

Protocolo

1. Preparación de reactivos para cultivo de mPSC

1. Prepara el suplemento de N2.
   1. En condiciones no estériles, prepare las siguientes soluciones madre (paso 1.1.1.1) en una campana de seguridad química. Agregue el polvo sólido de cada producto químico a un tubo cónico de 50 ml previamente pesado. Pesa cada tubo después de agregar el polvo y agrega una cantidad adecuada de solvente para lograr las concentraciones a continuación. Para un lote de medios, prepare la cantidad mínima indicada.
      NOTA: Los siguientes reactivos son peligrosos y deben manipularse de acuerdo con las pautas locales de seguridad química. Asegúrese de que el EPP sea adecuado cuando lo manipule y solo trabaje con las formas sólidas en polvo de estos productos químicos en una campana de extracción de gases químicos para evitar la inhalación.
      1. Mínimo de 0,05 mL de selenito de sodio en agua a 0,518 mg/mL, 0,5 mL de putrescina en agua a 160 mg/mL, 0,165 mL de progesterona en etanol al 100% a 0,6 mg/mL (ver Tabla de Materiales).
      2. Almacene las soluciones a -20 °C durante un máximo de 2 años.
   2. En una cabina de bioseguridad (BSC, por sus siglas en inglés), agregue lo siguiente a 58.035 mL de DMEM-F12.
      1. 0,05 ml de una solución de selenito de sodio de 0,518 mg/ml, 0,5 ml de una solución de putrescina de 160 mg/ml, 0,165 ml de una solución de progesterona de 0,6 mg/ml.
      2. Filtro: esterilice la mezcla anterior con un filtro de 0,22 μm.
   3. Todavía en el BSC, prepare una solución de 100 mg/ml de apotransferrina.
      1. Añadir 5 mL de DMEM-F12 a 500 mg de apotransferrina (ver Tabla de Materiales). Vuelva a suspender y lavar lentamente el recipiente, evitando burbujas.
      2. Después de resuspender y eliminar tanto como sea posible con 5 ml, agréguelo a la solución de selenita/putrescina/progesterona. Tome más de la solución anterior y lave el frasco de apotransferrina, sacando la mayor cantidad posible.
   4. Agregue 5 mL de fracción V de BSA al 7,5% (consulte la Tabla de materiales) a la solución.
   5. Mezclar y alícuota 6.875 mL por tubo. Almacene las alícuotas a -80 °C durante un máximo de 1 año.
   6. Cuando utilice las alícuotas de N2 anteriores para fabricar medios de N2B27, descongele la alícuota deseada y agregue 3,125 ml de una solución de insulina de 4 mg/ml (consulte la tabla de materiales) a los 6,875 N2 para 10 ml de 100x N2.
2. Prepare el medio basal N2B27.
   1. Descongele los suplementos de N2 y B27 en una nevera a 4 °C durante unas horas o toda la noche.
   2. En un BSC, mezcle 484,5 ml de DMEM-F12 y 484,5 ml de medios neurobasales (ver Tabla de materiales) en un frasco estéril de 1 L.
   3. Agregue 10 ml de suplemento de B27 y 10 ml de suplemento de N2 al medio.
   4. Añadir 1 mL de beta-mercaptoetanol 55 mM (ver Tabla de Materiales). Agregue 10 ml de glutamax 100x. Mezcle vigorosamente girando la botella.
   5. Alícuota: el volumen deseado por alícuota (normalmente 100 ml) y almacenar a -80 °C durante un máximo de 1 año. Conservar en uso después de descongelar a 4 °C durante un máximo de 3 semanas.
3. Prepare los medios NBiL.
   1. Descongelar una alícuota de 100 ml de medio basal N2B27 a -80 °C en el frigorífico a 4 °C.
   2. En un BSC, agregue LIF (ver Tabla de Materiales) a una concentración final de 10 μg/L.
   3. Añadir CHIR99021 (3 μM final) y PD0325901 (1 μM final) (ver Tabla de Materiales). Mezclar bien con una pipeta serológica de 50 ml. Conservar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
4. Prepara una solución de gelatina al 0,2%.
   1. Transfiera 500 ml de H₂O de doble destilación a una botella de vidrio de 1 L.
   2. Mide 1 g de gelatina (ver Tabla de Materiales) y agrégala al agua. Mezcle agitando la botella hasta que se disuelva en su mayor parte.
   3. Autoclave la mezcla de gelatina y agua a 15 psi, 121 °C durante 35 min. Una vez enfriado, esterilizarlo con un filtro de 0,22 μm en un BSC. Conservar a 4 °C.
5. Prepare los medios de lavado.
   1. En un BSC, mezcle 160 μl de BSA al 7,5% por cada 10 ml de DMEM-F12.
   2. Escale lo anterior y prepárese en grandes cantidades para facilitar su uso futuro (por ejemplo, 8 ml de BSA al 7,5 % a 500 ml de DMEM-F12). Conservar a 4 °C.

2. Preparación de reactivos para la politransfección de mPSC

NOTA: Se proporcionan los siguientes valores para un solo pocillo de una placa de 24 pocillos. Los valores se pueden escalar en consecuencia. Las secuencias de todos los ADN/plásmidos se detallan en el Archivo Suplementario 1.

1. Calcule el volumen de solución de ADN necesario por tratamiento.
   1. Prepare 500 ng de ADN por pocillo/condición.
      1. Si transfecta un solo plásmido con una solución de ADN de 100 ng/μL, prepare un tubo con 5 μL de ADN.
      2. Si transfecta dos plásmidos a 100 ng/μL cada uno, prepare dos tubos con 2,5 μL en cada uno, uno para cada plásmido.
2. En un BSC, realice lo siguiente: Por cada tratamiento de transfección de 500 ng (consulte la Tabla de materiales), alícuota 25 μL de OptiMEM en un tubo de 1,5 mL.
   1. Escale esto en consecuencia: para el ejemplo anterior, prepare dos tubos, cada uno con 250 ng de ADN (2,5 μL) y 12,5 μL de OptiMEM.
3. Agregue el volumen requerido de ADN para ese tratamiento al OptiMEM en el tubo.
4. Para cada tubo con 500 ng de ADN y OptiMEM, cree un tubo correspondiente con otros 25 μL de OptiMEM y 1 μL de reactivo de transfección a base de lípidos catiónicos.
   1. Una vez más, estos valores deben escalarse en consecuencia. Para el ejemplo anterior, prepare dos tubos, cada uno con 12,5 μL de OptiMEM y 0,5 μL de reactivo de transfección.
      NOTA: Al escalar los valores, use la masa de ADN agregada, no el volumen requerido para esa cantidad de ADN. Las reacciones con el reactivo de transfección y el ADN se pueden escalar (por ejemplo, si se van a transfectar 5 pocillos con el mismo ADN). Mantenga las mismas proporciones de reactivos, pero escale en consecuencia (p. ej., 1000 ng de ADN: 50 μL de OptiMEM: 2 μL de reactivo de transfección: 50 μL de OptiMEM).

3. Preparación de mPSCs para la transfección

NOTA: Para la transfección inversa, prepare el recipiente de cultivo y pase las mPSC directamente antes de agregar los reactivos de transfección. Para la transfección directa, pase y coloque las células 12-18 h antes de la transfección para permitir que las células se adhieran a la placa.

1. Prepare un recipiente de cultivo celular recubierto de gelatina al 0,2%.
   1. Planifique el número de pocillos necesarios para la transfección (un pocillo de una placa de 24 pocillos por tratamiento/grupo).
   2. Agregue 200 μL de la solución de gelatina al 0,2% a cada uno de los pocillos deseados en la placa de 24 pocillos.
   3. Agite suavemente la placa para esparcir uniformemente la solución, asegurándose de que cubra todo el fondo del pocillo.
   4. Deje que los pocillos se cubran durante un mínimo de 15 minutos a temperatura ambiente.
   5. Con un aspirador de vacío, retire con cuidado los restos de gelatina de los pocillos (incline la placa para asegurarse de eliminar todo el líquido sin raspar la capa de gelatina).
   6. Agregue 0,5 ml de medio NBiL (paso 1.3) a cada pocillo y deje la placa en una incubadora de cultivo de tejidos para que se precaliente.
2. Pasaje mPSCs.
   1. Alícuota 30 mL de medio de lavado (paso 1.5) en un tubo cónico de 50 mL.
   2. Aspire los medios viejos de la placa de cultivo de tejidos de las células madre esencialesm.
      NOTA: Se permiten varias técnicas de aspiración. Cualquiera que sea la técnica elegida, asegúrese de que las células no permanezcan secas durante períodos prolongados (aproximadamente 30 s como máximo).
   3. Agregue la cantidad requerida de medio de separación celular disponible comercialmente (1,5 ml para un plato de 10 cm, escale en consecuencia, consulte la tabla de materiales).
   4. Espere de 3 a 5 minutos antes de pipetear hacia arriba y hacia abajo 15-20 veces con una pipeta P1000 para obtener una suspensión de una sola célula. Observe las células bajo un microscopio para garantizar una suspensión de una sola célula.
   5. Transfiera las células del medio de separación al tubo de 50 ml que contiene el medio de lavado.
   6. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Aspire los medios de lavado, asegurándose de que no quede líquido residual en el tubo.
   7. Vuelva a suspender el gránulo en un pequeño volumen de medios de lavado (~300 μL). Cuente la suspensión celular con un hemocitómetro para obtener la densidad celular.

4. Transfección inversa de mPSCs

1. Prepare los reactivos de politransfección de acuerdo con el paso 2.
2. Prepare el recipiente de cultivo celular y las mPSC de paso de acuerdo con el paso 3.
3. Alícuota de 200 μL de medio NBiL a tubos de 1,5 mL, uno para cada tratamiento.
4. Añadir 26 μL de la mezcla de reactivos de transfección OptiMEM:a la mezcla de ADN:OptiMEM. Mezcle los reactivos rápida y vigorosamente pipeteando aproximadamente 10 veces. Deje que la mezcla se incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
5. En función de la densidad celular, transfiera el volumen requerido de células de la suspensión celular de 300 μL a los tubos NBiL de 200 μL para obtener 25.000 células por tubo.
6. Después de 5 minutos de incubación de la mezcla de Lipofectamine 2000 (L2K, reactivo de transfección) y ADN, agréguela al tubo de células de 1,5 ml y mezcle bien mediante pipeteo. Deje que las células se incuben con el reactivo durante 5 minutos a temperatura ambiente.
7. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Pipetear el líquido, dejando aproximadamente 50 μL.
8. Vuelva a suspender el gránulo celular con 100 μL de medio NBiL. Transfiera las células a la placa y colóquela en la incubadora. Cambie el medio 24 h más tarde con un nuevo medio NBiL.

5. Transfección directa de mPSC

1. 12-18 h antes de la transfección, prepare el recipiente de cultivo celular y las mPSC de paso de acuerdo con el paso 3.
2. En función de la densidad celular, transfiera el volumen requerido de células de la mezcla de células de 300 μL a la siembra de 25.000 células por pocillo. Coloque la placa en la incubadora.
3. 1 h antes de la transfección, aspire el medio de todos los pocillos y reemplácelo con 0,5 ml de medio NBiL. Coloque la placa en la incubadora.
4. En el momento de la transfección, prepare los reactivos de politransfección mPSC de acuerdo con el paso 2.
5. Añadir 26 μL de la mezcla de reactivos de transfección OptiMEM:a la mezcla de ADN:OptiMEM. Mezcle los reactivos rápida y vigorosamente pipeteando aproximadamente 10 veces. Deje que la mezcla combinada se incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
6. Agregue la mezcla combinada a los pocillos gota a gota. Coloque la placa en la incubadora. Cambie el medio 24 h después.

6. Citometría de flujo

1. Aspire el medio de la placa transfectada de 24 pocillos 48 h después de la transfección.
2. Añadir 200 μL de tripsina a cada pocillo, agitar e incubar durante 30 s a 37 °C. Golpee los lados de la placa y agregue 200 μL de tampón FACS helado (2% de FBS en PBS).
3. Abra y etiquete una placa de 96 pocillos con fondo en V, a partir de A1. Mezcle el contenido de cada pocillo en la placa transfectada para desalojar las células y hacer soluciones unicelulares con una pipeta P200. Transfiera 200 μL de cada pocillo al pocillo apropiado en la placa de 96 pocillos.
4. Agregue 15 ml de tampón FACS a un depósito de reactivo de 50 ml. Centrifugar la placa a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente. Deseche el sobrenadante invirtiendo la placa de 96 pocillos en el fregadero con un movimiento rápido y suave.
5. Utilice una pipeta multicanal para resuspender los gránulos en la placa de 96 pocillos en 150 μl de tampón FACS del depósito de reactivos. Repita los pasos 6.4-6.5 dos veces. Coloque la placa de 96 pocillos en una caja llena de hielo protegida de la luz.
6. Pasar las muestras a través de un citómetro de flujo para obtener las distribuciones poblacionales de los reporteros fluorescentes.
   1. Asegúrese de que el citómetro sea apropiado en términos de combinaciones de láser y filtro para el experimento que se va a realizar (por ejemplo, no utilice un indicador infrarrojo si no es posible excitar o detectar en el espectro rojo lejano).
   2. Incluya muestras adicionales para las perlas de estandarización para permitir la conversión MEFL de los datos durante el análisis. Asegurarse de que se recogen suficientes células por muestra para un análisis estadístico adecuado⁹.
7. Convierta unidades fluorescentes a partir de los archivos de citómetro sin procesar y analice los datos utilizando cualquiera de varios métodos, como canalizaciones basadas en Python o MATLAB o software disponible comercialmente ^9,13.

Resultados

Tanto las transfecciones directas como las inversas se basan en la interacción entre la membrana celular y los complejos de ADN reactivo de transfección entrante, lo que permite la entrega de NA a las células receptoras. Donde estas técnicas difieren es en el estado de la célula en el momento de la entrega: mientras que el ADN se entrega normalmente a las monocapas celulares adherentes en la transfección directa tradicional, la transfección inversa se basa en que el complejo reactivo-ADN se encuentre con las célu...

Discusión

Una razón clave para la adopción generalizada de protocolos de transfección es su reproducibilidad y accesibilidad; Sin embargo, estos protocolos requieren optimización en todos los contextos experimentales. No se mencionó anteriormente la prueba estándar requerida cuando se intenta transfectar una nueva línea celular por primera vez. En primer lugar, la elección del reactivo de transfección es clave, ya que los reactivos disponibles en el mercado no son iguales para todos y variará en la eficiencia de la viabi...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056